长非编码RNA MIR4697HG促进人类卵巢癌细胞的生长和转移

文摘

卵巢癌是一种全球的三个最常见的妇科恶性肿瘤。从这个恶性肿瘤患者的预后仍然贫困,因为有限的治疗策略。在此,我们研究了长非编码RNA的角色名叫MIR4697宿主基因(MIR4697HG)在卵巢癌细胞的生长和转移。结果表明,MIR4697HG的转录水平的价格相比在癌组织中增加两个相邻的非癌变组织。MIR4697HG卵巢癌细胞系中差异表达,与最高水平OVCAR3和SKOV3细胞。MIR4697HG击倒由特定成分显著抑制细胞增殖和OVCAR3和SKOC3细胞集落形成。卵巢癌的始终,在异种移植模型,MIR4697HG损耗也显著限制肿瘤的体积和重量。此外,MIR4697HG击倒抑制细胞迁移和入侵的能力。入侵的能力被抑制在OVCAR3细胞SKOV3细胞的58%和40%,和迁移能力被抑制在OVCAR3细胞SKOV3细胞的73%和62% MIR4697HG击倒。MIR4697HG击倒还导致减少矩阵metalloprotease-9,磷酸化ERK和磷酸化AKT。 These data suggested that MIR4697HG promoted ovarian cancer growth and metastasis. The aggressive role of MIR4697HG in ovarian cancer may be related to the ERK and AKT signaling pathways.

1。介绍

卵巢癌是三个最常见的妇科恶性肿瘤之一,第三个全球女性最常见的癌症。根据最近的统计,22 280卵巢癌新病例出现在美国,据估计,其中15 500年死于恶性肿瘤(1]。目前,卵巢癌患者有三个主要的治疗选择,即手术、化疗和放疗。不幸的是,大多数病人在手术后复发或对化疗药物产生抗药性2]。患有卵巢癌的预后仍然贫困,因为有限的治疗策略和诊断。据估计,超过70%的病人被诊断出处于高级阶段(1),只有大约30%的患者5年生存率(3]。因此,确定新靶点是紧急为卵巢癌的早期诊断和治疗。

长非编码rna (lncRNAs)广泛存在于真核细胞的细胞核和细胞质。这些rna非蛋白编码和超过200个核苷酸(4,5]。研究方法的不断改进,lncRNAs最近经历了快速扩张的研究和发现。越来越多的研究已经得出结论,lncRNAs与肿瘤密切相关的开发和进展(6]。特别是,几个lncRNAs引起科学家和临床医生的兴趣,因为他们在卵巢癌的特定角色。这些lncRNAs包括段H19 [7- - - - - -9],LSINCT5 [10],XIST [11,12],MALAT-1 [13,14],ANRIL [15]。他们被证明在卵巢癌与各种生物活动有关,包括细胞生长(10,13),转移(13,16细胞衰老(),15),细胞凋亡14,15),和多药耐药性3,17]。所有这些研究表明lncRNAs可能的开发和发展发挥了关键作用卵巢癌。

最近,lncRNA MIR4697宿主基因(MIR4697HG)已被确定是一个关键的竞争内源性RNA(龙头)miRNA-mRNA在肺腺癌18]。使用RNA-seq和miRNA-seq技术,MIR4697HG和另外两个lncRNAs已确定在肺腺癌和差异表达与临床特征(18]。然而,详细MIR4697HG在肺癌和其他实体肿瘤中的作用在很大程度上仍是个未知数。本研究旨在调查MIR4697HG的表达谱和功能作用卵巢癌,因此成为第一个揭开小说的重要作用lncRNA (MIR4697HG)在卵巢癌。

2。材料和方法

2.1。试剂、细胞系,细胞培养

具体成分对MIR4697HG (5′-GTGAGAATCACTCTCCCATGGATCAGTGTGGGCCCTGTCCCTCTTCCCTTTTT-3′)设计并合成了英杰公司(上海,中国)。同步合成负控制成分。主要抗体MMP-9 GAPDH和商业从Abcam购买(中国香港)。抗体ERK的磷酸化EKR (p-ERK),一种蛋白激酶和磷酸化AKT (p-AKT)从细胞信号有限公司(美国纽约)。四个卵巢癌细胞株CoC1 CaoV-3, OVCAR3, SKOV3,从美国购买类型文化集合(美国写明ATCC)和维护在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)(表达载体、钙、美国)补充10%胎牛血清(的边后卫,英杰公司)和100 U /毫升青霉素和链霉素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)。细胞培养在37°C调湿大气中5%的有限公司₂。细胞培养基是每两天更新。

