植物化学筛选及其生物活性各种×、l .,薰衣草花angustifolia轧机。提取

摘要

本研究旨在对其植物化学成分进行研究各种×、l . (MP)薰衣草花angustifolia轧机。LC-MS法测定了肉桂酸(hca)、咖啡酸(CA)、对茴香酸(CU)、阿魏酸(FE)和迷迭香酸(RS)的含量。此外,在体外抗菌效果对金黄色葡萄球菌采用MTT法检测其对两种癌细胞株(A375和MDA-MB-231)的抗增殖活性。以植物精油提取后的芳香族水为提取介质，含酸/不含酸制备了提取物。结果表明:RS和FE是主要的HCAs化合物;LA中FE含量最高(7.47 mg·g)¹MP中RS含量最高(6.36 mg·g¹d.m.)。关于抗微生物作用金黄色葡萄球菌，两种提取物均对生长速率有模拟作用Staphyloccocus球菌，但有轻微的抑制作用(69.12%)，可归因于酸性环境。在对MDA-MB-231乳腺癌细胞株和A375人黑色素瘤细胞株的生物活性方面，最高使用浓度为150μg·毫升¹，所测提取物抗增殖作用弱。

1.介绍

药用植物的治疗价值是建立在活性植物化合物的化学结构与其对机体活性元素的药效学作用之间的关系之上的。大多数药用植物具有从2-3个化合物到数十个甚至数百个化合物的复杂化学成分，这一事实解释了其多重药效学特性。薰衣草花angustifolia轧机。(LA)和、(MP)是唇形科(Lamiaceae)的两个主要代表，广泛分布在世界各地的自然和培养菌群中，因其已证实的抗菌、抗氧化和抗增殖作用而被用于植物治疗[1- - - - - -4］．在消化和呼吸系统疾病、神经衰弱、超负荷、神经过敏、偏头痛、抑郁、肾脏和肝脏疾病等几种情况下，使用LA制剂治疗是有效果的。LA用于治疗浴，以治疗循环和风湿性问题，也用于解热作用。MP被用作胃肠道感染、消化疾病(肠绞痛、小肠结肠炎和空气中毒)、呼吸系统疾病(支气管炎、喉炎、气管支气管炎和痉挛性咳嗽)、咽炎(止痛)、恶心、神经或精神疲劳和口腔卫生的辅助用药[3.］．

唇形科药用植物所含的多酚类化合物具有抗氧化能力和抗菌作用。在这类植物化学物质中，羟基肉桂酸(HCAs)起着重要的作用，特别是咖啡酸(CA)、对茴香酸(CU)、阿ferulic (FE)和迷迭香酸(RS)，这些化合物具有生物活性，占总多酚化合物的三分之一[5］．这些天然化合物在医学和药学上的重要性是由于它们对过量活性氧(ROS)产生的氧化损伤具有保护作用[1，6］．基于这一假设，对LA和MP提取物中hca含量的测定及其与抑菌和抗增殖活性的相关性，为阐明所研究的药用植物活性原理的作用机制提供了新的研究方向。

以往对LA和MP醇提物抑菌、杀菌作用的研究表明，LA和MP醇提物的抑菌潜力较低金黄色葡萄球菌甚至没有杀菌和抑菌活性[7，8］．据我们所知，以芳烃水为提取介质得到的MP和LA提取物的杀菌活性尚无研究。在利用clevenge装置从LA和MP中提取精油(EOs)的过程中，会释放出大量的芳香族水，可用于提取不同的提取物。

本论文拟完成本领域的前期研究工作，主要包括:(1)采用液相色谱-质谱联用技术对LA和MP芳香提取物的植物化学成分进行hca含量分析;(ii)存在或不存在对金黄色葡萄球菌以及酸性萃取介质对芳香族水提取的LA和MP的影响;(3)在体外所选提取液中发现的主要杂环类化合物的抑菌作用金黄色葡萄球菌，与它们在研究样本中的浓度相关;(iv) MTT法对两种癌细胞系(A375和MDA-MB-231)的抗增殖活性。

2.材料和方法

2．1．提取制备

这些植物是从巴纳特地区当地农民的试验田收获的。种属鉴定已得到蒂米什瓦拉USAMVB药物局的确认，并保留了一份代金券样本。新鲜香草在环境温度下干燥，并使用实验室GM 2000 Retsch Grindomix碾磨机碾磨。从10 g植物根茎中提取精油，加入100 mL芳香水，经水蒸馏法分离得到精油。此外，在提取物中加入苹果醋，直到溶液pH值达到4，产生第二种提取物进行测试。提取过程在环境温度下进行，使用HEIDOLPH PROMAX 1020摇床搅拌6小时。提取液在4°C保存，直到进行植物化学、抗菌和抗增殖分析。无酸的LA和MP提取物用于多酚的LC-MS分析和MTT增殖检测，酸和非酸提取物均用于抗菌检测。

