甲苯急性毒性对兔脑不同部位的影响

摘要

本研究以兔脑为研究对象，通过组织病理学、免疫组织化学和生化方法研究甲苯对脑的急性期效应。雄性家兔20只，分别作为对照组和实验组。采用神经生长因子(NGF)、肿瘤坏死因子- α (tnf - α)、多巴胺(DA)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测生化损伤的严重程度。在对前额叶皮层、海马、下丘脑、黑质、内嗅皮层的生化评估中发现，大脑中的tnf - α水平明显高于对照组。与对照组相比，甲苯给药组黑质分泌的多巴胺、海马神经元分泌的神经生长因子(NGF)和星形胶质细胞分泌的GFAP水平显著降低()．此外，可见局灶性空泡变性(脓肿形成)、胶质增生、血管周围脱髓鞘、许多固缩细胞和坏死。与对照组相比，甲苯给药组血管明显过度扩张，细胞结构严重变性，细胞边界分散。少突胶质细胞的细胞核结构出现异常畸形。与对照组相比，甲苯给药组海马的顺序神经元体结构明显受损。此外，实验组皮质细胞胞浆表现出严重的免疫反应。

1.介绍

自然界的原油和tolu树中含有甲苯[1]，并通过从原油中分离汽油和其他燃料和燃烧焦炭而挥发[2，3.]．甲苯暴露的主要来源是汽油，它在生产、运输和燃烧过程中被释放到大气中。因此，在炼油厂、加油站周围和交通繁忙的地区发现的甲苯最多。此外，吸烟者暴露在80-100μG的甲苯。此外，含有甲苯的顶级产品有油漆、油漆稀释剂、清漆、虫胶、防锈剂、胶水、溶剂型清洁剂和一些清洁产品。它也用作化妆品中的溶剂，通常用于氯化苄、苯甲酸、苯酚甲酚、乙烯基甲苯、TNT和甲苯二异氰酸酯生产[4，5]．因此，许多人也通过人和动物的饮用水、食物、空气和各种消费品接触到甲苯[1]．

由于甲苯的亲脂性，它可以改变细胞壁的脂质结构并与蛋白质相互作用。在急性剂量下，它通过显著提高Na/ k - atp酶活性来增加膜流动性[6]．它所引起的损害率与剂量-反应关系之间的相关性尚未确定。在接触甲苯的人和动物中，甲苯的首要作用是中枢神经系统的抑制。高剂量甲苯的作用类似于其他挥发性物质，如精神运动损伤、运动活动时的兴奋和随后的抑制、站立反射的丧失和镇静[7- - - - - -9]．甲苯通过影响gaba能、谷氨酸、5 -羟色胺和多巴胺能途径来诱导这些效应[10，11]．甲苯导致小脑和海马的凋亡神经变性[12]．此外，它还会导致小脑和锥体功能障碍、周围神经病变、视神经萎缩、神经性听力损失，以及包括认知功能在内的暂时性和/或永久性损害[7，8]．众所周知，慢性甲苯成瘾会导致脑白质萎缩，并与萎缩的临床结果有关[13]．此外，有报道称甲苯也会损害周围神经[8，14]．

在人类中，在吸入10秒后动脉血中发现甲苯[4]．此外，当通过胃肠道给药时，甲苯在血液中的浓度在1-3小时内达到最大值。与呼吸道相比，它是逐渐被胃肠道吸收的[7]．

甲苯被吸收后，可在脂肪组织(白色脂肪组织和棕色脂肪组织)、胃、肝、肾、骨髓、脑和脾脏中发现，其含量依次递减[4]．在摄入甲苯五小时后，它在脂肪组织中的含量达到最大值。在因吸食胶水而死亡的人的肝脏和大脑中可发现高浓度的甲苯[15]．

前额叶皮层是一些重要的感觉和运动系统之间的反馈周期和连接的区域，这些系统关联和整合了最复杂的行为成分。内嗅皮层是颞叶中在次级联想区和记忆形成中起关键作用的部分。另一方面，海马体是负责将动作转化为行为、记忆和空间导航的区域。黑质位于中脑，负责运动和聚焦，也分泌多巴胺[16]．

