比较手动和自动ki - 67 Immunoexpression量化在成釉细胞瘤的方法

文摘

成釉细胞瘤是一种常见的和不可预测的牙原性的肿瘤复发率高。几项研究评估这些肿瘤的增殖能力已经出版,主要使用蛋白质ki - 67。细胞计数必须完成确定细胞增殖率。多个方法已经开发出来。使用最广泛的方法是标记索引,它经历了随时间的变化,以更好地促进细胞计数。这里,我们将手动细胞计数方法与自动细胞计数(ImmunoRatio)来确定这些方法的相对有效性。结果表明ImmunoRatio,免费软件工具,可能是非常有利的,提供结果类似于人工细胞计数方法一起使用时适当的校准。然而,ImmunoRatio缺陷可能影响标签索引结果。因此,这种自动细胞计数方法必须与手册补充细胞计数方法。

1。介绍

一组异构的病灶牙原性的肿瘤,包括那时非肿瘤的良性和恶性肿瘤(1,2]。成釉细胞瘤(AM)被认为是第二个最常见的牙原性的肿瘤,占30%以上的牙原性的肿瘤在大多数流行病学研究(3,4]。我通常分为unicystic (UA)、固体/但(SMA),多见,和外围,成釉细胞的癌是恶性。这些肿瘤展品组织学变化,可能会影响他们的临床行为(4]。ki - 67蛋白的表达是严格与细胞增殖有关。ki - 67是目前在所有活跃的细胞周期阶段(G1-M)和缺席在静止阶段(G0)。ki - 67是一个优秀的标志来确定细胞种群的增长分数,和ki - 67 immunoexpression是一个辅助工具来定义各种肿瘤的预后(5]。肿瘤细胞增殖迅速可以显示预后差相比,肿瘤细胞增殖较低。必须执行细胞计数来确定细胞种群的增长分数,和标记指数是最常用的方法6]。我们在2008年提出的这个方法的一个简单的改变(7),包括使用显微照片分析软件套件,增加细胞计数的准确性和减少疲劳评定等级。然而,这种方法并不使评定等级的标志着细胞计数。2015年(8),这种细胞计数方法的一个变体使用ImageJ软件提出了。这个软件增加细胞计数精度,使计算细胞的标记,从而提高数据集之间的比较。然而,细胞计数是耗时的,尽管有很高的准确性。ImmunoRatio (http://153.1.200.58:8080 immunoratio /)是一个免费的web应用程序进行自动图像分析,为细胞计数减少所需的时间。ImmunoRatio有两个变种细胞计数的方法:基本和先进的方法;的基本方法(IRB)的特点是它不修改软件参数,而先进的方法(IRA)的特点是其修改软件参数,通过空白场校正图像,源图像比例尺等。这个软件可以直接使用在网站上或通过ImageJ的插件,具有类似特征:插件基本方法(IRpB)和插件用先进方法(IRpA)。这对AMs方法还有待评估。因此,它仍然还不清楚如果这个软件能提供类似常规细胞计数方法的结果。在目前的研究中,我们比较两种人工细胞计数方法自动ImmunoRatio方法在最常见的变体来确定这些方法可以交替使用这种类型的牙原性的肿瘤。

2。材料和方法

34 AMs组织样本(15 UA和19 SMA)在缓冲福尔马林固定和嵌入在石蜡块得到大学的分子病理学实验室的共和国在乌拉圭(UDELAR)。两个3μ米部分被从每个块使用切片机。第一部分是与苏木精和伊红染色证实组织病理学诊断根据世界卫生组织(世卫组织)分类(4]。诊断用苏木精和伊红染色样品完成的两个经验丰富的病理学家。第二组的组织部分是安装在使硅烷化幻灯片和免疫组织化学染色显示执行先前描述的方法(9]。主要的抗体使用反- ki - 67(克隆MIB-1,单克隆鼠标、反IgG1, Dako Corp . Carpinteria, CA,美国)。颈部淋巴结被用作一个积极的控制,和消极的控制没有初级抗体进行染色。所有组织部分没有处理主要抗体缺乏积极的免疫染色。

修改标记指数得分(手动)和数字手动评分/ ImageJ细胞计数(DM得分)进行比较。手动得分和DM得分ki - 67免疫染色的方法进行根据Bologna-Molina et al。7)和Carreon-Burciaga et al。8),分别。

