单细胞测序技术在肿瘤临床治疗和研究申请

文摘

细胞的异质性是许多癌症的一个基本特征。缺乏细胞同质性设计靶向肿瘤治疗造成困难。因此,开发新颖的方法来确定和描述肿瘤细胞的异质性是一个关键的下一步发展的新的癌症疗法。单细胞测序(SCS)技术最近被用于单个细胞的全基因组遗传多态性的分析水平。SCS需要(1)精确孤立的单个细胞感兴趣的;(2)遗传物质的隔离和放大;(3)描述性分析基因组、转录组、和外遗传性数据。除了有针对性分析单细胞分离肿瘤活检,SCS技术可能被应用到循环肿瘤细胞,这可能有助于预测肿瘤的进展和转移。在本文中,我们概述SCS技术和审查当前的文学SCS临床肿瘤学和研究的潜在应用。

1。介绍

细胞的异质性是许多癌症的特点(1,2]。这可能是一个基本的干细胞细胞异常增殖的结果。肿瘤发生的癌症干细胞理论描述干细胞有可能发展成不同的子组癌细胞具有意想不到的表型特征(3]。在肿瘤发生过程中,有害的基因突变可能会选择通过适应各种肿瘤微环境。因此,基因组的许多癌症可以被认为是动态的。这可能会导致免疫逃避和抵抗化疗(4]。目前最有效的癌症治疗似乎与高度相关的细胞内同质性肿瘤(5]。例如,急性早幼粒细胞白血病(APL, M3亚型急性骨髓性白血病)——很大程度上可以治愈的药物反式视黄酸(ATRA)和三氧化二砷(ATO)的组合。这效果是最有可能通过有效地针对癌基因白血病α在几乎所有的APL细胞表达蛋白均匀。然而,对于大多数其他癌症,蛋白表达似乎明显异构,限制新的靶向治疗的疗效[1]。

单个细胞是所有生理组织的基本单位。因此,理解癌症和肿瘤的细胞进化和基因组变异亚型在单细胞水平的发展是一个关键的步骤,“个性化”癌症治疗(6,7]。单细胞测序(SCS)技术的快速发展已经成为一个非常宝贵的工具来定义和描述基因组,转录组、外遗传性异质性在癌症发展(8]。为例,采用SCS循环肿瘤细胞转移和发展的诊断可能帮助治疗设计和增强根除肿瘤不同细胞亚群(9,10]。在本文中,我们将介绍SCS的一般过程和描述的基因组,转录组,外遗传性概要文件将提供一个框架,用于肿瘤研究的技术进步,最终推动小说发展治疗癌症。

2。单细胞测序(SCS)技术的程序和方法

的发展在2005年首次下一代测序(上天)技术提供了小说的可能性进行全基因组单细胞测序(8]。单细胞RNA序列在2009年首次描述(11),之后,在2011年第一次描述了单细胞DNA测序(6]。这些开创性的发展是紧随其后的是2013年的第一次外遗传性测序的描述(12]。单细胞测序可以简化程序,包括样本收集、单细胞隔离,核苷酸序列(DNA或RNA)放大,和DNA测序和数据分析(图1)。在下面,我们将讨论与单细胞测序技术相关的通用程序。

