前瞻性评估未加工的芯针吸活组织检查DNA和RNA收益率从肺、肝脏和肾肿瘤:对癌症基因组学的影响

文摘

上下文。针对针活检越来越为癌症的遗传特性。而核心活检针的核酸含量标准病理处理后(即,formalin fixation and paraffin embedding (FFPE)) has been previously reported, little is known about the potential yield for molecular analysis at the time of biopsy sample acquisition.目标。我们的目标是提高DNA和RNA的理解收益率从常用的样品前处理核心穿刺活检技术。方法。我们执行552体外18和20 g核心活检在肺,肝脏和肾脏。DNA和RNA提取的用来进行核心样品和量化统计比较基于针规、活组织检查网站,和组织类型。结果。平均肿瘤DNA产量从所有18 g和20 g样本5880 ng和2710 ng,分别。平均肿瘤RNA收益率从所有18 g和20 g样本1100 ng和230 ng,分别。广泛的DNA和RNA数量(ng 1060 - 13390和370 - 6280 ng,分别)。平均DNA和RNA的收益率从18 g针明显高于20 g针头在所有器官( )。结论。核心穿刺活检技术对癌症诊断产生广泛的DNA和RNA分子病理学,尽管数量大于所报告FFPE加工材料。自non-formalin-fixed DNA是有利的分子研究工作流优化芯针吸活组织检查产生分子特征应该探索。

1。介绍

导航下固体肿瘤针活检经常是现代癌症护理的起点。基因上的能力描述肿瘤已经放大组织切片的重要性对于癌症的治疗选择,确定合格的临床试验和理解疾病进展。近年来,轻快的步伐发现揭示恶性转变授权肿瘤学家的遗传基础,使治疗针对特定分子畸变(1- - - - - -3]。针活检可以提供材料目标基因突变分析或评估对治疗的反应,无需手术活检。

高质量、高价值活检现在由足够的癌症诊断和基因分析多孔性(4]。当代靶向活检诊断率很高,但程序实践指南一直缓慢考虑额外的采样需求相关的分子表征(5]。实时CT、超声或成像制导技术使更精确的经皮先生抽样较小的目标(6]。然而,遗传物质的量,可以获得小肿瘤不易定义是由于许多因素影响活检收益,包括正常组织与实体瘤细胞结构和可变密度肿瘤细胞核的体积的组织。此外,单活检可能不充分描绘瘤内遗传异质性(7]。

脱氧核糖核酸和核糖核酸(RNA)所需数量的结合常规临床护理,临床试验,研究协议由个别机构和临床团队经常变动。数量足够的分析也将变化与分子测试数量和范围的增加和技术的进步组织分析。此外,几个preanalytic因素与肿瘤相关的分析测序DNA和RNA担忧低收益率从肿瘤经皮活检8,9]。

重要的是,在病理学实验室标准核心活检处理包括福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)。所有下游分子诊断和化验一般进行准备的薄片切片法从FFPE组织块。迄今为止,大多数研究DNA和RNA含量分析了核心活检从FFPE材料,而大量的核酸在未经加工的核心活检并不完善。本研究的目的是评估获得的DNA和RNA数量使用广泛使用的核心活检技术从不同的癌症类型,以便规划和决策对分子肿瘤学测试。穿刺活检取样功能的知识可以为病人基本管理设置的已知或疑似癌症。病人和卫生保健提供者,定量数据计划的预期价值针活检是一个更好的理解的潜在风险和临床效益10- - - - - -12]。

2。材料和方法

我们执行一个机构审查委员会批准了前瞻性研究手术切除标本的综合癌症中心的豁免知情同意。下活检是在组织采购服务设施直接可视化手术切除后2小时内使用18-gauge (18 g)和20量度(20 g)核心活检针(Temno进化,CareFusion沃基根,IL)。每个手术标本第一次解剖允许直接可视化的肿瘤和周围的正常组织。活检获得从不同的位置在正常的薄壁组织和肿瘤,避免可见坏死区域,每个2厘米长的核心取样针盘是视觉检查。核心标本没有填补至少85%的抽样托盘被丢弃。活检是一式三份使用18 g和20 g针头DNA和RNA加工。活检样本大小的估计基于所需的样本数量达到统计学意义从初步肾脏活检队列。每个标本立即被放置在一个1.7毫升埃普多夫管,在液态氮冷冻。样品被存储在一个−80°C冷冻,直到分子进行了提取。

2.1。DNA提取

DNA提取使用标准协议(DNeasy、试剂盒、Venlo、荷兰)4μ孵化后立即l核糖核酸酶补充道。50μ10 nM Tris-Cl l和0.5毫米EDTA缓冲区(AE, pH值9.0)是用于洗脱步骤。

2.2。RNA提取

RNA提取RNase-free环境根据标准产品协议(RNeasy试剂盒)。所有在提取RNA样本保存在干冰。组织细胞溶解使用1.4毫米陶瓷球(赖氨酸矩阵D, MP生物医学,梭伦,OH)在组织均质器(MP生物医学快速准备24日)和650年μl裂解缓冲(RLT缓冲区,试剂盒)的列DNase消化之前RNA净化。30μl RNase-free水是用来洗提所有样本。

