七氟醚通过SIRT1对LC3去乙酰化诱导自噬改善心肌细胞损伤

摘要

已发现错误折叠和异常蛋白与心肌细胞损伤有关。因此，通过自噬的误折或聚集蛋白的清除增加可能是预防心肌细胞损伤的潜在选择。七氟醚可以通过影响Sirtuin 1-（Sirt1-）介导的自噬来改善心肌细胞损伤。通过肢体缺血再灌注诱导具有心肌细胞损伤的大鼠模型。模型大鼠接受了不同的处理：七氟醚，烟酰胺和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3- mA）。通过SEM观察到自噬。测量SIRT1和微管相关蛋白质1A / 1B-轻链3（LC3）的水平。目前的研究结果表明，肢体缺血再灌注诱导自噬。七氟醚增加了SIRT1的水平，脱乙酰化LC3和进一步增加的自噬率。另一方面，七氟醚抑制自噬和SIRT1和LC3的抑制剂。 Present results demonstrated a novel molecular mechanism by which sevoflurane induced autophagy by increasing the level of SIRT1 and reducing the acetylation of LC3.

1.介绍

肢体缺血是一种严重的动脉阻塞，常考虑手术治疗，包括血管手术、腹主动脉瘤手术、肢体再植、动脉栓塞等。虽然挽救缺血肢体需要恢复血液循环，但大量临床和动物实验表明，严重的肢体缺血再灌注不仅会影响缺血组织的存活和功能，还会引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS) [1]．SIRS影响心脏、肝脏、肺、肾和其他重要器官[2]，这些都可能导致多器官功能障碍综合征(mODS) [3.]．

肢体缺血再灌注损伤虽然有很长的发展历史，但远端器官的分子机制尚不清楚，治疗也十分有限。先前的研究表明，在动物模型中使用乌司他丁降低炎症反应时，肢体缺血再灌注诱导的肺损伤变得严重[4]．已发现麻醉药可影响肢体缺血再灌注损伤[5，尤其是糖尿病和高血压患者。当缺血再灌注损伤严重时，需要进行心肌缺血手术。麻醉可在患者生命危险增加到一定程度时改善预后。因此，了解这类患者的麻醉方式并深入研究其麻醉机制是非常重要的。

与其他麻醉剂相比，七氟醚麻醉效果好，增强了心肌保护[6]．七氟醚通过减少乳酸脱氢酶的活性来改善冠状疾病，并保持心肌细胞的完整超微结构和功能[7]．七氟醚预处理和肢体缺血预处理通过减少缺氧和复氧引起的损伤情况，降低心肌耗氧量，具有类似的保护作用[8]和心肌缺血再灌注细胞凋亡[9]．此外，七氟醚预处理可通过防止重要介质的产生，如肿瘤坏死因子，减少肝损伤[10]．然而，七氟醚对肢体缺血再灌注心肌细胞损伤作用的分子机制尚不清楚。

LC3是唯一被鉴定为自噬体膜的蛋白。LC3信号通路在细胞凋亡产生和细胞自噬中发挥重要作用[11]．有报道称自噬可改善七氟烷对缺血损伤的保护功能[12]．因此，七氟醚对心肌的保护作用可能影响LC3的表达。Sirtuin 1 (SIRT1)酶是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸- (NAD-)依赖蛋白，属于组蛋白脱乙酰酶的第三类，与细胞凋亡相关[13]．缺血再灌注也参与了这些活动，因此七氟醚可能影响疾病中SIRT1的表达。进一步的研究发现SIRT1使内源性LC3去乙酰化诱导自噬[14]．通过研究自噬率，SIRT1水平和LC3的乙酰化，探讨了七氟醚对缺血再灌注诱导损伤的函数的分子机制。