2．2．多酚的LC-MS分析

LC-MS分析采用岛民色谱，配备SPD-10A紫外和LC-MS 2010检测器，EC 150/2 NUCLEODUR C18重力SB 150 × 2 mm × 5μ米列。流动相的色谱条件如下:(A)与甲酸酸化水pH值3和(B)乙腈与甲酸酸化pH值3,梯度程序- 0.01 - 20分钟5% B, B 20.01 -50分钟5 - 40%,5-55分钟,40 - 95% B, B则高达55 - min 95%溶剂流率是0.2毫升/分钟,温度和200°C。监测波长分别为280 nm和320 nm。标定曲线在20-50范围内μg·毫升⁻¹．结果以mg·g表示⁻¹dm。

根据保留时间(tr)和感兴趣离子(M/Z)鉴定化合物为CU (tr 24.4 min, M/Z 163)、FE (tr 24.7 min, M/Z 193)、RO (tr 28.8 min, M/Z 359)和CA (tr 21.9, M/Z 359)。检出限(LOD)为0.5，即信噪比(S/N)≥3时能检出的化合物量μg·毫升⁻¹定量限(LOQ)为0.7，代表S/N≥5的最低浓度μg·毫升⁻¹CA、CU、FE和0.6μg·毫升⁻¹对RS进行双重测定。所用的试剂和溶剂均为分析级化学品。RS、CA、FE标准购自Sigma-Aldrich, CU标准购自Fluka。

2．3.微生物菌种及培养制备

本研究使用的菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 25923，来自巴纳特的罗马尼亚农业科学和兽医大学跨学科研究平台微生物实验室的培养物收集。在实验室中，ATCC菌株保持在−50°C。的金黄色葡萄球菌ATCC 25923在37°C的Brain Heart Infusion (BHI) broth (Oxoid, CM1135)中生长一夜后恢复，随后在BHI琼脂上传代，在37°C下保存24小时。用生理盐水4.5‰稀释，光密度(OD)为0.5麦克法兰标准(1.5 × 10)⁸生/毫升)。1 mL的这种溶液然后悬浮在BHI肉汤1:30。

２.４.抗菌试验

对每种植物的四种提取物进行了试验金黄色葡萄球菌：(我)提取液1制备浓度为100μg·毫升⁻¹以芳香水为萃取介质(2)提取液2的浓度为10μg·毫升⁻¹以芳香水为萃取介质(3)提取液3制备浓度为100μg·毫升⁻¹使用pH为4的芳香水(iv)提取液4制备浓度为100μg·毫升⁻¹使用pH为4的芳香水

1:30的悬挂金黄色葡萄球菌采用96微稀释孔板进行检测。使用Calibra数字852多通道移液器，150μ每孔中放置L悬浮液。提取液直接使用，稀释1:10，放置150μ每个井里都有L。标准(CA、CU、FE和RS)也在浓度为500和50时进行了测试μg·毫升⁻¹，水:96%乙醇(1:1，v/v）.盘子被盖上，放在37°C的温度下过夜;然后在590nm处用ELISA仪(BIORAD PR 1100)测定OD(光密度)。对所有样品进行了三次重复测试。的金黄色葡萄球菌以混悬液为阳性对照，以混悬液与水:乙醇(1:1)混合为阴性对照。

2．5．MTT扩散分析

人类黑色素瘤A375 (;crl - 1619™;MDA-MB-231(人乳腺癌;HTB26™;将ATCC)细胞以6000细胞/孔的细胞密度接种于96孔培养板上，过夜后贴于孔底。24小时后，100μL含Dulbecco 's Modified Eagle 's medium (DMEM;Gibco BRL, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)和50μg·毫升⁻¹和150年μg·毫升⁻¹(溶解于二甲基亚砜(DMSO));加入Sigma-Aldrich公司)，孵育72 h;培养基中添加10%胎牛血清(FCS;PromoCell，海德堡，德国)和1%青霉素/链霉素混合物(Pen/Strep, 10,000 IU/mL;PromoCell,德国海德堡)。然后加入10个细胞进行检测μL (5μg·毫升⁻¹MTT解决方案由MTT为主在体外毒理学检测试剂盒(tox1;Sigma-Aldrich公司)在4小时接触期间。沉淀的晶体溶于100毫升μL裂解液由制造商(Sigma-Aldrich公司)提供。最后，使用microplate reader (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)在570 nm处对还原的MTT进行分光光度分析。所有在体外实验在两个微板上进行，每四个重复的测试物质和对照。