2.1。样本收集和单细胞SCS的隔离

SCS的初始步骤是孤立的单个细胞样本的兴趣。单细胞样本历来从活检获得的肿瘤组织或体液,包括血液、脑液和尿液8]。孤立的单个细胞丰富的细胞随机,描述了下列方法:连续稀释,机器人精密控制,flow-assisted细胞排序(流式细胞仪)和微流体平台(8,13]。这些方法要求从新鲜组织感兴趣的细胞被孤立,然后准备暂停。因此,样品已被瞬间冷冻或formalin-fixed石蜡包埋不能用于单细胞隔离。这些方法的局限性包括技术掌握,分离多个细胞的高概率和较低的吞吐量。因此,当感兴趣的细胞的数量很少(< 1%),孤立的单个细胞可以是极其困难的。标准方法的细胞隔离有被修改来提高分辨率14),已研制出许多新奇的策略来解决这个困难,如纳米过滤器™,MegSweeper™,CellSearch™,CellCelector™,DEPArray™。,纳米过滤器技术已用于歧视和基于特定的细胞选择感兴趣的单个细胞大小(15]。MegSweeper和CellSearch采用磁珠与特定感兴趣的“鱼”细胞抗体表达特殊的膜标记(16,17]。DEPArray系统收费适用于选择感兴趣的单个细胞通过一个微芯片dielectrophoretic笼子。成本,上述方法的限制单个细胞的空间信息是错过。要克服这一点,laser-capture-microdissection (LCM)已经被用于保护的背景下,单个细胞在空间维度剖析单细胞组织切片的兴趣(18]。然而,细胞切片的操作和RNA / DNA使LCM紫外线损伤影响测序结果的可能性。因此,当前开发方法都没有限制。单独选择和利用组合的方法可以用来减少具体每种技术的局限性。另一个限制是测序的再现性。例如,单个细胞的基因组可以不同,即使在相同的细胞系,因此单个细胞的测序结果可能不是完全复制。此外,核苷酸源自一个单细胞的样本的数量创造了技术上的困难生产可靠的复制。因此,未来的技术将需要被开发来克服这些限制。

2.2。单细胞扩增的DNA和RNA的方法

单个细胞含有DNA和~ 10 ~ 6 pg pg RNA,而这些数量有限的功能延伸DNA或RNA序列(8]。因此,为了获得更多的DNA核苷酸库建设、全基因组核苷酸放大包括全基因组扩增(WGA)和whole-transcriptome放大(WTA)是必要的。SCS,编剧和WTA提供基因突变分析的基础和拷贝数变化和特定的细胞基因表达测定单个细胞。这些技术的数量和质量放大的单细胞DNA和RNA与测序的结果密切相关。例如,输入模板编剧的有限或WTA导致很多技术错误,包括假阳性和假阴性错误,覆盖不均匀性,和等位辍学(ADO)事件。因此,使用适当的方法来促进和WTA输出的编剧和验证以公正的方式是成功的核苷酸序列的关键。

DNA SCS,编剧提供了足够的核苷酸测序图书馆建设(6,19]。目前有三种方法,描述了编剧:degenerative-oligonucleotide-PCR (DOP-PCR) multiple-displacement-amplification (MDA),和多个退火,looping-based放大周期(MLBAC) [7,12,20.- - - - - -22]。SCS DOP-PCR是第一个方法开发的,采用混合寡核苷酸序列定义包含退化和放大DNA,半随机的和非随机启动的举止。DOP-PCR可以产生较低的物理覆盖(10%)的单细胞基因组。这允许过程适用于高分辨率拷贝数配置文件,但局限于低分辨率测量突变时核苷酸基础水平(6,20.]。第二常见的编剧是MDA方法,这有助于通过变性单细胞DNA模板合成DNA片段,紧随其后的是位移前者与后者新合成的DNA片段片段。这个过程释放新引物退火的单链DNA和DNA合成。MDA已经广泛报道来实现高物理覆盖(> 90%)从一个单细胞基因组或外显子组,这是理想的测量基本突变但贫困测量DNA拷贝数(7,21]。第三摇法、MLBAC、聚合循环DNA片段PCR的适配器结扎紧随其后。这产生DNA拷贝数数据和信息单核苷酸变异(22]。相比之下,对基因组DNA测序图书馆准备之前不需要编剧。因此,基因组DNA隔绝感兴趣的细胞群是紧随其后的是图书馆建设。鉴于WGA的方法这里讨论的过程会导致偏见引起的DNA扩增,SCS应该执行通过选择适当的方法(s)根据实际需要。

Whole-transcriptome(信使RNA信使RNA)放大是成功的一个关键步骤适当SCS [19,23]。RNA序列的初始步骤为whole-transcriptome放大[开发有效的方法8,19,23]。在过去的五年里,核糖核酸测序获得了进步。腺苷酸mRNA在WTA的初始阶段,是相对地转录和有选择地放大使用oligo-dT引物共轭适配器序列。这会产生互补DNA(互补)oligo-dT锚固和模板切换方法。接下来,PCR或体外转录(溶)方法用于放大cDNA以下排序。直到现在,经典WTA方法被修改:这个砧骨单细胞转录景观高度多元化RNA-seq(开始于24,25],“Smart-Seq”(Smart-Seq2 [26]),单细胞RNA-seq多元线性放大CEL-seq / MARS-seq [27])。作为一个不可避免的后果,这些方法使用强大的3′信使rna扩增偏差。

