文摘
患有乳腺癌的发病率口咽癌(HPV + OPC)越来越多,从而为疾病检测和管理提出新的挑战。非侵入性方法涉及刷活检肿瘤病变组织的最近报道的不足在HPV检测+ OPC病人,可能是因为肿瘤起始的网站之间的差异的基础上恢复原状的隐窝和刷地穴面上的活检。我们假设组织学正常的上皮细胞表面的口咽包含核形态的变化,出现由于肿瘤邻近。我们分析了核匹配肿瘤表型,tumor-adjacent正常,侧正常组织活检的九人乳头状瘤病毒+ OPC的病人。测量89核特性被用来训练一个随机与森林有关的分类器区分正常和肿瘤细胞核。然后提取投票分数从训练分类器,分类核在一个连续的范围从0(“常规”)(“肿瘤”)。在每种情况下,相邻的正常细胞核的平均分数是肿瘤和正常侧核之间的中间。这些结果提供证据存在的组织学正常的表型变化,tumor-adjacent表面上皮细胞,这可能是用作HPV + OPC刷biopsy-based生物标志物检测。
1。介绍
信息公开化的口咽癌),包括扁桃体恶性肿瘤,咽后壁,软腭,和舌头基地,进行了流行病学的巨大转变。虽然烟草和酒精头部和颈部癌症的速度下降在北美,患有乳腺癌的发病率OPC (HPV + OPC) 1980年代初以来一直稳步上升,尤其流行在年轻个体(< 60岁)(1]。这些观察强调需要改进的检测和管理疾病的手段。
目前的标准治疗,放化疗治疗(CRT),都有严重的负面影响,急性和慢性(2- - - - - -4]。鉴于年龄相对年轻和高存活率的这一群人,病人常常必须忍受几十年来重大障碍(5]。避免CRT的缺点,经口机器人手术(职权范围),通过口腔肿瘤切除,目前正在调查作为替代治疗方案(6]。然而,为了便于职权范围和规避并发CRT的必要性及其相关的毒性,必须在早期诊断肿瘤(T3或更少)6]。因此,疾病高危人群的筛查方法会增加TORS-eligible病人的数量,从而降低发病率和提高病人的生活质量。
以前的工作试图创建一个非侵入性检查方法,HPV + OPC通过取样口咽上皮细胞通过刷活组织检查和检测HPV16 DNA的存在通过PCR (7]。不幸的是,病毒DNA出现只有一个子集的HPV + OPC病人肿瘤组织是直接访问,而不是在那些疾病没有出席了口咽表面(7]。最可能的解释是,口咽肿瘤经常发起的底部深凹入,或隐窝,而刷样品只有正常上皮细胞表面,不表现出HPV感染(8]。标志物在附近表面上皮肿瘤无创的发展,是一个重要的一步刷biopsy-based筛查的方法检测人乳头状瘤病毒+ OPC。
Malignancy-associated变化(mac)微妙的形态变化,发生在组织学上正常细胞由于其接近肿瘤,可能包括改变大小,形状,和细胞核的染色质结构9]。mac已经被证明是可重复通过图像血细胞计数许多癌症类型,包括肺(10],乳腺癌[11),结肠(12颈),(13,14)和口头(15- - - - - -17癌症,因此他们可能有用的诊断的生物标志物。这里我们使用一个内部成像系统测量> 100每个细胞核核特性的上皮组织样本来自HPV + OPC病人来确定他们的效用作为诊断的生物标志物。
2。材料和方法
2.1。样本来源
9从收集的OPC患者通过头部和颈部肿瘤手术在温哥华总医院作为随机对照试验比较的一部分职权范围辐射治疗早期OPC。使用这个组织是英属哥伦比亚大学的伦理委员会批准(ID #: h15 - 01121)。获得知情同意从每个病人手术前。符合条件的患者肿瘤直径小于4厘米(T1 / T2阶段)和淋巴结转移的< 3厘米的两侧颈部(N0和N1 / N2阶段)。肿瘤活组织检查,包括相邻的组织学正常的表面上皮和侧正常组织的活检则来自于每个病人。病人的人口都包括在表中S1。
2.2。样品制备
Nondiagnostic组织在分子固定剂固定研究病理学家,t·Ng博士,石蜡包埋。Four-micrometer-thick部分被削减,一个子集与苏木精和伊红染色())。这些幻灯片病理学家用来识别三个感兴趣的领域:肿瘤(1),(2)相邻的正常上皮(一个),和(3)侧正常上皮(cln)(图1)。部分立即邻近H&E-stained幻灯片是沾Feulgen-thionin [18),这是DNA的化学计量,和感兴趣的领域在如下所述。
(一)
(b)
2.3。图像血细胞计数
使用半自动的定量成像系统(19,20.]。感兴趣的区域中确定H&E-stained幻灯片在相邻Feulgen-thionin-stained手动划定部分由一位有经验的技术人员。然后成像系统自动定位和集中单个对象,成像,并完好无损、聚焦的图像,或使用一个随机的“垃圾”核与森林有关的算法(如前所述)(17]。核生成的完整宽度上皮被包括在分析中。这一过程的结果是证实了一位有经验的技术人员。600±5海里的照明波长,对应的吸收峰Feulgen-thionin污渍。一个有效像素抽样样本的空间在平面上0.34μ米2和一个有效像素取样面积0.116μ米2被使用。成像系统的特点是符合欧洲社会分析细胞病理学(21]。对于每一个细胞核,相关软件计算> 100功能的大小,形状,DNA量,染色质分布如前所述[22]。特性是高度敏感的染色强度的变化评估我们自己的经验被移除之前最后的分析。
