转录因子HBP1辐射敏感度提高前列腺癌细胞系的诱导细胞凋亡

文摘

放射治疗前列腺癌近年来逐渐开展;然而,获得抗辐射性放疗后经常发生在一些病人。HBP1 (hmg盒子转录因子1)是一种转录抑制剂,可以抑制许多致癌基因的表达。在我们之前的研究中,我们表明,HBP1的表达水平与前列腺癌转移和预后密切相关,但HBP1和抗辐射性前列腺癌之间的关系在很大程度上是未知的。在这项研究中,前列腺癌患者的临床资料比较,和前列腺癌之间的正相关关系被揭露短距离放射治疗疗效和HBP1基因的表达水平。通过对前列腺癌细胞体外的研究,我们发现HBP1表达水平与癌基因表达水平负相关。此外,HBP1超表达可以使敏感前列腺癌细胞辐射,增加在前列腺癌细胞凋亡。此外,动物模型来分析HBP1基因之间的关系和前列腺癌体内辐射敏感度;结果表明,击倒的HBP1基因可以减少异种移植的对辐射的敏感性。这些研究发现了一个特定的分子机制潜在的前列腺癌辐射敏感度,暗示HBP1作为小说在前列腺癌放射治疗的目标。

1。介绍

前列腺癌在西方国家很普遍,排名第一的发病率在男性癌症1]。与预期寿命增加,饮食和生活方式的变化,前列腺癌的发病率和死亡率在中国正在上升,在一些经济发达地区(尤其突出2,3]。因此,前列腺癌的发病机理和治疗的研究普遍。

过去,根治性前列腺切除术是首选临床局限性前列腺癌的早期阶段和低风险的患者4),而对于后期阶段,中间和高危病人,雄激素剥夺疗法已经使用(5]。在过去的20年里在西方国家,放射治疗(包括EBRT和永久植入放射性种子)治疗前列腺癌逐渐取代了根治性前列腺切除术和雄激素剥夺治疗的主要方法之一,已成为前列腺癌的治疗6,7]。放射治疗前列腺癌近年来逐渐在中国进行具有良好的效果。然而,生化复发或临床复发发生在一些病人放疗后,可能由于获得抗辐射性8,9]。虽然前列腺癌抗辐射性的机制尚不清楚,方法到研究和治疗前列腺癌缺乏抗辐射性。研究集中在减少前列腺癌的细胞抵抗和促进肿瘤细胞对放疗的敏感性增加治疗主要在前列腺癌。

HBP1 (hmg盒子转录因子1)是一个属于hmg盒子转录因子家族的转录抑制剂,可以抑制生长调控基因和癌基因的表达(10]。我们最近发表的研究显示,HBP1在前列腺癌细胞的表达水平和前列腺癌组织明显低于正常细胞和正常匹配相邻组织,分别。的表达水平降低HBP1导致MIF基因的表达水平增加(巨噬细胞迁移抑制因子)和促进了殖民地的能力形成和前列腺癌细胞的入侵。虽然HBP1的表达水平在前列腺癌转移和预后密切相关(3之间的关系),HBP1和前列腺癌放疗是未知的。

因此,我们假设减少HBP1在前列腺癌的表达导致抗辐射性。在这项研究中,我们结合前列腺癌患者的临床资料,前列腺癌的细胞和动物模型来分析辐射敏感度HBP1基因和前列腺癌之间的关系。此外,我们确定了在前列腺癌放疗HBP1和细胞凋亡之间的关系。这些研究澄清的作用在前列腺癌放疗和识别HBP1 HBP1新生物标志物前列腺癌放疗以及放射线增减的新目标。