2.材料和方法

2．1．材料

抗sirt1抗体(ab104833)、抗lc3抗体(ab63817)、抗乙酰赖氨酸抗体(ab80178)购自Abcam公司(Abcam上海办事处launch, Shanghai, China)。七氟醚(H20070172)来自上海亨瑞生物医药公司(中国上海)。细胞死亡检测试剂盒(11684817910)来自Roche(印第安纳波利斯，印第安纳州，美国)。3-甲腺嘌呤(M9281)和烟酰胺(N0636)来自Sigma (St. Louis, MO, USA)。

2．2．动物模型建立

选用温州医学院实验动物中心(SCXK (Zhejiang) 2005-0019)的SD大鼠，雄性，8周龄，体重200 g~250 g。大鼠术前禁食12小时，自由饮水。4%水合氯醛6 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。在双侧股三角切开皮肤，分离股动脉。钳夹双侧股动脉缺血4小时，再灌注4小时。成功缺血的特点是背侧和足侧脉搏不明显，脚冷而暗。切口4小时后，从下肢动脉取下夹，血流4小时。动脉脉搏恢复，红脚渐渐暖和起来。

2．3.分组

总共35 SD大鼠肢体缺血再灌注引起的心肌细胞损伤模型(男,8周,体重200克~ 250克)被随机和均匀地分为五组:根据不同的治疗肢体缺血再灌注(IRG),七氟醚(SevG),烟酰胺抑制剂(NG), 3-MA inhibitor-treated集团(MG)和南⁺3-MA抑制剂组(NMG)。同时，7只大鼠进行假手术，不进行冠状动脉缝线收紧手术-假手术组(SG)。取7只大鼠，钳夹股动脉30分钟，再灌注5分钟，重复3次肢体缺血再灌注预处理组(IRPG)(图)1)．每组大鼠用正常的饮食和水喂食7天，NG组和NMG组腹膜内注射10％烟酰胺3ml / kg每日10％烟酰胺3ml / kg，10％3-mA 1.5ml /KG每日和其他群体用3ml / kg盐水溶液处理。在Sevg中，在缺血再灌注模型中使用2.4％的七氟醚。

２.４.苏木精-伊红(H&E)染色

H&E染色是根据之前的一项研究进行的[15]．

2．5．心肌细胞凋亡的TUNEL分析

取大鼠心肌组织(500 mg)。同一专家在亮视野显微镜下采用TUNEL法检测凋亡细胞。从五个不同的区域对不同的样本进行细胞计数。检测试剂盒:POD凋亡检测试剂盒(Roche, USA)，按照说明书使用。胃黏膜石蜡切片经TUNEL染色，镜下放大400倍。

2．6．透射电子显微镜

心肌细胞是通过心室组织的酶消化分离出来的，根据以前的报道，通过密度梯度离心纯化。细胞用5%戊二醛固定，切成小于1的切片μm.所有切片均采用Philips CM120低温电子显微镜观察。

2.7。RNA提取

取大鼠心肌组织(500 mg)， Western blot检测SIRT1和LC3。心肌组织用杵磨机研磨。分离的细胞通过玻璃纤维过滤器快速过滤收集。采用Takara MiniBEST Universal RNA Extraction Kit (Takara, Japan)提取总RNA。

2.8。QRT-PCR.

通过QRT-PCR分析证实SIRT1和LC3的相对mRNA水平，使用GAPDH基因作为负载控制。通过使用Primescript第1链CDNA合成试剂盒（Takara，Japan），RNA被逆转录成cDNA。引物设计如下：SIRT1，正向引物，5'-GTTTTGGGGTCTTCTCTGAA-3'，反向引物，5'-ACATCGCAGTCTCCAAGAAG-3'（140bp）;LC3，前底漆，5'-caaagagtggaagatgtcggctc-3'，反向底漆，5'-aggacgggccagctgcttctc-3'（97 bp）;GAPDH，前底漆，5'-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3'，反向引物，5'-GTTGAACTTGCCGTGGGGTAG-3'（120bp）。通过使用Takara Bio Sybr Green Master混合物进行PCR反应在TPSOO实时PCR检测系统（Takara，Japan）：94°C持续2分钟，45个循环为94°C，20s，53°C为30 s, and 60°C for 30 s. Relative mRNA levels were calculated by 2^-ΔΔt.方法。