2.4。核的分类
随机森林算法被用来分类内焦距不变核属于侧正常或肿瘤组织。这树分类算法的优势是强大的反对过度拟合(23),已被证明相似的数据集(上表现良好17]。从肿瘤细胞核,侧正常,但不相邻的正常上皮细胞被用来训练分类器。细胞核被随机分成训练(20%)(80%)和测试集。的数量特性所使用的分类器使用10倍交叉验证(表调整1)。五百个随机树生成,二次抽样没有更换。一旦相关的参数调整,模型性能评估测试集上使用一个接受者操作特征(ROC)曲线(24]。
尽管所有核来自正常组织可以被认为是正常的,并不是所有的原子核来源于肿瘤组织可以被认为是不正常的。事实上,肿瘤是由细胞类型的集合,包括基质细胞,淋巴细胞,成纤维细胞,和其他人除了癌症细胞,这些细胞类型的比例随肿瘤。因此,任何核从肿瘤组织列为异常被认为更有可能是来自比正常组织的异常组织。我们只选择那些上皮细胞核来自异常区域的肿瘤组织进行进一步分析。
2.5。大规模的DNA组织(LDO)得分
我们提取投票分数产生的随机森林分类器,我们长期大规模DNA组织(LDO)评分。LDO分数指树木的比例,细胞核归为“常规”,范围从0(所有树木投票“常规”)到1(没有树木投票“常规”)。中间分数代表了表型之间的中间“常规”和“肿瘤”。
2.6。统计分析
统计分析使用R统计软件(版本3.2.5)。随机森林算法实现,参数调优,性能评估使用脱字符号包(25),和ROC曲线生成使用pROC包[26]。箱形图的中心线的盒子代表中间,和盒子代表第25和第75百分位数的限制。上下胡须扩展到5日,第95百分位数。
3所示。结果
共有4830个肿瘤和3352侧正常核被用来训练随机森林分类器。当应用于测试集,该模型显示的ROC曲线下面积0.90。总共1207肿瘤的84.7%和80.8%的837侧正常测试集核被正确分类(表2)。
的例子对侧正常和肿瘤细胞核和价值选择的特性给出了数据2(一个)和2 (b)。十大最重要的特性我们的模型(基于平均精度下降),8代表染色质结构特性,而其余的代表形态和光度特性(表中给出了每个特性的意义S2;有关更多细节,请参见Doudkine et al。22])。所有十个特性之间在统计上显著不同侧正常和肿瘤细胞核(双尾t以及与Benjamini-Hochberg log-10-transformed值修正, )。如果相邻正常上皮细胞不含mac电脑,我们期望,就不会有显著区别对侧正常与相邻正常细胞核的功能。然而,前10名最重要的模型的特性,我们发现四个(fractal1_area, long_runs2 run135_percent, long_runs1)显示一个中间表型之间的侧正常和肿瘤(即。,a statistically significant difference between adjacent normal and contralateral normal, and between adjacent normal and tumor), while three (max_radius, long135_runs, and fractal_dimen) are significantly different from the contralateral normal but not the tumor (ANOVA of log-10-transformed values with Tukey’s post hoc honestly significant difference test, ;图2 (c))。
(一)
(b)
(c)
大规模的DNA组织(LDO)分数的“常规”或“肿瘤”特定的原子核是我们模型的上下文中。LDO的肿瘤的分布和对侧正常样本的测试设置如图3。对侧正常样本是向右倾斜,而肿瘤样本向左倾斜,表明原子核从tumor-derived上皮细胞更可能是不正常的。进一步证明相邻正常上皮细胞包含mac电脑,我们使用我们的模型来计算LDO分数4189侧正常组成的完整的数据集,5192邻近正常,6037肿瘤细胞核从九个病人。如果相邻正常核包含mac,那么LDO分数的分布应该介于侧的正常和肿瘤。为每一个病人,LDO分数分布的均值从侧正常上皮是接近于零(0.16±0.15)和肿瘤接近1(0.88±0.13),正如预期的那样,而相邻的正常核显示一个中间表型(0.49±0.25;图4)。此外,LDO的相邻正常核的分布是统计学上显著不同侧正常和肿瘤的9例(方差分析与图基的事后诚实的显著差异测试, )。这些结果强烈建议mac的存在在组织学检查正常tumor-adjacent上皮细胞核。
4所示。讨论