2。材料和方法

2.1。患者信息

样本集合是按照浙江大学医学伦理委员会和遵循赫尔辛基宣言的指导方针。血液样本66名低风险、中度风险前列腺癌患者接受近距离放射疗法是泌尿外科的获得,肖先生跑医院(浙江大学)2009年2月到2011年2月。入选标准是国家综合癌症网络(机构)风险分组标准,低风险患者,定义为格里森评分< 6前列腺特异性抗原(PSA) < 10 ng / mL, T1c-T2a,中度风险患者,定义为格里森评分= 7,PSA 10 - ng / mL,和T2b-T2c。病人的年龄范围从69年到87年;的平均年龄是78岁。所有患者被诊断出前列腺穿刺活检,根据格里森评分系统:分数是最低,是最高的;治疗前血清PSA最低2.86毫微克/分升,最高为19.3毫微克/分升。所有患者接受前列腺磁共振成像和全身骨PET / CT检查,并没有发现骨转移病人。所有患者接受植入的^125年碘(^125年我)粒子根据美国放射肿瘤学协会的指导方针(ASTRO)和美国大学的放射学(ACR)。前列腺的重建三维图像;短probpsstep V3.02规划软件应用于制定治疗计划和预期目标剂量是144 Gy。粒子的平均数量是64,最低的54,最高91。植入情况通过检查盆腔CT扫描在术后第一天,计算D90的价值。在66名患者,D90值中位数142 Gy,最少122 Gy,最多151 Gy。患者出院后三天,一周后导管被删除了。收集血液样本从患者放疗前后。从所有患者全部道德同意了。

2.2。细胞培养

du - 145细胞系(前列腺癌细胞株)从美国购买类型文化集合(写明ATCC;美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。所有细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM;Gibco,宏伟的岛,纽约)含10%胎牛血清(Hyclone,洛根,UT),补充了50个单位的青霉素和链霉素。

辐照是使用6 MV x射线产生的线性加速器(PRIMUS-M,西门子)的剂量率2 Gy /分钟。辐照期间,细胞被置于室温下2厘米厚组织胶放置在培养皿和由x射线辐照源的距离100 mm。

2.3。质粒构建

pBaBE-HBP1表达向量是一种礼物艾米s绮博士(11];pBabe向量作为控制。逆转录病毒基因转导使用凤凰包装细胞。RNAi-mediated HBP1击倒是通过dna产生的shRNA shRNA-expressing逆转录病毒载体(pSuper-Retro)。向量是一种礼物艾米博士绮。可拆卸的实验进行了如前所述[3]。HBP1成分目标序列ACTGTGAGTGCCACTTCTC pGenesil-HBP1-shRNA质粒和pGenesil-scramble质粒被用作控制。

2.4。实时聚合酶链反应

从组织或细胞总RNA分离使用试剂盒试剂(美国卡尔斯巴德英杰公司)根据制造商的指示。逆转录和一个执行iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad) 20μ包含1 L反应体积μ克的总RNA。实时PCR与权力执行SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司)使用7500实时PCR系统(应用生物系统公司)。细胞周期素D (CCND)引物(意义:5′-TGGAGCCCGTGAAAAAGAGC-3′;反义:5′-TCTCCTTCATCTTAGAGGCCAC-3′), MIF(意义:5′-GCGGGTCTCCTGGTCCTTCTG-3′;反义:5′-GTGGGTCCCTGCGGCTCTTA-3′), N-Myc(意义:5′-ACTTCTACTTCGGCGG-3′;反义:5′-TCTCCGTAGCCCAAT-3′)和GAPDH(意义:5′-CACCAGGGCTGCTTTTAACTC-3′;反义:5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′)设计与底漆总理5.0版软件和他们的效率被测序证实常规PCR产品。