2.2。人体组织和伦理语句

15例卵巢癌组织及其附近非癌变组织收集从病人卵巢切除术在妇科,台州市中心医院。这些病人没有收到化疗或放疗前手术切除。所有病例被诊断出患有卵巢癌的两个独立的病理学家没有任何争议。从每个病人获得书面同意形式。协议使用这些样本为研究目的是台州市中心医院的机构审查委员会批准。

2.3。免疫印迹分析

从转染细胞总蛋白提取。提取蛋白质是量化使用BCA试剂盒(Beyotime,南通,中国)。等量的50 ng蛋白质sds - page凝胶,然后加载到12%之后,被转移到PVDF膜(孔隙大小= 0.45μ米)(美国微孔,Billerica的)。阻塞后5%的脱脂牛奶Tris-based saline-Tween 20 (TBST) 60分钟在室温条件下,膜与相应的抗体主要孵化一夜之间在4°C。膜与TBST之后洗了三遍,进一步孵化与二次抗体室温1小时。增强化学发光(ECL)是用于开发免疫反应性的解决方案。3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)同步检测加载控制。

2.4。RNA分离和定量实时聚合酶链反应(存在)

从人体组织细胞总rna分离和卵巢癌细胞系使用试剂盒试剂(豆类生物有限公司、志贺、日本),然后反向转录成cDNA使用PrimeScript RT大师混合(豆类)根据制造商的指示。qPCR确定MIR4697HG的转录水平和执行GAPDH mRNA使用从Promega SYBR绿色混合工具(美国麦迪逊,WI)根据制造商的协议。的转录水平MIR4697HG当时规范化GAPDH。

2.5。细胞生存能力和集落形成试验

实验之前,和OCVAR3细胞SKOV3细胞稳定耗尽MIR4697HG构造。评估卵巢癌SKOV3细胞和OVCAR3细胞扩散、4500个细胞治疗与特定成分(成分组)或负控制成分(NC组)被播种在96孔板每口井使用细胞计数和细胞生长评估Kit-8 (CCK-8)连续5天根据制造商的指示。对于每一个监控的时间点,10的整除μL CCK-8被添加到每个。在37°C细胞培养另一个2小时。细胞生存能力就决定了检测的吸光度为每组450海里。确定长期MIR4697HG击倒对细胞生长的影响,殖民地的形成进行了分析。简单地说,每在500细胞被镀6-well盘子。细胞被允许种植了两周在殖民地形成与结晶紫染色。彩色殖民地被拍到和手工计算。

2.6。Transwell迁移和入侵检测

Transwell钱伯斯和8μm毛孔得到从康宁公司(美国纽约康宁)。与数控或特定的shRNA转染后,SKOV3细胞和OCVAR3细胞收获,resuspended在100年μL (FBS-free DMEM的初始浓度细胞。细胞被播种到上部腔体24-well板。下室挤满了600μL DMEM包含10%的边后卫。细胞培养另一个12小时。(在实验结束时,细胞的表面下面transwell膜固定有甲醇,与结晶紫染色,然后在100 x光显微镜下拍照放大。每组5字段被随机选中。手动五个字段(细胞数。细胞数量的五个视觉领域平均。transwell入侵检测、膜与50预镀μL的基底膜基质(1:3 PBS拌;BD生物科学,德国海德堡)和上面描述的一样。

2.7。卵巢癌的异种移植模型

卵巢癌的异种移植模型建立了用SKOV3细胞MIR4697HG损耗(shRNA组)(NC组)。简单地说,6周无胸腺的裸体小鼠被随机分配到两组(为每个组)。为每个组的老鼠,转染SKOV3细胞()被注入了右翼。老鼠然后监测肿瘤的生长。肿瘤长度(l)和宽度(W)测量每周两次。和肿瘤体积(电视)计算。通过接种后28天,所有老鼠牺牲和肿瘤的解剖。解剖肿瘤称重和拍照。所有的努力都是尽量减少痛苦。动物实验协议从台州市中心医院伦理委员会批准。