因此，在本研究中，我们旨在广泛评估日常生活中常见的物质甲苯对上述大脑区域的实验性急性毒性。

2.材料和方法

这项研究是在Gaziosmanpaşa大学实验医学动物实验地方伦理委员会(HADYEK-51)的许可下启动的。选用成年雄性新西兰兔，体重4 ~ 6 kg。动物(健康，平均年龄24个月)从进行该研究的Gaziosmanpaşa大学实验医学研究实验室获得。将动物分为I组(甲苯给药组，);第二组(对照组，)．ⅰ组给予单剂量甲苯(99.9%溶液，IRMA, Sigma-Aldrich)注射，剂量为876 mg/kg。注射后5小时采集血液样本。分离血清和血浆样品后，离心保存在−80℃冰箱中。采用10 mg/kg氧拉嗪(Ketalar™，Eczacıbaşı，土耳其伊斯坦布尔)和100 mg/kg盐酸氯胺酮(Ketalar, Eczacıbaşı，土耳其伊斯坦布尔)联合麻醉放血对动物实施安乐死。将脑组织从颅腔中取出。每组脑组织随机取10%福尔马林固定3-6小时，脱水，石蜡包埋，5M，苏木精/伊红染色及免疫组化染色。按所述对准备好的玻片进行染色[17]．染色玻片在Olympus BX-50研究显微镜下观察。从动物获得的血清和血浆样本中，采用ELISA法测定神经生长因子(NGF)、肿瘤坏死因子- α (tnf - α)、多巴胺和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)水平[6]．

数值数据用算术均数±标准差(SD)表示。采用SPSS 15.0软件包程序(SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)进行统计评价。各组间差异采用Kruskal-Wallis检验，并与Student检验进行比较以及。的值被认为是重要的。

3.结果

3．1.生化研究

在本研究中，通过ELISA检测发现，与对照组相比，甲苯给药组tnf - α水平显著升高(表)1） ()．

结果显示，与对照组相比，甲苯组的多巴胺(DA)血清水平显著降低()．此外，发现甲苯组海马神经元分泌的神经生长因子(NGF)的水平明显低于对照组()．然而，与对照组相比，甲苯组大脑星形胶质细胞分泌的GFAP显著降低()(表1)．

3.1.1。组织病理学研究

以苏木精-伊红染色玻片观察，对照组脑组织结构正常。在甲苯给药的兔的大脑皮层中发现局灶性空泡变性、胶质增生、血管周围脱髓鞘以及许多固缩细胞和坏死。甲苯暴露组与对照组相比，血管明显过度扩张，细胞代偿严重变性，细胞边界几乎分散。甲苯受体组，少突胶质细胞核结构异常畸形。与对照组相比，服用甲苯的实验组海马的顺序神经元的身体结构明显受损(图)1)．