2.3。表观遗传因素

的概念表观遗传学描述功能相关基因的变化,不涉及nontumorigenic单一细胞的核苷酸序列的变化(28]。借用了表观遗传分析方法可以更准确地描述基因组的命运单独孤立的肿瘤细胞(29日]。表观基因组包含所有表观遗传标记的景观中存在的细胞和染色体表现(30.]。这种效应定义每一个发展阶段的细胞和癌症进展(31日]。发现的秘密定义每个单个细胞在基因层面上,外遗传性测序是至关重要的。然而,方法论上,是非常具有挑战性的精确描述和定义外遗传性标记DNA序列或染色质组成(8]。最常见的标准外遗传性测序方法包括(1)酸性亚硫酸盐测序(BS-seq)和(2)染色质immune-precipitation紧随其后测序(ChIP-seq)分析组蛋白修饰和染色质结合蛋白(31日]。BS-seq, DNA的池需要分离成两部分治疗与二硫化或甲基化测序前限制性内切酶。此外,表观遗传修饰的DNA聚合酶不能被放大。从本质上讲,它是一个强大的技术挑战来准确描述单细胞外遗传性景观(8]。最近,据报道,减少单细胞表示酸性亚硫酸盐测序(scRRBS)可以测量一个细胞的胞嘧啶甲基化修饰在大约10%的基因组32]。在另一项研究中,是由单细胞ChIP-seq方法结合微流体,DNA条码测序和收集染色质数据分辨率单细胞,描绘高质量的染色质状态映射,从而定义分组人口的细胞类型(29日]。最不靠谱的是,并行单细胞全基因组转录组和methylome测序的方法是最近开发的,这可能显示不同类地甲基化之间的联系远端管理元素和主要的多能性基因的转录活动61年老鼠的胚胎干细胞在单细胞水平上(33]。因此,似乎具有较高分辨率的方法和额外的维度对单细胞测序可能会提供一个未来的道路外遗传性测序单个癌细胞和更个性化的肿瘤治疗方法。

2.4。基因测序和数据分析

2005年开发,捷平台迅速减少人类基因组测序所需的成本和时间。这提供了一个强大的工具,在大量的疾病的诊断和治疗(34]。然而,考虑到多个固有的技术错误存在于当前的单细胞测序技术,改进的生物信息学分析是一个关键要求区分噪音的意思。总会在技术的持续进步和生物信息学的发展前途,可能适用于SCS技术及其应用个性化的肿瘤治疗方法。

3所示。SCS在癌症治疗中的应用和研究

3.1。SCS可能揭示进化结构和肿瘤细胞的异质性

癌症发展的特点是基本的基因表达的变化。这种变化可能被考虑癌症进化,因为它涉及突变多样化和克隆选择的过程(10]。描述的机制,确定这种基因的变化可能在癌症诊断和预后提供一个飞跃和小说的发展有效的疗法(35,36]。在癌症发展的时间和空间维度,多个基因组变化可能发生在同一肿瘤适应当地的环境因素。这种特性可能导致癌症的异质性在表型和基因型和可能持有密钥决定改变细胞命运和转移的机制。SCS技术的发展提供了一种方法来解剖进化结构和识别激活基因在癌症发展在单细胞水平(图2)。例如,在2011年单一核测序技术用于研究肿瘤细胞群,结构和演化两个乳腺癌患者通过分析基因组拷贝数变异(6]。在这项研究中,100个细胞的细胞核孤立于原发肿瘤站点和转移性网站提取和单细胞DNA扩增和测序。利用生物信息学分析拷贝数变异,结果表明,单个克隆扩展到原发肿瘤和转移进一步播种。

