用于创建虚拟病理学幻灯片的图像蒙存：获得整个幻灯片图像的创新和经济的工具

摘要

背景．显微镜在生物学研究领域的全部验收。与显微镜有人可以详细了解组织中蜂窝水平的发生。虽然它是一种普遍存在的工具，但限制是大放大率存在小视野。在高放大率下看到整个样品通常有利。多年来，光学技术进步已经帮助通过创建可以提供“整个幻灯片数字图像”的所谓专用“幻灯片扫描器”来提供对显微镜的这种限制的解决方案。这些扫描仪可以提供无缝，大视野的整个组织部分的高分辨率图像。这种完整的滑动成像系统的唯一缺点是其令人令人市性的成本，从而阻碍了大多数实验室的实际使用，特别是在发展中国家和低资源国家。方法．在寻求他们的替代品中，我们尝试了常用的图像编辑软件Adobe Photoshop以及附加到一个三边形显微镜的基本图像捕获设备，以创建数字病理幻灯片。结果．使用Adobe Photoshop创建的无缝图像保持了诊断质量。结论．经过时间和努力，从基本的相机-显微镜设置获得的显微照片可以在Adobe Photoshop中组合和合并，以微不足道的成本创建一个实际可用的质量的整个幻灯片数字图像。

背景

传统上，病理学的教育和培训是通过教科书、玻片和常规显微镜来进行的。在过去的二十年里，基于网络的病理学资源的数量急剧增加[1］．全载玻片成像(WSI)技术允许玻璃载玻片被扫描并在电脑屏幕上观看。这种技术被称为虚拟显微镜(VM)。1985年开发了获取虚拟幻灯片的技术;然而，直到20世纪90年代末，计算机的处理速度才足以将虚拟显微镜商业化，并将该技术应用于教育。随着技术以光速发展，调查显示，目前大约50%的病理学课程已经或预计将实现虚拟显微镜[2]至少在西方。

高分辨率病理数字图像提供了大量有关生物系统形态和功能特征的信息，正在将病理学领域带入一个新的时代。数字病理学在临床诊断中的转变才刚刚开始。数字病理图像，如扫描显微镜载片生成的WSI，具有诊断分辨率，使组织标本虚拟机支持临床诊断和生物医学研究[3.］．在现实中，虚拟病理学幻灯片是一个通过计算机展示的显微镜模拟器[4.］．

WSI的应用是巨大的，但目前主要应用于数字图像传输、二次意见咨询[5.]， 质量保证 [6.)、教学(7.]和研究[8.、远程冷冻切片诊断[5.，熟练程度测试[6.[多中心研究[5.]和归档[9.］．高分辨率的数字图像和技术的改进现在可以使WSI作为传统显微镜(CM)的替代[10.］．这种专用的整个切片扫描仪的缺点是其极高的成本，发展中国家的病理学实验室都负担不起。

目前，业内领先的图像编辑软件“Adobe Photoshop”已经家喻户晓。它有许多特征，可以用于图像处理甚至基本分析。在寻找昂贵的幻灯片扫描仪替代品的过程中，我们尝试使用Adobe Photoshop的照片合并工具来创建一个特定区域的大量显微照片的拼贴图，以获得整个组织切片的数字图像。

2.材料和方法

2．1．虚拟病理切片(VPS)的构建

使用基本成像工作站，由常规使用的Olympus CX21三目显微镜(Olympus, Melville, NY, USA)和奥林巴斯SP350数码相机附件组成，随机选取常规跑步载玻片进行多幅图像采集。相机连接到显微镜是通过奥林巴斯提供的定制适配器专用内置光学，通常是10倍物镜，大多数数码相机(镜头通常固定在这样的位置，这样就实现了对焦，图1）.摄像头连接一台安装adobephotoshopcs3软件的高规格计算机。