2.3。定量测量

DNA和RNA数量(总DNA和RNA)计算浓度乘以体积。使用分光光度计测量浓度(Nanodrop 2000,热科学)。如果吸光度的测量比260:280还不到1.6 1.8 DNA或RNA,样本在色谱上运行一个额外的时间列提取协议直到纯度在到达阈值。

2.4。统计分析

每个肿瘤的三个重复观测样本后被平均到一个观察进行分析研究的变化重复观测使用描述性统计和图形显示。箱形图的平均数据为每个肿瘤生成单独的RNA和DNA和针规(18 g和20 g)和组织类型(正常和肿瘤)。对比组织类型和针规,Wilcoxon符号秩检验使用成对的数据。器官网站之间进行对比(肺和肝脏和肾脏),克鲁斯卡尔-沃利斯排名和测试应用。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。进行了分析使用R软件版本3.1.0 (R核心开发团队,维也纳,奥地利)。

2.5。结果

从46 552体外活检手术切除肺( ),肝脏( ),和肾脏( )标本进行。表1表明活检获得的数量从每个器官和最后病理诊断为每个肿瘤类型。量化产生的器官,针规、和组织类型(正常和肿瘤)提供DNA和RNA的表2和3,分别。

2.6。DNA产量

网站,汇集所有器官中DNA产量较大的18 g活检针也显著大于( )比从20 g针头在肿瘤和正常组织样本。DNA量中值更大的肺肿瘤样本与正常肺组织(18 g活检, ;20 g活检, )。没有统计学差异DNA来自正常与肿瘤组织中值肝脏或肾脏。对于所有癌症类型抽样,从单针通过获得的DNA量中值18 g和5880 g核心活检是ng(范围1060 - 13390 ng)和2710 ng(范围370 - 6280 ng),分别。箱形图在图1描述中DNA含量以及四分位范围为每个组织类型和活检针规。

2.7。RNA产生

中位数RNA收益率从18 g针也显著更大( )比从20 g活检肿瘤和正常样本汇集所有器官。RNA量中值更大的肺肿瘤组织相比,良性的组织从肺部18 g和20 g (18 g活检( )和20 g活检( ),分别)和肝脏( 和 ,),但不是从肾脏。中位数RNA数量从18 g和20 g肿瘤活检是1100 ng(范围110 - 17210 ng)和230 ng(范围60 - 5210 ng),分别。箱形图在图2描述中RNA数量按照针规和组织类型和四分位范围。

3所示。讨论

近年来,癌症基因技术等新一代测序(上天)已经进化,提供见解,超越了传统的病理或影像学诊断(13]。更加强调分子特征凸显了目标的作用在肿瘤组织切片,现在经常获得个性化的治疗计划和相关研究的临床试验。对突变基因测序分析可以为实体肿瘤特别具有挑战性的福尔马林固定液可以破坏DNA完整性(14]。作为核酸收益率不是枚举活检时,即使现场执行细胞病理学检查,很难确定是否取得足够的遗传物质(15]。

而肿瘤异质性、细胞结构和尺寸以及其他preanalytic参数和因素会影响下游分析成功,重要的信息可以从研究中获得DNA和RNA产生使用标准化的体外条件(16,17]。值得注意的是,一个以前的研究集中于肺肿瘤核心活检报告无统计差异在体内和体外核群内酸产量相同的肿瘤类型(17]。这些作者还试图预测收益率从核心活检组织用针不同的仪表与多元回归在临床实践中使用。适度强劲计算采样体积和核酸产量之间的相关性观察,尽管分析仅限于肺肿瘤和相对较少的活检样本。在这项研究中,我们检查了更多的初级和肺转移性肿瘤活组织检查,肝脏,肾脏,增加我们的发现的潜在的普遍性。

只有在肺、肝脏或肾脏,我们观察一个统计上的显著差异DNA量获得正常的薄壁组织和肿瘤组织。在这种情况下,细胞密度增加,尤其是相对于一般充气肺组织,和更高的核胞质比率可能占更高数量的遗传物质在肺肿瘤样本与正常肺充气18,19]。RNA差异中观察到肝脏和肺而不是观察到肾脏。先前的研究也报道在初选RNA含量之间没有区别肾恶性肿瘤和正常肾实质(20.]。