2.9。Western印迹分析

用蛋白酶抑制剂混合剂处理心肌细胞，反复冻融裂解。十个μg蛋白用10% SDS-PAGE分离，转移到PVDF膜上。膜被脱脂奶粉堵塞了半小时。将这些膜与SIRT1和LC3的抗体(稀释1:10 00)孵育10小时。采用x线胶片曝光和照相，以GAPDH内控，用Quantity One软件测量SIRT1和LC3的表达。

2.10。Coimmunoprecipitation分析

IRG和SevG的心肌细胞裂解液与抗体和PureProteome Protein A/G Mix磁珠过夜混合。用SDS-PAGE将蛋白分离到PVDF膜上并转移到PVDF膜上。以GAPDH内控，用Quantity One软件测定乙酰化LC3。

2.11。统计分析

ANOVA分析用于通过使用SPSS 20.0（IBM Corporation，Armonk，Ny，USA）来比较不同样本的SIRT1和LC3水平。这值小于0.05则视为显著性。

3.结果

3．1.他染色

SG心肌纤维排列整齐，细胞边界清晰，无或仅有少量心肌间质中性粒细胞渗出细胞(图)2)．IRG组细胞间无明显的细胞边界。心肌细胞颗粒、液泡降解，胞浆稀疏，心肌纤维断裂。心肌纤维中有较多的中性粒细胞和红细胞浸润。相比之下，SevG和IRPG心肌纤维排列整齐。

3．2．细胞凋亡的TUNEL分析

TUNEL分析显示SG组细胞凋亡水平低，IRG组细胞凋亡率最高，IRPG组细胞凋亡率降低，SevG组细胞凋亡率进一步降低(图)3.） ( )．

3．3.七氟醚诱导自噬

目前的研究结果表明，七氟烷增加了数目(图4， a)和直径(图4， b)与IRG相比自噬空泡的变化( )．数量(图4， a)和直径(图4， b) NG、MG和MNG中自噬空泡的含量较低。相比之下，数字(图4， a)和直径(图4， b) SG组自噬空泡含量最低( )．

3．4．SIRT1和LC3的mRNA水平

qRT-PCR结果显示，SIRT1的相对mRNA水平在SG组最低，在SevG组升高至最高，在IRG和IRPG组降低，在MG、NG和MNG组进一步降低( )(图5(一个))．LC3的类似情况和LC3的相对mRNA水平在SG中最低，在SEVG中的最高水平增加，IRG和IRPG中的最高水平降低，并且在MG，NG和MNG组中进一步降低（ )(图5 (b))．

3.5。SIRT1和LC3水平的Western印迹分析

通过测量SIRT1和LC3的变化，分析七氟醚对肢体缺血再灌注心肌细胞损伤的影响。与SG相比，IRG组SIRT1水平升高。与IRG相比，SevG的水平升高( )(图6(一))．与SevG、IRG和IRPG相比，NG、MG和NMG组中SIRT1的表达进一步降低( )．对于LC3，有大约18 kDa (LC3 I)和16 kDa (LC3 II)的波段6 (b))较LC3 II低表达(图6 (c))．LC3 I蛋白水平在SG中最高，MG、NG和MNG中最低( )．与SIRT1表达一样，LC3 II的相对蛋白水平在SG组最低，在SevG组最高，在IRG和IRPG组降低，在MG、NG和MNG组进一步降低( )(图6 (c))．

3.6。七氟烷通过增加SIRT1来降低LC3的乙酰化作用

共免疫沉淀检测SIRT1与LC3的结合情况。目前的研究结果表明，七氟烷增加了SIRT1与LC3之间的结合，而乙酰化LC3则降低了(图)7)．结果表明，七氟醚通过增加SIRT1来降低LC3的乙酰化，从而促进自噬。