部分切片显微照片的采集和转移遵循一定的指导原则（1）不包括有伪影、染色不当、多位组织切片和切片。取而代之的是一个染色良好的单位组织切片。(2）使用10倍物镜，整个部分的所有区域都以阶梯的方式进行显微照相，以确保没有遗漏任何区域。为了捕获显微照片，一旦在计算机显示器上对要捕获的区域进行聚焦，如果满意，则可以捕获该区域的切片。整个部分都要重复这个步骤。显微照片的数量根据组织切片的大小从30-40张到数百张不等。最终获得显微照片的多个“圆”(注:显微照片的多个重叠区域是可以接受的;事实上他们更受欢迎，图2）.如果一个人想要每个目标变焦级别的WSI，则可以单独地捕获组织部分的显微照片。（捕获10倍，20倍和40倍以下的多个显微照片）以获得10x，20x或40x的WSI。捕获过程的光学重拍通过个人和软件无法控制我们技术中的捕获过程，因为我们的手动方法。如果实现自动化，则可以采用软件来执行相同的软件，从而减少努力，但是巨大地提高了设备​​的成本。（3)高规格的桌面计算机，配有高速处理器，最少2-4 GB RAM和空硬盘空间的负载，以拥有一个快速的工作流程。然后将获得的图像转移到安装adobephotoshopcs3 Extended软件的计算机上。然后在Adobe Photoshop CS3 Extended和Adobe Bridge中打开显微照片，进行图像优化、合并并创建虚拟病理幻灯片。

2．2．在adobephotoshop中创建VPS的实际工作流

2.2.1。Premontage图像优化

将使用一个图像，并且相同的设置将应用于其余图像。

步骤1(在Adobe Camera Raw (ACR)中处理JPEG文件)。为了一次管理多个图像，从而减少大量时间，可以使用Adobe Bridge和Adobe Photoshop。Adobe Bridge是Adobe Photoshop的一个附加应用程序。为了有效地使用Adobe Bridge，并将“JPEG”文件处理为“Raw”文件，使JPEG文件成为传统相机的底片，并允许非破坏性图像处理，因此可以在不影响其原创性的情况下进行必要的修改，必须更改Adobe Photoshop中的一些“设置”。要做到这一点，打开Adobe Photoshop，点击“编辑”标签，并选择下拉菜单下的首选项，以获得一个弹出窗口。在那个窗口中选择“文件处理”，并选中“为JPEG文件选择Adobe Camera Raw”，然后选择Ok(图3.）.这使得Adobe Photoshop甚至可以在ACR中打开JPEG文件。

接下来，打开Adobe Bridge，浏览所有显微照片所在的文件夹，选择“所有图像”，右键单击它们，在Adobe Photoshop中单击“打开”。该命令通过Adobe Photoshop打开ACR窗口中的所有显微照片(图4.）.

第二步(纠正白平衡)。接下来，选择ACR窗口左侧的文件查看器中的所有图像，然后使用位于ACR窗口左上方区域的“白平衡”工具(图5.）.一旦白平衡工具被选中，移动到一个应该没有colorcast的区域。在这种情况下，幻灯片的背景应该是白色的，所以选择白平衡工具，单击任何白色出现区域应用自定义白平衡。实际上，您可以使用ACR窗口右侧的许多其他选项来获得所需的图像更改。一旦白平衡被纠正，点击“同步”，立即对所有其他显微照片应用相同的设置，点击“完成”，退出ACR窗口。

第三步(非破坏性剪切)。在实际执行此操作之前，反转“设置”;也就是说，更改最初是在ACR中处理JPEG文件所做的事情。要简单地执行此操作，请在Photoshop转到编辑>首选项>文件处理>取消选中“更喜欢jpeg文件的Adobe Camera Rew”并点击确定。从现在开始，每个图像都必须单独在Photoshop中打开。转到文件>打开>浏览到文件的位置，然后单击它在Photoshop窗口中打开。只要仅获取图像的所需部分而不是图像的无关的“黑色”部分，请转到左侧的工具，然后在“框架”工具下选择“椭圆形Marquee工具”，然后单击并拖动图像以绘制A.虚线圈与所需区域一样大（图6.);点状圆内的区域现在被选中。一旦选中，右击它以获得进一步的选项;然后点击“反向选择”，选择图像的无关部分，然后点击键盘上的“删除”键，只得到需要合并的显微照片区域(图)7.）.“保存”这个文件在psd (Photoshop)或“TIFF”格式，点击“文件”，并选择“保存为。”没有选择其他格式来避免图像压缩，这可能会严重改变分辨率。