3.1.2。免疫组织化学结果

本研究通过对两组脑组织切片进行免疫组化染色以确定凋亡状态，采用Bax C3免疫反应性进行评价。通过染色使Bax和C3蛋白显现，对检测反应的密度进行半定量评估。

对照组脑组织切片中脑组织皮层、海马区、内嗅皮层、黑质区细胞胞浆及Bax、C3免疫反应呈阴性(0)。

Bax(3+)和C3的免疫反应性在甲苯给药的兔子的大脑皮层细胞胞浆中显示出显著增加(图2)．

4.讨论和结论

在各种体内研究中，有报道称，在中枢神经系统甲苯相关的毒性损伤中，细胞反应被视为星形胶质细胞的第一明显反应。研究发现甲苯通过增加与GABA受体结合的胆碱能活性表现出神经毒性作用，并对NMDA受体表现出非竞争性拮抗作用[18，19]．在一个服用甲苯10年的患者中，可以看到慢性甲苯使用可能导致髓鞘脱髓鞘和轴突变性[19]．在大鼠中，甲苯导致氧化应激，并通过增加活性氧输出引起神经元损伤和胶质细胞增生。在大鼠的研究中，GFAP也被用于甲苯引起的胶质细胞增生的测定。胶质细胞增生在海马体、皮层和小脑中显著增加[20.，21]．在本研究中，在前额叶皮层、海马、下丘脑、黑质、内嗅皮层的生化评价中，甲苯给药组的tnf - α水平明显高于对照组。与对照组相比，甲苯组血清黑质分泌多巴胺(DA)水平显著降低。研究发现，与对照组相比，甲苯组海马神经元的神经生长因子(NGF)水平显著降低。大脑星形胶质细胞分泌的GFAP水平也被确定下降，与对照组相比，这种差异显著减少()．

当我们评估苏木精-伊红片时，对照组脑组织显示正常结构。然而，在甲苯给药的动物中，大脑皮层可见局灶性空泡变性(脓肿形成)、胶质增生、血管周围脱髓鞘以及许多固缩细胞和坏死。此外，与对照组相比，甲苯给药组血管明显过度扩张，细胞代偿和细胞边界分散严重退化。三甲苯组少突胶质细胞细胞核畸形。与对照组相比，甲苯组海马的顺序神经元的身体结构明显受损。

凋亡是一种程序性的细胞死亡，其特征是细胞质退缩、膜改变和DNA断裂，而不损伤附近的细胞[22]．凋亡途径通常被认为是内在的(线粒体介导)和外在的(受体介导)。线粒体介导的细胞凋亡是由细胞色素C、凋亡诱导因子、Smac/DIABLO等凋亡因子从线粒体膜间隙分泌到胞质引起的。一旦细胞色素C转移到细胞溶胶，由细胞色素C/Apaf-1/ATP/procaspase-9组成的凋亡复合物激活caspase-9，然后激活caspase-3 [23- - - - - -25]．凋亡介质促凋亡蛋白(Bax、Bad和B1d)的升高可促进细胞凋亡，而抗凋亡蛋白(Bcl-2)的升高可通过抑制细胞凋亡而降低细胞凋亡。

一些研究人员报告说，甲苯通过增加氧自由基而引起组织损伤[26，27]．另一种假说认为，甲苯通过改变细胞膜的脂质结构，进而影响Na/ k - atp酶活性，从而增加膜流动性[6]．高剂量甲苯也可影响gaba能、谷氨酸、5 -羟色胺和多巴胺通路[10，11]．然而，最新的研究表明，甲苯增加了组织中的凋亡活性[17，28]．本研究对Bax和C3的免疫反应进行了综述，以期发现细胞凋亡的存在。大脑皮层、海马区、内嗅皮层和黑质区细胞胞浆中Bax和C3的免疫反应均为阴性(0)。相反，甲苯给药后，大脑皮层细胞胞浆中Bax和C3的免疫反应严重增强(+3)。

El-Nabi Kamel和Shehata报告说，脑组织是受甲苯影响最严重的部分。他们表现出caspase-3活性的显著增加，特别是在大脑皮层[29]．已有研究表明，甲苯通过破坏额叶皮层和脑干来增加caspase-3的活性[30.]．[17表明慢性暴露于甲苯可增加Bax的免疫反应性。有研究表明，它可导致暴露于甲苯的大鼠肺、脑和睾丸组织中TUNEL阳性细胞计数显著增加[17，31- - - - - -33]．在我们的研究中，在对照组的大脑皮层、海马区、内嗅皮层和黑质的细胞胞浆中观察到caspase-3的阴性(0)免疫反应。然而，在甲苯给药的兔子中，大脑皮层细胞胞浆caspase-3免疫反应(+++)明显增强，作者指出[17，31- - - - - -33]．

本研究利用生物化学和组织病理学方法，明确了甲苯的主要损伤是星形胶质细胞活化和胶质细胞增生。高水平的促凋亡蛋白Bax和caspase-3，在大脑皮层、海马区、内嗅皮层和黑质组织的甲苯给药表明，即使在3小时左右，甲苯也可能触发细胞凋亡。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

参考文献

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