2．6．统计分析

使用Excel软件和Prism软件包(Graph Pad Prism 4.03 for Windows)计算所有重复的平均值和标准差。采用单因素方差分析，然后采用多重比较分析t以及。当值< 0.05。

3.结果和讨论

3．1.多酚含量

对hca进行定量分析得到的结果如图所示1．可见，RS和FE是主要的化合物，其中LA中FE含量最高(7.47 mg·g)⁻¹·dm)， MP中RS含量最高(6.36 mg·g)⁻¹·dm)。MP加氢芳烃提取物中FE含量为2.79 mg·g⁻¹·dm，而LA提取物中RS含量为2.77 mg·g⁻¹dm。在罗马尼亚生长的唇形科植物中鉴定出的主要hca为FE、CU、RS和CA。文献报道的hca含量随基因型、栽培方式和提取方法的不同而不同[6］．总hca(据报道为迷迭香酸/100克干重)在LA中为0.51在MP中为0.80 [9］．

据报道，紫杉醇和铁是LA提取物中多酚成分最丰富的[3.- - - - - -5］．Sytar等人[2]的FE含量为3.328 mg·g¹·dm, 0.005 mg·g⁻¹·dm，而在罗马尼亚栽培的LA, FE含量在0.02-0.04 mg·g之间⁻¹·dm (10， 0.54 mg·g⁻¹·dm在洛杉矶来自捷克共和国[11， 1.31 mg·g⁻¹·dm添加LA和0.50 mg·g⁻¹·塞尔维亚中央邦dm [12］．

其他研究组报道的RS含量为0.05 ~ 0.06 mg·g⁻¹·dm (10， 3.31 mg·g⁻¹·dm, 61.05 mg·g⁻¹·dm (MP) [12］．我们的结果与Vladimir-Knežević等人先前报道的结果一致[12结果表明，MP中RS含量最高，而LA中FE含量最高。

与FE和RS相比，CA和CU的检测量更小(图)1）.CA含量为2.39 mg·g⁻¹·dm, MP, 2.13 mg·g⁻¹·dm, CU含量为0.86 mg·g¹·dm添加LA和0.2 mg·g⁻¹在议员·dm。Vladimir-Knežević等人已报道了与本研究中获得的数据具有可比性的数值[12[CA 2.15 mg·g .⁻¹在议员·dm)。Dvorackova等人获得了较低的LA醇提取物值[11)(0.06 - -0.41毫克·g⁻¹·dm)。统计数据显示，LA和MP种CA含量之间没有显著差异(ns)，但CU、FE和RS浓度之间存在显著差异( ）.

3．2．抗菌活性

数字2显示了LA、MP提取物和对照的光密度(OD)。可以看出，提取物的浓度为10μg·毫升⁻¹和100年μg·毫升⁻¹不抑制发展吗金黄色葡萄球菌．将LA提取物的浓度降低10倍(10μg·毫升⁻¹)导致细菌细胞密度分别由2.085±0.051降低至1.709±0.015,MP提取物由1.806±0.053降低至1.511±0.029。在酸性环境下(萃取物3 ~ 4)，光密度(OD)降低，稀释后的LA萃取物(OD)为0.841±0.21，与对照(0.855±0.142)相比，未抑制LA的微生物活性金黄色葡萄球菌．在MP提取物中，实验变异体1和2的光密度低于LA提取物(2.085±0.051,1.709±0.015)，但实验变异体3和4的光密度优于MP提取物(1.354±0.378,1.190±0.406)。这些数据揭示了这样一个事实，即所获得的提取物对活性有强有力的影响金黄色葡萄球菌．

对照样品的光活性被认为是100%的效价率，与此相比，LA提取物，变异1和2，产生了238.01%和199.8%的有效效应，而MP的百分比增长为128.53%。

在实验变体4中，轻度抑制效应(69.12%)可归因于酸性环境。对照组与LA和MP提取物间无显著差异。我们的研究结果与之前报道的植物提取物有限的抑菌活性一致，包括各种香料,对金黄色葡萄球菌．醇提物的抑菌活性为15.93 - 19.46%，而水提物的抑菌活性较低[13］．

浓度在10到100之间μg·毫升⁻¹，抑制能力上金黄色葡萄球菌是零(13］．Moon等人[7]的研究表明，薰衣草纯露和水提取物不具有任何抑菌活性，而Bayoub等[8报道了LA醇提物对小鼠的抑制作用金黄色葡萄球菌。与水提取物相比，醇提取物，特别是乙醇提取物，可能会减少革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的发展，但没有提到用芳香水提取的提取物的数据。石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取物的抗结核效果较好金黄色葡萄球菌而乙醇和水提取物[14］．需要强调的是，迄今为止所进行的大多数研究都涉及酒精提取物或较少的水提取物[15- - - - - -18，但从植物精油中提取的芳香水提取物的抑菌活性尚未见报道。