随后在2012年,WTA的MDA方法的开发,允许癌症基因组的分析在单细胞核苷酸水平上(7,21]。侯等人的基因组测序和分析90单个细胞JAK2-negative骨髓增殖性肿瘤基本血小板增多(et)患者。他们的研究结果表明,ET代表了单克隆进化和司机基因SESN2和NTRK1识别。许等人分析了透明细胞肾细胞癌的细胞,一种常见的肾癌,股票几个不同病人之间的突变。他们描述了详细的瘤内遗传景观在单细胞水平上(21]。这些结果表明,SCS方法可以应用于个人发展的癌症和提供了一个框架细胞靶向疗法更有效。与传统的细胞化验,SCS的优点来识别罕见的司机基因克隆存在的肿瘤,否则无法被观察到在一般细胞的人口。例如,最近的一项研究Yu et al。37]分析结肠癌细胞表明司机致癌基因SLC12A5突变可以被确定在单细胞水平,但是不能在细胞群的水平。此外,单细胞RNA序列(RNA-seq)也适用于定义肿瘤细胞的异质性。Patel等人使用单细胞RNA-seq方法概要430个细胞从五个主件并定义其瘤内异质性与潜在的预后的影响(38]。这表明发现先前未被欣赏的异质性可能有助于描述癌症预后和治疗(38]。

3.2。SCS的循环肿瘤细胞可以预测肿瘤转移和发展

循环肿瘤细胞(ctc)构成一种罕见的肿瘤类型(1 100万年)来自于原发性肿瘤和通过循环迁移到其他网站8,9,14]。ctc有助于转移,从而导致大多数癌症患者的死亡率。原发肿瘤细胞个体基因组分析和表征,ctc,转移性细胞可以提供机械的见解ctc的激活39]。为了揭示基因组之间的联系主要肿瘤,ctc,和转移性细胞,单ctc可以孤立和编剧,其次是全基因组DNA测序。鉴于ctc在不同类型的癌症是多种多样的,ctc定义一个细胞群体固有的异构和稀有的循环。因此,隔离人群的ctc可重复的、可靠、快速、节省成本,和自动化的方法是一个重大挑战40- - - - - -42]。目前,三种方法已经开发了CTC隔离:immunoaffinity,基于物理特性的隔离,直接分析。Immunoaffinity-based方法指的是利用磁珠或纳米基质(纳米硅/ micropillars)与特定的目标特定的标记抗体,从而选择性地丰富ctc或耗尽白细胞。这种方法广泛用于CTC隔离:CellSearch CTC量化被批准临床的转移性乳腺癌、前列腺癌和结肠癌。这种方法的主要限制是抗原抗体特异性和长时间交互。另一种方法,选择基于物理特性,选择ctc的密度、大小、可变形性和电气性能。这些方法利用密度梯度离心法、微滤、微流体、双向电泳,都是独立于细胞抗原表达,但受限于CTC纯度。第三种方法,直接分析,利用光纤扫描和霍尔效应传感、通过高通量分析红细胞裂解后血液中的所有细胞。CTC检测这种方法保持承诺,因为更少的脆弱性与抽样细胞损失,但受限于贫穷CTC复苏。因此,当前的方法来隔离ctc进一步癌症患者将受益于技术进步,消除个人的局限性。

ctc可以隔离病人的血,全基因组测序的ctc可以提供无创测量优化癌症的诊断,甚至预后(14]。在单细胞全基因组转录组水平,核糖核酸测序方法(Smart-Seq)已经被应用于解剖单一黑色素瘤CTC的独特的基因表达模式,促进基因的鉴定生物标记物的CTC (26,43]。使用有针对性的DNA测序方法,Heitzer等人在结肠癌,许多司机突变在原发肿瘤在ctc还发现,表明ctc的基因组分析可能代表突变的肿瘤的进化模式(44]。本研究为应用程序提供支持的SCS ctc孤立的从患者的血液,有效地组成一个肿瘤“液体活检。”倪等人在单一的ctc的肺癌患者单核苷酸变化和插入/删除外,该地区仍在成熟的基因组RNA基因内区后被RNA拼接(39]。他们发现,ctc是癌症特异性的拷贝数变异和肿瘤转移密切相关。Lohr等人同样观察到在前列腺癌原发肿瘤的突变的重合复发,ctc,转移组织(45]。因此,ctc的单细胞测序提供了一个窗口来观察瘤内或转移性组织基因组或转录组水平和可能援助肿瘤学家动物追踪癌症突变进化并提供优化治疗策略之前,耐药性的出现(9]。