重复上述命令序列的所有显微照片的整个部分和作物。Adobe Bridge本身也可以“批量裁剪”，因此可以减少很多时间，但Adobe Bridge的缺点是只能在矩形中进行裁剪，不能在圆形中进行裁剪。这可能会导致在最终的整张幻灯片图像中缺失部分角落。如果使用的是带有专用相机的显微镜(如Jenoptik相机)，所有的显微照片都可以直接进行优化和合并。由于显微照片中没有这种“黑色多余部分”，因此不需要进行非破坏性裁剪。

2.２.２.合并优化后的图像

所有经过优化的图像将被合并成一张显微照片的拼贴画。

一旦图像被优化和保存，它们必须被合并，以获得无缝拼贴的显微照片，这些照片完全对齐并合并，以创建整个区域的高分辨率数字图像。要做到这一点，去“文件”和选择“自动化”得到进一步的选项下拉菜单。选择" photomerge "选项获得一个关于photomerge的弹出窗口(图8.）.选择“仅重定位”布局通过点击它。对于源文件，浏览存储所有优化图像的文件夹，并选择所有以获得列表中的所有图像(图8.）.点击“确定”获得整个区域的美丽全景图像。在实际的合并过程中，我们可以看到软件是如何排列和混合大量的微照片并创建全景图的9.）.使用photomerge命令混合所有图像后，可以看到整个组织切片(WSI)的高分辨率图像(图10.）.所获得的图像由许多层组成，可以通过将“图层”标签进行“层”选项卡展平，然后在下拉菜单下选择“合并”。一旦合并了图像可以存储在“tiff”或photoshop格式中以维护分辨率。

用户界面．一旦变平，创建的数字图像的整个幻灯片可以在计算机界面上使用zoom(稍后讨论)。

3.讨论

虚拟载玻片(VS)由一系列数字图像组成，这些图像代表了在所有放大水平上的组织学/细胞学载玻片以及所有相关的临床数据。这些图像可以通过一个界面(“用户友好”)在电脑上观看，这个界面允许人们选择更合适的领域，并以不同的放大率检查它们，迅速从全景到高分辨率，反之亦然。与玻片相比，VSs因其数字化特性而具有一些优势，可以被认为是一个广泛应用的通用平台[11.];它还能够在不同的放大倍数下检查图像，以及在屏幕上并排查看组织学和免疫组化[5.使它变得有趣。它还将允许对虚拟幻灯片进行注释[5.］．

VM系统是一种现实的替代方案，因为它能够模拟传统的显微镜[4.在大多数方面。在我们的研究中，我们尝试通过使用常规三边形显微镜上安装在常规三边形显微镜上的普通数码相机构建一个经济的替代方案，与大多数令人垂涎的图像编辑软件Adobe Photoshop一起使用。

通常数字化整个幻灯片使用一个完全自动化的整个幻灯片扫描仪需要8个小时。如果将每个字段的图像压缩到适当的质量级别(例如，压缩比为35:1)，则需要大约40kbytes的存储空间，从而导致每张幻灯片的总存储需求约为600mb。因此，一张CD-ROM可以用来存储一张虚拟幻灯片[6.］．在我们使用Adobe Photoshop的系统中，我们花了大约2个小时来数字化一张幻灯片(这取决于所用电脑的硬件规格)。我们用Adobe Photoshop制作的每一张数字幻灯片都占用大约500-600兆字节的硬盘空间，相当于一张CD-ROM。所以我们可以假设我们的系统在存储参数方面类似于专用扫描仪。但是，像“Dmitri虚拟幻灯片处理器”这样昂贵的超快速扫描仪已经被发现，与其他虚拟幻灯片系统相比，它可以将虚拟幻灯片处理周期减少10倍以上[12.］．最近引进的先进型号的扫描仪能够在几分钟内扫描载玻片，但价格非常昂贵。

