细胞毒性和抗血管生成活性Turbinaria这种阿加德和南斑蝶豪克乙醇提取物

摘要

褐藻物种经常被报道为抑制细胞增殖和血管形成的生物活性化合物的潜在来源。因此，本研究旨在确定和比较体外细胞毒活性Turbinaria这种阿加德和南斑蝶Hauck乙醇提取物对抗面包酵母(酿酒酵母酿酒酵母)，并采用瑞蓝素还原试验(RRT)对其进行检测在活的有机体内鸭抗血管生成活性(鸭嘴兽)绒毛尿囊膜（CAM）测定。二者都锦箱龟和澳大利亚紫菜乙醇提取物在IC上表现出细胞毒性活性_50.第530.53页 ppm和528.78 在750名受试者中分别测定了ppm和显著的细胞毒性 ppm和1000 ppm浓度锦箱龟和1000 ppm浓度澳大利亚紫菜.而且，两者都有锦箱龟和澳大利亚紫菜乙醇提取物表现出抗血管生成活性（100％血管抑制），因为两种物种的所有浓度都在处理的所有鸭凸轮样品中引起严重的血管损伤。这些结果显示了这些物种对细胞毒性活性和血管抑制的潜在未来应用。建议使用其他模型系统进行进一步测试。

1.导言

细胞增殖是癌症等疾病进展的一个重要方面[1.]另一方面，血管生成是新血管生长的过程，涉及许多病理和生理情况。抗血管生成治疗已被确定为预防某些疾病的一种策略，并且由于某些病原体的恶化，已经对血管生成抑制剂进行了许多研究众所周知，肿瘤、动脉粥样硬化和糖尿病视网膜病变等血管生成依赖于血管生成表型[2.]．由于它们的抗遗传活性，许多食物化合物已被认为具有人类健康的优势。因此，如棕色大甲状腺动物等食物组分的细胞毒性和抗血管生成活性在现在受到更多的关注[3.]．

大型海藻，也称为海藻，是全球许多地区特别是亚洲国家使用最广泛的功能性食品和草药之一。由于其富含脂类而被称为功能性食品[4.]、矿物[5.]，以及某些营养素[6.]它还含有多种生物活性物质，如多糖[7.]，蛋白质[8.]，以及多酚[9]，具有抗癌的潜在药用价值[10]，炎症[11]，过敏[12]，糖尿病[13]，血栓形成[14]，肥胖[15]，血脂[16)、高血压(17]，以及其他退化性疾病。

褐藻因其潜在的药用价值而被广泛研究。它们被发现具有抗氧化剂[18]，抗糖尿病药[19,20.]，抗炎[21.]，抗病毒的[22.,抗增殖23.]，以及抗凝剂[24.]褐藻之所以被研究是因为它们富含褐藻糖胶和褐藻黄质[25.]．这些化合物经常被报道具有细胞毒性和抗血管生成活性[26.,27.]．马尾藻属物种经常因其抗血管生成活性而被研究[23.,28.,29.].然而，目前正在对其进行收割监管[30.]因此，需要筛选更多种类的褐藻，以了解其细胞毒性和抗血管生成作用。

在海湾城市莱特的沿海地区发现的两种常见的大型褐藻是Turbinaria这种阿加德和南斑蝶就目前所知，这些物种仅被用于抗炎研究[31.,32.]抗菌[33.,34.]因此，本研究探索了这两种褐藻的潜在细胞毒性和抗血管生成活性。

2.材料和方法

2.1.海藻收集

大约100-200 g of锦箱龟和澳大利亚紫菜分别于2017年3月从莱特海湾市Maitum和Punta沿海地区采集。此时，这些海藻物种正处于成熟阶段，且在该地区数量丰富。采集后，用海水彻底清洗海藻，以清除附生植物和其他碎屑[19]然后被带到维萨亚斯州立大学生物科学系的实验室。