2.5。西方的屁股

从细胞中提取的蛋白质被修改后的洛瑞量化方法。钠十二烷基sulphate-polyacrylamide不连续凝胶电泳(sds - page)进行使用Bio-Rad mini-protein II电泳和转入polyvinylidenedifluoride薄膜(PVDF, Amersham法玛西亚生物技术,皮斯卡塔韦,NJ)。蛋白质提取是硝化纤维膜电泳和electroblotted到支持。屁股被封锁的2 h Tris-buffered脱脂奶粉5%生理盐水(TBS)在室温下1 h,然后用anti-HBP1孵化和anti-GAPDH(猫。sc - 8488和sc - 32233,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,美国CA)具体主要抗体(1:1000稀释)在室温下2 h。墨迹是孵化HRP-conjugated二级anti-rabbit抗血清(圣克鲁斯、钙、美国,1:5000稀释在TBS) 1 h。与0.1% TBS-Tween 20几个洗后,免疫反应性的蛋白质是可视化增强化学发光(ECL)和捕获在一个x射线胶片。蛋白质水平量化使用Biosense 300软件(Oberhaching,德国)。相关蛋白表达水平与表达式计算的控制。

2.6。MTT分析

软骨细胞在96孔培养板被播种。12小时后,细胞治疗与薯蓣皂苷配基(0,10、50和100μ米)24 h。细胞与肝癌和孵化解决方案(5毫克/毫升)在37°C 4 h,然后用二甲亚砜(DMSO)摇晃在室温下10分钟。光谱吸光度测量在570 nm多功能微型板块读者(Tecan、杜伦、数控、美国)。

2.7。流式细胞术分析细胞凋亡

凋亡细胞的比例是由Annexin-V-FLUOS化验的染色工具(罗氏)。简单地说,1×10⁵细胞被播种在six-well盘子和培养24小时。这些细胞被收集和resuspended在100年μL绑定缓冲。然后,这些细胞被孵化与5μL FITC-Annexin-V在黑暗中在室温下15分钟。随后,5μLπ添加和细胞孵育20分钟在黑暗中在室温下。最后,细胞样本在流式细胞分析仪检查。每个评估增殖和凋亡重复了三次。

2.8。异种移植模型

所有动物保健和实验性的协议在本研究中被浙江大学动物伦理委员会批准,中国。雄性BALB / c裸小鼠(4 ~ 6周)从Weitong利华国际购买实验动物技术公司(中国,北京)。大约5×10⁷细胞在0.1毫升的PBS在右腿裸小鼠皮下注射和治疗开始时,肿瘤平均达到50 mm的体积³。老鼠轴承类似肿瘤卷被选择,随机分为2组与3在每组小鼠:辐照Con shRNA集团和HBP1 shRNA组。老鼠检查日常治疗相关死亡率。体重和肿瘤大小测量每3天。老鼠牺牲三周后治疗和肿瘤体积计算使用公式:肿瘤体积(毫米³)=(长度(mm)×宽度(毫米)²)/ 2。

2.9。统计分析

所有的实验都重复三次独立文化和类似的结果。数据提出了均值和95%可信区间(CI)。统计学意义是由双尾未配对的学生以及。值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。前列腺癌之间的正相关关系近距离放射疗法疗效和HBP1基因的表达水平

HBP1基因的表达水平在血液样本检测通过rt - pcr相比,66名患者接受放疗和preradiation控制样本。如图1(一),我们发现HBP1表达水平增加brachytherapy-treated患者的血液样本预处理的血液样本。对于这些患者,PSA水平作为主要标准评判近距离放射疗法的疗效;我们发现,PSA明显辐照患者样本(图中表达下调1 (b))。此外,HBP1的表达水平与血清PSA值之间的关系进行了分析,并统计结果表明HBP1的表达水平与血清PSA呈正相关;HBP1表达水平低的患者的预后差(图1 (c))。