我们创建虚拟幻灯片的Photoshop方法不需要太多的技术知识。在当今的数字世界，大多数组织病理学家对“数字图像”及其不同格式都有基本的知识。尽管在真正掌握这项技术之前可能需要尝试很多次。从严格意义上说，“photomerge”命令可以预期一个完美的虚拟幻灯片，但在现实中，通常会创建一个不那么完美的图像。这取决于很多因素，比如图像的来源、清晰度和图像无关部分的适当裁剪;最重要的是对所有区域进行显微照相，而不遗漏哪怕是很小的一部分。我们提出了一个近乎完美的虚拟幻灯片，只要我们有兴趣、有专门的努力、有时间和耐心地遵循所有的指导方针，就可以创建一个近乎完美的虚拟幻灯片。

zoomify用户界面．使用Adobe Photoshop创建的虚拟病理幻灯片可以通过在Photoshop中放大以高分辨率观察，或者最好将它们导出为外部TIFF文件或导出为“Zoomify”。这个文件可以用网络浏览器打开，它有一个可以放大和移动图像不同部分的界面，就像在显微镜下扫描幻灯片一样。要做到这一点，去文件>导出>缩放。Zoomify是一个外部产品，Photoshop提供的只是一个简化版本。因此，创建的映像可以与internet或intranet上的任何人共享。在互联网上分享大型图片的方式是多种多样的;它们超出了本文的描述范围。当导出为Zoomify时，可以有多个选项，如导航窗口、背景颜色、表示窗口的大小和图像质量，等等(图11.）.它需要一些尝试和错误来获得可能的最佳设置，并且它也很有趣。

WSI的未来潜力是巨大的。WSI可简单地用于多个染色剂并排比较;如果需要比较使用多个染色的多个切片，可以使用Adobe Photoshop中的“匹配和缩放”工具来比较切片中的确切区域。如果任何研究人员想要识别和计数特定类型的细胞，这可以使用整个部分来完成，而不是传统的“每高功率场”计数细胞的方法。最近的几项癌症基因组图谱数据研究表明，在全幻灯片图像中观察到的形态、结果和遗传事件之间存在重要关系[13.］．大量使用WSI的研究与有丝分裂的鉴定有关[14.-16.已经出版了。最终，我们相信这取决于个人的智力和创造力来展示如何利用如此高分辨率的组织病理学图像。这并非没有挑战;在工作流集成、技术基础设施、病理学家适应、临床实践的全球标准化和成本因素等方面可能面临问题[17.］．

罗默等人在2003年致力于使用改良的标准显微镜来生成虚拟载玻片，通过添加带有控制器和摄像机的科学机器人平台来精确捕捉所有微观领域。该技术可从组织切片(包括组织阵列)生成高质量图像[18.］．

我们这种技术的成本几乎可以忽略不计。但它也有一定的局限性，比如对精确显微照片的绝对要求，耐心，反复试验和错误，拥有大量硬盘空间和高内存的高端规格计算机，以及高度感兴趣和敬业的工作人员。创建的整个幻灯片图像将是巨大的尺寸，如果需要高分辨率，每个幻灯片运行在几百兆到千兆字节。因此，如果为了存档的目的而例行公事，那么存储将是另一个问题。

4.结论

考虑到专用切片扫描仪的“成本”因素，似乎没有一个发展中国家能够负担得起并将其纳入常规诊断和病理培训。因此，我们提出这种使用Adobe Photoshop制作高分辨率拼接图像的放大视场的技术，作为获得高分辨率WSI的经济替代方案。

我们同意，与超快速专用扫描仪相比，它稍微有点耗时，但当我们衡量时间成本比时，这可能对许多病理医生非常有帮助，这种整个切片图像的有限需求可以使这种技术成为一种经济的选择。此外，大尺寸数字图像的存储对于存档可能是个问题。然而，这些问题很可能在未来被技术进步所克服。

相互竞争的利益

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者感谢印度班加罗尔市Ramaiah应用科学大学口腔病理科的所有支持，以及Eric Wexler和Digital Insight杂志提供的有用文章。

补充材料

参考文献

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