2．2.海藻识别

根据Trono[对海藻种类的鉴定是基于对菌体(叶片、固定体等)的形态学分析。35.]随后，维萨亚斯州立大学热带生态与环境管理研究所和生物科学系的Humberto R.Montes，Jr.博士和Julissa C.Evangelio教授对鉴定进行了验证。凭单标本也存放在VSU植物标本室。

2.3.乙醇提取和浓度制备

在实验室中，用自来水冲洗干净的海藻以去除多余的盐，然后在50°C下烤箱干燥36–72小时 h[19]．使用砂浆和杵将干燥的样品粉碎。将十克（10g）的粉末样品浸泡在100ml 100％乙醇中24小时，并使用滤纸（Whatman号，Sigma-Aldrich Inc.）过滤。使用旋转蒸发器（RV10，IKA）将滤液（粗乙醇级分）在40-50℃下浓缩[36.]1000美元 通过溶解0.1%来制备ppm储备溶液 100克提取物 毫升无菌蒸馏水。浓度为750 百万分之500 百万分之250 ppm和100 然后从该溶液中制备ppm。

2.4.细胞毒性试验

细胞毒性锦箱龟和澳大利亚紫菜按照Tualla和Bitacura的方法，通过瑞苏林还原试验（RRT）对提取物进行分析[37.]稍加修改。本试验基于活细胞将蓝色瑞苏林还原为粉红色瑞苏林的能力。试验中包括的处理为不同浓度的锦箱龟和澳大利亚紫菜ethanolic提取物。对照设置以蒸馏水为阴性对照，0.1 M CdCl为阴性对照_2.作为正控制。将1.5克(1.5克)面包酵母溶于40毫升无菌蒸馏水中活化。然后将这种混合物以1:10 0的比例稀释。50毫升(50μL)移液至96孔无菌微孔板中，重复3次。然后,50μ加入各处理的L，孵育1小时。然后,10μ从阴性对照开始，到阳性对照，向孔中加入L的雷蓝蛋白溶液。12 h后，在维萨亚斯州立大学国家椰子研究中心(NCRC)实验室，使用microplate reader (Heales 580 MB, Shenzhen Heales Technology Development Co.)在630 nm处，观察不同处理的颜色变化和吸光度。各处理的细胞毒性%计算公式如下[38.]:

2.5.抗血管生成试验

使用绒毛尿囊膜（CAM）分析来确定治疗的抗血管生成活性。该试验根据Gururaj等人的方法进行[39.]经过修改。受精鸭蛋从位于莱特贝湾马甘汉市Brgy的一家商业供应商处获得。第0天的蛋（3个重复）放置在莱特贝湾维萨亚斯州立大学动物科学系37°C的培养箱中。

孵育第五天，将鸡蛋进行烛光检查，以确定鸡蛋的活力和胚胎的位置。气囊外的蛋壳中心用0.1%苯扎溴铵消毒，用无菌棉擦拭其表面。A 10 在钝端（空气空间）轻轻钻取直径为mm的窗口使用无菌解剖针对卵子进行解剖。在CAM附近添加两滴10%NaCl溶液，以润湿内壳膜，从而轻松将膜与CAM分离。使用镊子夹紧和提升后，膜与CAM分离，无需用力。1 将直径为厘米的滤纸在膜上切片，以暴露血管区。直径为7厘米的无菌滤纸盘 mm分别加载了5 μL海藻乙醇提取物和无菌蒸馏水（阴性对照）。它们直接粘附在血管密度合适的血管区[40,41.].接种的凸轮用3 × 3.无菌塑料，并返回到培养箱，并允许进一步发展[28.]．24小时后，重新打开鸡蛋。

视觉评估CAM区域是否存在血管损伤。观察代表性区域或分形段，并进行光记录。使用Raga等人的CAM评分指南对CAM进行评分[42.]稍加修改，最高分为6分，最低分为0分。CAM分数设置如下：（6）严重的血管完全受损，不再可见，（5）中度以上的血管受损，（4）轻度受损，不到一半的血管受损，（3）最小的小部分受损，（2）出血，毛细血管血流增加，（1）鬼影血管毛细血管已经没有血流，（0）完全没有作用。任何对血管系统的损伤和对正常血流的阻碍都被认为是积极的抗血管生成作用。使用以下公式计算血管抑制（VI）：