4.讨论

结扎开股动脉的方法为建立大鼠缺血再灌注组织模型提供了一种简便的方法。Chen等人利用无创动脉闭塞再灌注建立动物缺血再灌注模型[16]．同时，与对照组相比，凋亡因子BAX在模型中表达上调。本研究还采用此方法建立了大鼠后肢缺血再灌注模型。阻断股动脉后，大鼠足部变冷、发紫，提示成功建立肢体缺血模型。双侧股动脉闭塞再灌注，心肌细胞颗粒变性、空泡变性、骨质疏松，胞浆透明，肌纤维断裂，心肌间质中性粒细胞增多，红细胞浸润(图)2)．在所有模型中均检测到凋亡，并通过七氟烷、SIRT1和自噬抑制剂降低凋亡。凋亡是缺血再灌注模型的一个重要特征[17]．所有结果表明，肢体缺血再灌注成功建立。

缺血再灌注损伤涉及许多因素和过程，一般包括能量代谢[18，过量钙[19，氧自由基[20.和白细胞介导的炎症[21]．肢体长期缺血时，器官会消耗大量ATP，促进黄嘌呤脱氢酶向黄嘌呤氧化酶的转化。肢体缺血后血流量恢复，组织供氧增加，利用更多氧气。因此，黄嘌呤氧化酶的作用会产生大量的氧自由基。它们通过血流转移到远处的组织和器官，除引起肢体缺血再灌注损伤外，还可引起脂质过氧化损伤和细胞凋亡。这样，一些远处的器官受到影响，造成一种间接的损害。

肢体缺血预处理可减轻缺血再灌注损伤，提高缺血耐受性，延缓或减少随后较长时间的缺血再灌注损伤。肢体缺血预处理可促进多种内源性活性物质释放，如腺苷、NO、内啡肽等，抑制中性粒细胞趋化[22，产生超氧阴离子[23]．

SIRT1是依赖于NAD的组蛋白去乙酰化酶。缺血再灌注时，SIRT1可使CL3去乙酰化，增加心肌自噬和凋亡。目前的研究结果表明，使用七氟烷和或预处理后，心肌SIRT1水平升高，导致心肌自噬增加。因此，七氟醚可以减少肢体缺血再灌注造成的损伤，增加心肌的抗氧化能力，抑制炎症反应，通过增加自噬率来保护心肌(图)4)．本研究证实了七氟烷通过增加去乙酰化LC3的水平来增加自噬活性，从而具有心脏保护作用(图)8)．更重要的是，心力衰竭可能与异常的蛋白质聚集有关[24]，增强的自噬水平将显示心脏保护功能，并作为一个动态降解和循环系统，在响应氧化应激时提供生物物质和能量[25]．

本研究存在一定的局限性。蛋白质聚集在本研究中未被证实，该理论是基于以前的报道。抗氧化剂和自噬活性之间的关系没有被测量。具有自噬活性的心肌细胞似乎与具有凋亡过程的心肌细胞有很大的不同，甚至在某些情况下，自噬活性还可以控制细胞凋亡。七氟醚对心肌细胞损伤的保护作用尚需进一步研究，其分子机制有待进一步阐明。

5.结论

肢体缺血再灌注增加大鼠心肌组织SIRT1和LC3表达。七氟醚通过增加SIRT1和去乙酰化LC3浓度，诱导心肌自噬，减轻肢体缺血再灌注损伤。

的利益冲突

作者报告在这项工作中没有利益冲突。

作者的贡献

范丽华和陈德源对这一工作做出了同样的贡献。

致谢

丽水市高层次人才培养项目(no。浙江省医疗卫生平台重点项目(2013RC04);项目编号:2014ZDA031);2014 zdxk06)。

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