2.8。统计分析

所有数据都表示为偏差(SD)。使用学生的团体之间的差异进行评估以及。的区别被认为具有统计显著性值小于0.05。

3所示。结果

3.1。MIR4697HG调节在卵巢癌组织和卵巢癌细胞系中差异表达

最初,MIR4697HG表达谱的卵巢癌被检查。结果表明,相对转录水平MIR4697HG在卵巢癌组织两次,在匹配相邻的非癌变组织(图1(一))。此外,相对MIR4697HG水平在卵巢癌组织中是6倍的价格相比正常卵巢组织(图1 (b))。因此,MIR4697HG调节在卵巢癌。有趣的是,MIR4697HG四个卵巢癌细胞系中差异表达。OVCAR3细胞表现出MIR4697水平最高,其次是SKOV3细胞。Caov-3和CoC1表示至少MIR4697HG水平(图1 (b))。

3.2。MIR4697HG击倒抑制细胞增殖和SKOV3和OVCAR3细胞集落形成

特定的成分对MIR4697HG被用来稳定耗尽MIR4697HG表达式。转染后负控制(数控)或特定成分进入细胞,细胞表达绿色荧光蛋白的90%,表明成功转染效率(图2(一个))。具体成分也减少了MIR4697HG水平达72% SKOV3细胞和84% OVCAR3细胞(图2 (b))。在成功MIR4697HG损耗SKOV3和OVCAR3细胞,细胞增殖和单独使用潜力进行了评估。细胞生存能力分析表明MIR4697HG击倒SKOV3细胞显著减少细胞增殖率自第四天。第五天,增殖率抑制MIR4697HG击倒(图后大约62%3(一个))。同样,细胞增殖显著抑制约64%与MIR4697HG OVCAR3细胞耗竭(图3 (b))。集落形成试验中,殖民地MIR4697HG击倒后的低视觉观察SKOV3细胞和OVCAR3细胞(图3 (c))。殖民地的计数显示,殖民地MIR4697HG-depleted SKOV3细胞数量显著下降了75%和66% MIR4697HG-depleted OVCAR3细胞(图3 (d))。这些数据表明,MIR4697HG击倒抑制细胞增殖和单独使用卵巢癌细胞的潜能。

3.3。MIR4697HG击倒体内抑制肿瘤的生长

我们建立了一个使用卵巢癌SKOV3细胞异种移植模型(shRNA组)或没有(NC组)MIR4697HG损耗。肿瘤大小是定期监控。平均肿瘤体积的shRNA组小于对照组自接种后13天。28天,肿瘤体积的shRNA组只有77%的对照组(图4(一))。从每个鼠标解剖后的肿瘤,肿瘤大小是视觉shRNA组小于对照组(图4 (b))。一致,平均肿瘤重量的shRNA组显著更少,仅占71%,对照组(图4 (c))。这些数据证实MIR4697HG击倒体内抑制肿瘤的生长。

3.4。MIR4697HG击倒抑制细胞SKOV3细胞和OVCAR3细胞迁移和入侵

随后MIR4697HG击倒对细胞转移的影响评估。图5(一个)表明,在transwell化验、迁移和入侵细胞MIR4697HG击倒后的视觉抑制SKOV3细胞和OVCAR3细胞(图5(一个))。(细胞数。在入侵检测中,只有大约100 MIR4697HG-depleted SKOV3细胞被发现入侵穿过基底膜基质,与近240控制细胞SKOV3细胞(下降58%)。同样,60 MIR4697HG-depleted OVCAR3通过基底膜基质细胞入侵,仅占60%控制OVCAR3细胞(图5 (b))。在细胞迁移试验,迁移能力被发现在SKOV3细胞抑制73%和62% OVCAR3细胞MIR4697HG击倒后(图5 (c))。所有这些观察结果表明MIR4697HG击倒抑制细胞在卵巢癌细胞迁移和入侵的能力。

3.5。MIR4697HG击倒的水平减少矩阵Metalloprotease-9 (MMP-9)磷酸化ERK (p-ERK)和磷酸化AKT (p-AKT) SKOV3细胞