2.6.实验设计和分析

本研究采用完全随机设计(CRD)。采用单因素方差分析(ANOVA)确定处理之间的显著差异。在Tukey的HSD之后，使用事后比较来聚类各种处理。结果被认为是显著的 .表示平均值±SE。

3.结果和讨论

RRT的结果显示：锦箱龟和澳大利亚紫菜乙醇提取物具有抗酵母细胞的细胞毒性活性（图1.（a） 及1.（b） ）。如图所示1.（b） 在大多数浓度的海藻提取物处理后，细胞的颜色没有变化，就像0.1处理的细胞一样 M CdCl_2.（阳性对照）。这种细胞毒性作用仅归因于海藻提取物，因为用于制备不同浓度（阴性对照）的溶剂对处理过的细胞没有细胞毒性。

由于不同处理的颜色差异明显，因此决定通过630处的吸光度来量化处理的细胞毒性百分比 这量化了处理孔中存在的resazurin的量。这意味着当酵母细胞存活时，它们将能够将蓝色resazurin还原为粉红色Resasurin，从而在630处获得低吸光度 另一方面，当处理有毒时，酵母细胞将瑞苏林还原为瑞苏芬的能力较低，在630处具有较高的吸光度 nm.分析显示，1000个细胞具有较强的细胞毒性活性 ppm和750 ppm锦箱龟和1000 ppm澳大利亚紫菜乙醇提取物（图1.（一种））。这些是对阴性对照显示出高度显着差异的治疗，并且对阳性对照没有显着差异。

此外，为了比较两种大型褐藻的细胞毒性，它们的浓度可以杀死50%的处理过的细胞（IC）_50.)确定(图2.).IC_50.价值锦箱龟和澳大利亚紫菜在530.53处测定酵母细胞上的 ppm和528.78 分别为ppm。IC较低_50.值表示海藻乙醇提取物对酵母细胞的高细胞毒性_50.植物乙醇提取物的价值澳大利亚紫菜和锦箱龟非常纤细，这可能意味着它们的细胞毒活性没有任何差别。

此外，CAM分析结果显示，两种海藻乙醇提取物的所有浓度都有100%的血管抑制作用。这些结果与仅用无菌蒸馏水处理的结果（阴性对照）显著不同。这意味着不同浓度海藻的抗血管生成活性仅归因于提取物，而非所用溶剂（表1）1.)然而，我们相信，如果CAM的提取物浓度低得多，则可以观察到抗血管生成活性的趋势。

观察到用无菌蒸馏水（阴性对照）处理CAM血管对血管没有影响或任何损伤（图3（a）)，因此得分为0(表1.)。另一方面，血管严重受损，给药24小时后不再可见锦箱龟和澳大利亚紫菜所有浓度的乙醇提取物（图3（b）)，因此获得6分（表1）1.)这意味着这两种海藻的乙醇提取物都具有抗血管生成活性，但由于其作用在所有浓度下都是一致的，因此没有进行详细的比较。在CAM中，分别对促进剂或抑制剂的血管生成反应和血管抑制反应都是显而易见的。当将血管生成物质给予CAM，植入物周围的血管密度明显增加。另一方面，将抗血管生成物质注入CAM会使植入物周围的血管密度降低，最终这些血管消失[43.]．

细胞毒性和抗血管生成活性锦箱龟和澳大利亚紫菜可能是由于酚类化合物，岩藻红素和岩藻糖胶的存在，在这些棕色大型藻类物种中，正如先前报道的那样[44.,45.]酚类化合物具有抗氧化性能，这对于对抗氧化应激影响的癌症发展的影响非常重要，包括DNA突变引起的恶性转化。Namvar等人[23.]据报道，褐藻的细胞毒性活性与其总酚含量呈正相关。