类似于其他的研究,我们发现大18 g针获得双重的DNA和五倍更多RNA平均20 g针相比,表明额外的针通过可能需要使用smaller-gauge针时获得足够的遗传物质。可观的收益率方差的临床意义不应最小化然而,作为线性模型尚未在临床实践验证,和小20 g针头可以有效地揭示临床上有意义的突变在肺肿瘤17,21]。基于我们的研究结果,认为一个额外的大量核心针通过将保证抽样充足率可能导致核酸分析失败。在实际实践中,经皮活检指征,方法,技术必须考虑以最小化程序发病率和最大化功效。在最近的荟萃分析,肺活检后并发症的风险与大活检针(22]。最低抽样要求先验知识可以促进活检的可行性的评估,安全,和成功的可能性。特别是,分析研究的数量和类型可以影响活检决定执行更高的并发症发生率与针通过增加和larger-gauge针(10,11]。理想情况下,样本数量将平衡过程的时间和最低的可实现的病人的风险。

本研究的实际意义是最明显的与当代基因测试需求和preanalytic活检样本变异的来源。最低DNA总会在很大程度上取决于临床实验室技术平台,以及浓缩战略和目标数量的基因测试面板。例如,对于捷平台目前使用在我们institution-hybridization捕捉MiSeq Illumina-based MSK-IMPACT试验(23]200 - 250 ng所需的DNA是最优的。DNA量低至10 ng可能成功地分析了使用离子激流(热科学、沃尔瑟姆,MA)平台(8),尽管测序错误可能发生有限的DNA。

活检样本RNA分析是高度依赖于质量、碎片或RNA降解会妨碍突变分析。微阵列技术可以用来分析500 ng的RNA,而上天和放大技术可以大大降低阈值对临床有意义的测序,甚至单细胞水平的遗传物质(24,25]。

假设没有退化,碎片或其他preanalytic中断的活检样本,基于DNA中值内容显示在这项研究中,一个2厘米长18 g或20 g活检应满足大多数当代挥动化验。同样的适用于RNA;然而,在低端的RNA,低至60 ng 20 g核心活检针,一个活检样本可能更容易分析失败。在实践中,样本退化和破坏发生在收购和处理。常规固定方法未能保护核酸和蛋白质的结构组织。即使短期治疗的部分与福尔马林被证明DNA溶解度显著降低。同样,从FFPE RNA提取有用的组织往往是妥协,因为不完全溶解导致可怜的萃取效率。在最近的一项研究中,RNA提取FFPE样本严重退化相比,用来进行样本(26]。在我们的结果中,DNA和RNA产生样品前处理是4-6-fold大于此前报道FFPE细胞块(27]。我们的结果显示未处理的核酸收益率从核心活检,可以冷冻的收购和提交没有FFPE DNA测序。的潜在限制这种方法是直接的分子特征没有病理证实可能导致建设性处理nontumor组织。因此,工作流,增加肿瘤收益率从活组织检查,如射线图像指导确认针位置在肿瘤组织内,可以减轻这种限制。正在进行的研究表明,透射光学光谱成像的新鲜核心样品可以快速描述组织的收购,这可能是用于选择适当的样本为flash冻结之前,分子诊断试剂(28]。

尽管收益率活检报告可以作为参考医生计划或执行分子研究中,必须考虑以下限制在我们的数据的概括性。许多因素可能会减少RNA和DNA的量适合分析在一个小实体瘤活检样本,包括之前的化疗(29日)或肿瘤相关粘连形成(30.,31日]。此外,坏死组织细胞含量较低,可能会影响活检功效,即使不是分子研究计划(32,33]。虽然每个活组织检查视力筛查是一个最小组织样本长度,我们没有检查组织在微观层面对细胞成分。我们选择肿瘤,这足以填补核心穿刺活检取样托盘2厘米。因为随着肿瘤大小与坏死(34),我们不能确定,分子数量报告这里有较大的肿瘤有效。出于同样的原因,根据这些数据,我们无法证明肿瘤小于2厘米将包含更少的遗传物质在线性比例活检样本长度。我们也使用常见spectroscopy-based技术来量化活检样本的分子内容;然而,这些类型的测量会导致高估。精度下降归因于穷人260:280纳米吸收比率和RNA和DNA的交叉污染35]。我们推荐使用DNA或RNA提取协议去除污染物;然而,剩下的污染物会影响产量。最后,由于广泛的变异算子技术影响抽样数量,我们没有研究常见的替代穿刺活检方法如细针穿刺活检。

总之,我们报告一个广泛的核酸量获得核心活检针一般在器官患有原发性或转移性癌症。总的来说,未处理的样品核酸量增加相对于FFPE组织处理;因此,工作流,绕过固定,石蜡基处理可以提高产量和效用的分子诊断的核心针采样。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

早期版本的这项工作是2015年40爵士年度科学会议。

的利益冲突

JCD科学顾问委员会的一员,一个投资者趋近的医疗协会主席介入放射学的基础。SBS是一个顾问/顾问BTG,强生,美敦力公司,XACT, Adgero和一名调查员在通用电气医疗和AngioDynamics。强生公司的他也是一个投资者。JJH卫材Inc . EZ顾问是一个研究员Ethicon美国LLC。所有其他作者没有利益冲突。

确认

这项研究是通过美国国立卫生研究院资助的部分/ NCI癌症中心支持格兰特P30 CA008748。乔安妮的下巴,MFA编辑提供援助,这手稿。

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