使用这些方法来验证细胞计数,每个点是三个评估三个有经验的病理学家蒙蔽组织病理学诊断。结果被认为是有效的,如果kappa系数评分者间信协议实质性几乎完美的(0.61 - -1.00)(表1)。

2.1。手动评分

按照Bologna-Molina et al。7),五显微照片选择了这种方法,每个是案件的增长分数决定标记指数(图1)。

2.2。DM得分

DM得分方法是手动评分方法的一个变种。DM评分完成后所描述的Carreon-Burciaga et al。8),网格和细胞计数器使用ImageJ插件(https://imagej.nih.gov/ij/)(图2)。

2.3。自动化ImmunoRatio方法

ImmunoRatio是一个免费的web应用程序的自动图像分析是基于分离和反褶积成像,核阈值、颗粒分割,过滤,计算核面积比使用diaminobenzidine (DAB)免疫染色。核区域决定使用两种方法:得分(IRB)没有任何调整的基本方法和先进的方法(IRA得分)和色彩校正的协议Tuominen et al。10]。作为建议的协议,我们还使用一个空白领域图像验证使用相机调整向导测试ImmunoRatio需求(数据显示3(一个)和3 (b))。基本的和先进的ImmunoRatio方法(IRpB得分和IRpA得分,resp)。也可以使用直接与ImageJ运用ImmunoRatio插件(http://jvsmicroscope.uta.fi/sites/default/files/software/immunoratio-plugin/index.html)。核区域分析是根据在线ImmunoRatio方法执行。所提出的Bologna-Molina et al。7),我们得到的标记指数核区域网络和ImageJ ImmunoRatio使用自动细胞计数的方法在五个领域的观点在40 x放大(7]。

3所示。结果

3.1。手动评分和DM得分

平均细胞数量和标签索引的变体AMs获得的每个方法概述在表1。手动评分和DM得分:这些方法显示小的变化意味着细胞计数在AMs(手动评分,李= 12.35,SD±7.60;DM得分,李= 12.35,SD±7.61)和大量kappa系数评分者间信协议(手动得分与DM)(数据1和2)。细胞计数时间范围从大约35到50分钟针对每种情况评估。

3.2。ImmunoRatio

细胞计数由先进的AMs和基本方法的变体如表所示2。

先进的方法:ImmunoRatio web的插件ImmunoRatio ImageJ显示小差异在AMs的细胞计数(IRA得分,李= 12.10,SD±9.88;IRpA得分,李= 12.10,SD±9.87)和大量kappa在每个变体的点,导致几乎完美的kappa系数(IRA得分与IRpA得分)。细胞计数时间范围从约1至2分钟对于每个案例评估(数字4和5和表3)。基本方法:在线和ImageJ插件基本ImmunoRatio方法显示最小的变化意味着细胞计数在AMs (IRB得分,李= 12.56,SD±8.29;IRpB得分,李= 12.53,SD±6.16),轻微kappa系数(IRB得分与IRpB得分)和细胞计数时间大约从1到2分钟对于每个案例评估(数字6和7和表3)。

3.3。Kappa系数

手动评分之间的比较,DM得分,ImmunoRatio(先进和基本)方法显示kappa系数从轻微到零(表3)。

3.4。皮尔森的相关性

皮尔森相关系数是重要的在我们的研究中使用的方法。结果在表4显示手动评分和DM之间有很强的正相关关系之间的得分和先进ImmunoRatio方法(IRA得分和IRpA得分)。中等正相关基本和高级ImmunoRatio方法之间的被发现。手动方法之间的相关性和基本或高级ImmunoRatio方法很软弱。

4所示。讨论

ki - 67抗原是一个细胞增殖标记,已被广泛用于预测和确定各肿瘤(肿瘤细胞的增殖能力11]。能够建立AMs的扩散指数的基本重要性的评价其生物行为:当地的入侵和肿瘤的复发12]。因此,利用抗原ki - 67细胞增殖的标志是一个辅助补充的识别和预后相关性的牙原性的肿瘤(12]。