3.3。SCS技术在个性化医疗的潜在作用

精密医学定义个性化医疗的未来(46]。因为几个致癌突变可以发生在同一个病人,串行个别病人的基因组分析随着时间的推移,将是一个重要的组成部分(47]。一个重要的例子演示了在最近的一项研究恩格尔et al。48]。他们分析了细胞患者原发性骨髓纤维化(及)转换为二次急性髓系白血病(sAML)。病人的样本的诊断及收集sAML, WGS紧随其后。克隆的体系结构在转换或然数sAML为特征,表明潜在的新型治疗患者表型证明了这一点。在时间维度,癌症细胞的克隆分析架构进化在单细胞水平将推动更深入地理解基因内发生的事件的顺序的癌症基因组。在最近的一项研究中,Gawad等人分析了1479个单个肿瘤细胞从六个急性淋巴细胞白血病(ALL)患者SCS,观察顺序删除,单核苷酸变异(SNVs)和本序列变化(49]。他们观察单细胞决议表明基因的序列事件背后的童年所有发生在订单。因此,从克隆进化的角度来看,单细胞测序技术可能是一个强大的武器,帮助临床医生更好地了解疾病的发病机制,高分辨率,为病人提供个性化治疗专门优化(4,10]。

躯体进化在肿瘤发展密切相关的遗传和表观遗传突变的积累。通过识别肿瘤细胞增殖和入侵的贡献,体细胞突变特征为“司机”或“乘客”的背景下,达尔文动力学(50]。驱动突变能导致显著的肿瘤反应。因此,驱动突变的识别潜在肿瘤恶化可能在个性化医疗的发展援助。然而,由于司机基因突变通常是短暂的和变化的出现新的耐药表型,针对更常见的“制药”驱动突变可能是一个必要的方法。然而这种方法会减少选择性表型特征,降低程度的个性化治疗。最近,它提出了从观察基因测序的癌症肿瘤演化的模式出现在non-Darwinian方式(51]。司机基因突变可以被认为构成一个完整的系统发育树,”包含“树干”和“分支”突变在时间和空间维度(10,52]。在这种种系发生树,树干突变被定义为所有细胞的基因突变。相比之下,分支突变基因突变获得子组的肿瘤细胞(53]。理论上,发展癌症细胞的表型,如转移耐药、复发是由于基因突变或这两个层面。有人提议,主干和分支突变基因可能是控制不同(54]。因此,定义的基因组特征系统发育树是一个关键的步骤,识别潜在的司机药物靶向基因或有效治疗的免疫细胞。最近的进步与利用嵌合抗原受体T细胞免疫治疗目标肿瘤细胞显示非常有前景的结果55]。这种强大的技术可以用来在SCS特定肿瘤抗原识别目标。

4所示。结论

慢性骨髓性白血病治疗的巨大成功和伊马替尼的急性早幼粒细胞白血病治疗ATRA和ATO表明,针对重要oncogenetic突变是有前途的治疗癌症的5,56]。然而,基因型和表型的异质性的特点确定肿瘤发展的时间和空间发展,使靶向肿瘤治疗困难。SCS方法提供一种机制来研究肿瘤的进化结构和罕见的细胞群的基因组信息如ctc。最近SCS技术进步允许新的肿瘤特征转换,转移,药物抗性,抗原性,immunoediting。SCS技术为此提供了一个更详细的了解癌细胞亚种群的基因组结构,促进新型肿瘤的发展策略intratumor异质性的上下文中。然而,基因测序的高价格,单个细胞的分离和鉴定困难的兴趣,和测序数据的计算分析仍然是阻碍SCS技术的应用肿瘤诊所(8]。开发一个完整的理解的主干和分支突变在癌症临床意义系统发生的树和后续开发靶向治疗将需要广泛的未来调查实验室和诊所。

相互竞争的利益

作者没有利益冲突。

确认

作者感谢Chenqing郑(深圳华大基因研究院)的讨论。这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81301019 Lijuan Gu也没有。81571147 Xiaoxing Xiong),杭州科技开发项目(没有。20140633 b33 Lijuan Gu),美国心脏协会奖14 ftf19970029信条m . Stary和基础研究基金为中央大学(没有。2042016 kf0078你们多多指教)。

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