鉴于HCs是唇形科植物中主要的活性化合物，FE、CA、CU和RS的作用，在浓度为50μg·毫升⁻¹和500年μg·毫升⁻¹,进行了研究。实验结果如图所示3.．

关于抑制能力金黄色葡萄球菌根据两种不同浓度的hca标准(50μg·毫升⁻¹和500年μg·毫升⁻¹)，如图所示3.光密度(OD)的变化顺序为CU < FE < RS < CA，并受多酚浓度的刺激。以百分数表示，CU除外，浓度为50μg·毫升⁻¹有轻微的抑制作用，增强金黄色葡萄球菌与对照相比，可观察到111.53% - 157.69%之间的变化。

以往的研究已经证明了RS与抗生素的协同作用金黄色葡萄球菌，但最低抑菌浓度(MIC)较高[19］．其他作者强调了hca的抗菌作用金黄色葡萄球菌高浓度时:CA和CU (MIC 125-1000μg·毫升⁻¹)和FE (MIC 500-5000μg·毫升⁻¹) ［20.］．

考虑到浓度在50到500之间的hca的有效作用μg·毫升⁻¹且前期研究显示MIC值较高，天然提取物中活性成分的协同作用可保证抑制效果。

3．3.抗增殖活动

在这两种筛选的细胞系中，MDA-MB-231乳腺癌细胞似乎比A375人类黑色素瘤细胞对测试提取物更敏感。以该细胞株为例，在培养72 h后，在最低浓度(50)下也能检测到效果μg·毫升⁻¹，其抑制率为:薰衣草提取物(LA)为11.53%±9.04%，薄荷提取物(MP)为18.57%±2.32%。浓度为150μg·毫升⁻¹抑制率分别为16.08%±4.67%和46.53%±3.04%。以黑色素瘤细胞为例，测试的最低浓度几乎没有效果。浓度为150μg·毫升⁻¹LA和MP提取物的抑制率分别为14.52%±3.89%和25.08%±8.21%。结果如图所示4．

最近的一项研究分析了提取的挥发油的抗增殖作用薰衣草花angustifolia轧机。对两种人前列腺癌细胞，即PC-3和DU145的抑制作用，并得出结论，精油同时具有这两种作用在体外和在活的有机体内影响(21］．在体外从同一种薰衣草中提取的挥发油对急性淋巴细胞白血病细胞(MOLT-4细胞)具有良好的抗癌特性，而对乳腺癌细胞系(MCF-7)和大细胞肺癌细胞系(NCI-H460)具有中等活性[22］．最近的另一篇论文研究了五种南葡萄牙草本植物的化学成分和生物活性，其中包括一种薰衣草，薰衣草花stoechasl . spp。Luisieri已确定从该植物中提取的提取物对HEP G2和肝癌细胞系具有抗增殖活性[23］．al - ali等人的小组[24的细胞毒性作用各种叶l . Huds。来自沙特阿拉伯的抗乳腺癌细胞系MCF-7。Park等[25]的研究表明，薄荷油中最重要的生物活性成分之一薄荷醇能够增强薄荷油的抗增殖作用α25 (OH)₂D_3.以LNCaP前列腺癌细胞系为例。另一项研究表明，使用MTT分析，乙醇提取物薰衣草花dentata表现出良好的细胞毒活性，IC50值为39μg·毫升⁻¹抗人乳腺腺癌(MCF-7) [26］．

正如结果与讨论中提到的，在最高浓度下，150μg·毫升⁻¹，所测薰衣草和薄荷提取物对MDA-MB-231乳腺癌细胞株和A375人黑色素瘤细胞株均有较弱的抗增殖作用。

4.结论

如上所述，精油工艺中废弃的芳香族水所获得的MP和LA提取物可以作为一种有价值的抗氧化剂来源，以hca为代表，特别是FE和RS酸。

在没有/存在酸环境下获得的提取物的生物学评价突出了对生长速率的模拟作用金黄色葡萄球菌．关于标准品的抗菌活性，HCAs结果表明，这些化合物对抗菌活性没有积极影响。对MDA-MB-231乳腺癌细胞株和A375人黑色素瘤细胞株的抗增殖试验显示其治疗潜力较弱。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了罗马尼亚国家科学研究与创新管理局CNCS/CCCDI-UEFISCDI项目的资助。PN iii - p2 - 2.1。BG-2016-0126，在PNCDI III中，BG-15，标题为“具有抗真菌活性的天然产品”，缩写为PNEA。化学和微生物实验研究在罗马尼亚蒂米什瓦拉Banat农业科学和兽医大学的罗马尼亚国王迈克尔一世跨学科研究平台(PCI)中进行。

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