标记指数法(6)及其修改版(7)被广泛用于评估AMs的增长分数。虽然高度可再生的,但这些细胞计数的方法耗时且乏味,让人筋疲力尽。修改后的版本的标签与ImageJ指数法(8]得分(DM)使评定等级的标志着计算细胞,从而确保在计数增加再现性和减少疲劳;然而,这仍然是一个手动的方法。我们目前的研究结果表明,人工方法用于确定标记指数是可再生的,并且结果与肿瘤细胞的增殖能力在我6,9,13- - - - - -16]。然而,几个因素可能影响的分析ki - 67,包括免疫染色的质量,细胞计数区域选择和评定等级的专业知识(17]。重大kappa系数和高度积极的皮尔森相关系数计算在我们目前的研究中(表3和4)可能由于一式三份图像分析和细胞计数评级机构的专业知识。多种类型的定量病理学图像分析软件开发(17),从而能够降低细胞计数时间和评定等级的疲劳。研究核标记表明计算机辅助标记指数评估可以提供类似与手工方法获得的结果(17]。ImmunoRatio是一个免费和自动图像分析方法和标记细胞计数18]。这种方法产生了合适的导致乳腺和神经内分泌肿瘤10,17,18]。获得的点,我们的研究结果表明,细胞计数与先进ImmunoRatio方法(IRA得分和IRpA得分)有点类似于人工计数方法,虽然我们观察到小kappa值(< 0.39)和疲软的皮尔森相关系数(< 0.5)。然而,百分比区别传统标签索引(手动进球得分和DM)和先进ImmunoRatio (IRA得分和IRpA得分)是最小的(< 0.5%),表明先进ImmunoRatio标记指数评估AMs的合适的方法。我们的数据证实了快速眼动等发表的一项研究结果。17)报道,ImmunoRatio是一个合适的方法来评估神经内分泌肿瘤的标记指数。重要的是,适当的显微照片和最佳的对比度和亮度足够的空白字段只能同时满足亮度和对比度的图像质量标准必须被用来获得结果用最小的手工方法和先进的ImmunoRatio方法之间的区别。此外,使用基本ImmunoRatio方法(IRB得分和IRpB得分)可能适合当软件校准不是必需的。我们的分析的基本ImmunoRatio方法显示最小百分比差异(< 0.5%)之间的高级ImmunoRatio方法和人工方法(IRB得分,IRpB得分与爱尔兰共和军得分,IRpA得分,手动进球得分和DM)。这表明ImmunoRatio方法可以交替使用。值得注意的是,假阳性结果可能缺乏足够的校准,从而大大改变标签索引数据(图6)。

使用ImmunoRatio方法确定标记指数优于手工方法。首先,它是一个复杂的图像分析方法,使多个参数的计算快速,准确,可靠。计算机辅助评估来评定不受错误,显微照片分析了完全相同的结果。自动化方法不需要同伴校准或经验在细胞计数,和细胞计数时间的机会很小,没有评定等级的疲劳。这些关键因素可能影响细胞计数在使用传统的方法。ImmunoRatio生成一个信息图片蒙太奇,可以很容易地评估(18];此外,它是一个免费、开放的web应用程序,可以使用离线ImageJ插件(18]。然而,这种自动化的方法也有一些缺点,包括与足够的质量和显微照片的要求对比和适当的免疫组织化学技术。此外,这种方法可能会影响到ki - 67染色强度,根据细胞周期不同阶段(17]。这种方法也无法从nontumor分化肿瘤细胞细胞DAB-positive原子核,这可能会导致错误的标签索引结果。

总之,先进的ImmunoRatio方法是一种强大的工具,使细胞计数观察和评估的积极的和消极的细胞的数量生成图片蒙太奇。分析使用先进ImmunoRatio方法是高度可再生的和比传统方法更客观,更耗时。此外,结果与常规方法类似,虽然足够软件校准和先前的培训是必需的。AMs需要额外的研究评估如果ImmunoRatio产量结果的一种快速、高效的细胞计数方法与常规方法类似。目前,ImmunoRatio不应使用替代细胞计数方法。相反,由标签索引使用先进ImmunoRatio方法应该与来自手工方法。

采用先进ImmunoRatio可能有效标签指数的评价传统方法,考虑到优化软件的调整是由一位有经验的观察者。在这个研究中,首次使用这个软件是建立在AMs。这是相关的医疗实践,因为它使快速细胞计数结果,这表明它是一种有价值的辅助手段对建立这类肿瘤的预后。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关出版的手稿。

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