人乳头状瘤病毒发生率的上升+ OPC带来了新的挑战口咽恶性肿瘤的检测和管理。的相对年轻的年龄和身体健康这一群人,多注意方法,降低了强度的治疗在不牺牲其有效性,从而减少发病率和提高长期病人的生活质量(27]。职权范围实现这个目标是一个有前途的手段,因为它提供了一个替代标准CRT患者早期肿瘤。职权范围也有类似的疾病结果相比,CRT (28- - - - - -30.),但改善功能结果(28- - - - - -35]。重要的是,职权范围被发现导致吞咽困难明显更低的利率需要胃造口术管或气管切开术(28,34),这是最常见的和具有挑战性的并发症与CRT (2,3,34]。引人注目的是,摩尔等人报告保存> 90%的职权范围患者的吞咽功能(28),而CRT后吞咽困难需要胃造口术管的速度接近45% (3,36]。职权范围也倾向于患者得分更高生活质量的相关因素,包括饮食,演讲,和社会,比那些接受辅助放疗或放化疗治疗31日,32,35]。不幸的是,使用职权范围仅限于早期肿瘤患者表现出有限的节点参与(6]。的方法筛查高危个体的数量将增加TORS-eligible病人,这样就避免了需要CRT和改善患者的生活质量。
我们试图确定mac存在于细胞的组织学正常的口咽肿瘤组织存在表面上皮相邻。先前的报道描述mac作为强劲发现早期肿瘤患者在其他器官网站,使他们的理想候选肿瘤早期检测(11,15,37- - - - - -41]。此外,表面上皮细胞很容易通过刷活组织检查,这是一个有吸引力的抽样方法口咽,因为它便宜、快速、安全、无痛、无创。尽管先前的研究已经报道,刷活检一般OPC筛选问题,因为它们不能直接肿瘤样本中出现扁桃体隐窝(7),刷清晰可见和可访问OPC病变的活检报告为HPV检测是有效的(7,42]。进一步,活检刷在相邻的口腔,组织不太复杂,已报告有高灵敏度和特异性检测的DNA异倍体性,核形态标记肿瘤细胞转换(43]。因此,mac的识别表面上皮代表最初的一步的发展刷biopsy-based早期口咽肿瘤高危人群的筛检方法。需要进一步的研究来确定不同的核表型观察到在这项研究中同样可以通过刷活检发现上皮细胞收集。
图像血细胞计数显示大临床承诺和采用的宫颈癌筛查与巨大的成功44]。我们使用图像对侧正常的血细胞计数测量核特性,相邻的正常和肿瘤上皮细胞核确定表型差异。十大最重要的核特性被我们的模型(基于平均精度下降),8个与染色质结构(表有关S1)。染色质的变化被伴随恶性转化和最近被证明影响基因表达45和基因组的稳定性46),这表明染色质重组在肿瘤发生的积极作用。相邻的正常上皮细胞显示值之间的中间侧正常和肿瘤的这些特性,包括fractal1_area(衡量强度对比浓缩和不凝结的染色质,从而揭示异染色质和常染色质的组织)和long_runs1(措施核内染色质的随机分布)。值得注意的是,由于对侧正常上皮细胞用于我们的研究从患者获得OPC肿瘤,这些细胞可能也包含mac电脑,但程度较轻,比相邻的正常细胞。mac已经描述的细胞侧肺癌患者的肿瘤(10),证明远程效应是可能的。因此,分析细胞上皮细胞的个体没有癌症需要克服这个问题。
额外的证据存在的mac在邻近正常上皮细胞来自我们的观察,LDO的平均分数之间的相邻正常上皮是中间的为每一个病人检查对侧正常和肿瘤。同样,增生性和轻度或中度的口腔也不典型增生细胞显示平均LDO得分介于正常和肿瘤组织(17]。提高LDO与分子改变如杂合性丢失(47)和与癌症恶化的风险增加有关17,47]。有趣的是,LDO分数的分布的标准差相邻正常细胞核始终高于对侧正常或肿瘤细胞核,暗示更大的异质性在相邻核表型正常的上皮细胞。
即使一个小病人群体,我们提供了强有力的证据表明相邻的整体染色质组织的正常细胞不同于对侧正常和肿瘤。由于相邻的正常和侧正常上皮细胞组织学检查是相同的和来自相同的解剖结构(即。,surface oropharyngeal epithelium), it is reasonable to conclude that the observed differences are due to the differing proximity of each epithelium to the tumor, a finding that conforms to the definition of MACs.
5。结论
Malignancy-associated变化是可靠地检测到在组织学检查正常(正常)口咽上皮细胞位于相邻的肿瘤,可以作为一种无创的检测早期口咽肿瘤。
伦理批准
所有程序中执行研究涉及人类受试者按照道德标准的英属哥伦比亚大学和1964年赫尔辛基宣言》及其后来的修正案。
同意
知情同意是获得所有个体参与者包括在这项研究中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。
确认
这项工作是支持的资金从加拿大卫生研究院的研究(拖把- 133640)、温哥华沿海健康研究所(f15 - 01188),太平洋耳鼻喉科基础上,旋转听力基础,和四年的奖学金授予詹姆斯Jabalee英属哥伦比亚大学的。作者要感谢丁满买有用的讨论。
补充材料
补充表1:它提供了一个概述所有个人的病人人口纳入本研究。补充表2:它提供了一个描述最重要的核模型所定义的特性。(补充材料)