另一方面，岩藻红素是一种具有抗癌活性的天然色素[46.]其他研究报告了岩藻黄质的自由基清除活性，这可能是其细胞毒性作用的潜在机制[46.].和体外和在活的有机体内由Kim和他的同事进行的研究[47.据表明，岩藻素显示出对B16F10细胞肿瘤生长的抑制作用。另一项研究表明，由于其对肝脏肿瘤的抑制作用呈现，岩豆天黄素具有细胞毒性效应和强的抗肿瘤潜力[48.]Sugawara等人[29.]也有报道称，从褐藻中提取的岩藻黄质通过抑制脐静脉内皮细胞的导管形成而具有抗血管生成的特性。

此外，岩藻糖胶因其抑制肿瘤形成和转移的能力而不断被报道[49.,50.].对Koyanagi等人的研究[51.]显示岩藻多糖对人脐静脉管的形成有很强的抑制作用，而另一项研究显示对人子宫癌HeLa细胞有显著的抗血管生成作用，这表明岩藻多糖的抗血管生成作用可能至少部分是由其抗氧化作用所解释的[52.]然而，Liu等人进行的一项研究[53.]显示岩藻糖胶来自Undaria pinnatifida，也是一种大型褐藻，对细胞增殖和迁移以及血管网络的形成具有抑制作用，并且它还降低血管的生长和VEGF-a血管生成因子的表达。

岩藻黄质与岩藻糖胶类似，并不均匀，其结构在分离的物种来源上高度不同；因此，不同种类的褐藻表现出不同的细胞毒性和抗血管生成活性[21.,46.,54.]例如，一项研究表明锦箱龟具有清除自由基的能力，因为多酚(岩藻聚糖和岩藻黄素)含量高[55.，同时研究澳大利亚紫菜还揭示了海藻的抗氧化活性，这归因于存在不同的次生代谢物，如酚类化合物和类胡萝卜素，进一步表明其机制可能是由于其个人或集体参与[56.]．

对使用不同极性溶剂提取的大型海藻进行的其他细胞毒性研究表明，海藻提取物对细胞系具有不同的细胞毒性活性[57.]揭示了阿尔瓦雷齐卡帕鱼和麒麟菜具有较强的抑制浓度，为42.62 ppm和44.12 分别针对人类癌症细胞系的ppm。Spavieri等人的另一项研究[58.]显示出活性细胞毒性西力克海棠和分岔双孢菌在…上布氏锥虫用IC._50.1.2和1.9的值 μ从大型褐藻的提取物中观察到相同的细胞毒性活性差异。这进一步表明海藻提取物对不同细胞系或模式生物的抑制浓度也不同。

4.结论

海洋一直被认为是具有新结构和生物活性化合物的丰富来源。从海洋生物中分离出的生物活性分子已被用于制药、营养补充剂、化妆品、农药、分子探针和酶等领域。这项研究同样表明锦箱龟和澳大利亚紫菜乙醇提取物具有细胞毒性和抗血管生成的特性锦箱龟和澳大利亚紫菜乙醇提取物在抑制细胞增殖和血管形成方面具有潜在的应用前景。但是，建议测试较低浓度的提取物以获得IC_50.对于其抗血管生成活性，也建议在进一步研究中使用其他溶剂、试验（即MTT试验）和其他模型系统（即大鼠主动脉）。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应作者处获得。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者感谢Ivan Patrick B. Tualla先生给予Resazurin，聘请Resayas州立大学热带生态和环境管理研究所亨伯托R. Montes博士，验证海藻物种鉴定也向Ris Menoel R. Modina先生，Julissah C. Evangelio教授，博览会议员州立大学生物科学系博士博士博士博士博士博士博士博士博士，为伊德纳博士博士教授西亚塞维斯科学系科斯蒂·努比斯（TessieNuñez）塔耶州立大学全国亚马卡研究中心允许使用实验室设施。

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