免疫印迹分析进一步表明,在SKOV3细胞MIR4697HG击倒之后,MMP-9的蛋白质含量,肿瘤转移的生物标志物,显著降低了。有趣的是,ERK和AKT的总蛋白质含量保持不变。然而,p-ERK和p-AKT显著降低的水平相比,他们的水平控制细胞(图6)。

4所示。讨论

卵巢癌是一个伟大的全球威胁女性健康。据估计,大约30%的患者有一个5年生存率(3,19]。如此高的死亡率呈现卵巢癌第五实体占所有癌症相关死亡的女性的6% (1]。提高患者的生存率,早期诊断和及时的医疗干预提出了(20.]。早期发现卵巢癌的本地化阶段可以增加大约90%的5年生存率20.]。因此,识别新靶点,可以作为早期诊断的生物标志物和治疗卵巢癌迫在眉睫。

研究人员致力于寻找有效的早期卵巢癌的诊断标志物发现卵巢癌的发展与特定lncRNAs的异常表达有关。本研究调查了新发现的lncRNA的角色,也就是说,MIR4697HG,在卵巢癌细胞的生长和转移。MIR4697HG卵巢癌组织中的表达显著调节。MIR4697HG损耗由特定成分减慢SKOV3细胞和OVCAR3细胞增殖率。单独使用潜力一直MIR4697HG击倒后抑制。卵巢癌的异种移植模型进一步证实MIR4697HG消耗体内抑制肿瘤的生长。所有这些数据建议MIR4697HG在卵巢癌的肿瘤发生的作用。有趣的是,SKOV3和OVCAR3细胞耗尽MIR4697HG表现出更少的迁移和入侵的能力。MMP-9肿瘤远处转移的标志,也减少了MIR4697HG击倒SKOV3细胞,这进一步证实了MIR4697HG-mediated迁移和入侵抑制。总的来说,我们的数据表明,MIR4697HG击倒抑制卵巢癌细胞的生长和转移。

发现MIR4697HG-mediated机制在卵巢癌细胞增殖和转移是有趣的。目前,已经提出的几种机制是lncRNAs的功能角色的基础。这些复杂的机制主要包括表观遗传修饰通过互动与染色质甲基化和泛素化,直接外源dna结合转录因子或形成multimeric转录调节复合物,以及posttranscription监管(拼接、交通、翻译、和信使RNA的降解)(2,21,22]。小说lncRNA, MIR4697HG最初确定的电抗器作为分子海绵microrna功能,从而解放mRNA,最终导致上述的upregulation miRNA-targeted基因(18]。因此,lncRNA-miRNA-mRNA轴可能是至关重要的MIR4697HG在人类肿瘤发生的作用。MIR4697HG击倒后我们的数据进一步表明,SKOV3细胞的水平p-ERK p-AKT显著降低,而总蛋白水平保持不变。ERK / MAPK信号和PI3K / AKT信号广泛涉及促进细胞生长和凋亡的抑制磷酸化酶激活后机械(23- - - - - -25]。的激活ERK和AKT通路诱导细胞生长,刺激Bax-mediated proapoptosis [26]。减少p-ERK和p-AKT MIR4697HG击倒反过来说明MIR4697HG可能调节ERK和一种蛋白激酶信号通路。的龙头、假设,MIR4697HG可能函数作为特定的microrna lncRNA海绵,以这种方式解放关键基因mrna,随后导致ERK和一种蛋白激酶信号通路的激活。如果这种情况是真的,确定具体的microrna情境之下MIR4697HG卵巢癌是非常有趣的。综上所述,MIR4697HG-mediated机制在卵巢癌细胞增殖和转移仍有待发现。需要更多的工作来测试电抗器,假设在卵巢癌。

总之,我们发现小说lncRNA MIR4697HG作为一个关键的中介卵巢癌的肿瘤的生长和转移。MIR4697HG显著调节在卵巢癌组织中。MIR4698HG击倒显著地抑制细胞增殖,单独使用潜力,和能动性。据我们所知,本研究是第一个显示的功能作用和可能机制MIR4697HG实体瘤。我们的数据可以提供证据表明MIR4697HG作为重要的生物标志物早期卵巢癌检测。使用特定的成分或制定新的目标与MIR4697HG可能是有前途的战略的早期治疗这种疾病。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究在浙江医学科学基金会的支持下,中国(Y16H160098)。

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