3.2。HBP1表达水平与癌基因表达水平负相关

检查函数的HBP1前列腺癌近距离放射疗法,单克隆细胞株稳定转染pBaBE-vector和pBaBE-HBP1质粒与嘌呤霉素选择du - 145细胞。免疫印迹试验用来检测表达水平,结果表明,HBP1显著调节pBaBE-HBP1组(HBP1 OE)与pBaBE-vector(向量)组(图2(一个))。此外,HBP1下游效应基因的mRNA水平检测;我们发现HBP1超表达上调这些基因的表达,如CCND MIF, N-Myc(图2 (b))。同样,单克隆细胞株稳定转染和pGenesil-scramble pGenesil-HBP1-shRNA质粒选择用G418 du - 145细胞;HBP1的表达水平也验证了免疫印迹,结果表明pGenesil-HBP1-shRNA (HBP1成分)可以显著减少HBP1的内源性表达与细胞转染pGenesil-scramble (Con shRNA)(图2 (c))。此外,HBP1结果的可拆卸的CCND的mRNA水平的增加,MIF, N-Myc(图2 (d))。

3.3。HBP1过度du - 145细胞辐射处于敏感状态

建立的四个克隆组(HBP1 OE,向量,HBP1成分,和反面shRNA)辐照使用剂量梯度(从2到6 Gy)。在辐照后24小时和48 h, MTT试验被用来评估细胞生长。在优化的实验条件,我们辐照细胞4 Gy为后续实验。所有四个不同组的生存率辐照后逐步下降;HBP1 OE细胞经历了近似的可行性与其他三组相比减少30%(表1)尤其受到影响。然而,之间没有显著差异观察向量组和HBP1 shRNA组(表2)。HBP1表达式的结果表明,upregulation可以提高短期内凋亡的影响辐射或减少防辐射的前列腺癌。

3.4。过度的HBP1 du - 145细胞凋亡增加

凋亡细胞的数量的四个单克隆细胞株测量辐照后48 h 4通过流式细胞术Gy。HBP1过度增加细胞凋亡率比其他三组(图3(一个))。此外,proapoptotic蛋白质的活性caspase-3免疫印迹检测的四种不同辐照细胞组。我们观察到增加HBP1 OE caspase-3水平细胞,这与流式细胞术结果(图是相一致的3 (b))。

3.5。对辐射的敏感性的异种移植HBP1基因的表达水平不同

du - 145四个稳定细胞系的细胞消化形成细胞悬浮液,是皮下注射6周大的右腿Balb / c雄性老鼠。肿瘤的形成是观察和测量。稳定在裸体小鼠接种HBP1 OE细胞生存能力严重受损,这些小鼠安乐死。老鼠轴承肿瘤源自空向量细胞存活,虽然具体原因不清楚(数据未显示)。当肿瘤直径达到0.5厘米,我们进行了辐照敏感性测试。裸小鼠中稳定与欺诈成分细胞和HBP1成分细胞转染,内生的击倒HBP1能有效地促进肿瘤大小与欺诈成分细胞(图4(一))。老鼠牺牲时,肿瘤摘除和测量;肿瘤在HBP1 shRNA组显著大于Con shRNA组(图4 (b))。此外,HBP1在肿瘤的表达是通过免疫印迹检测;我们发现HBP1表达在很大程度上减少HBP1 shRNA组(图4 (c))。所有数据表明HBP1在肿瘤发展的一个重要的角色。

4所示。讨论

我们的初步结果显示,前列腺癌du - 145细胞系HBP1表达水平高的辐射更敏感。根据这些结果,可以设想,HBP1表达的增加可以提高前列腺癌细胞的辐射敏感度,而减少HBP1在前列腺癌细胞的表达水平可能是前列腺癌抗辐射性的一个重要原因。然而,需要进一步的研究支持这一假说。此外,HBP1活动的机制需要理解它的作用。

许多研究在细胞和动物模型已经证实HBP1扮演着一个重要的角色在细胞周期阻滞和细胞凋亡在细胞周期的调控12,13]。细胞凋亡,作为一个独特的细胞死亡过程中,扮演着一个重要的角色在irradiation-induced细胞死亡(14]。细胞凋亡和整体生存和局部复发率显著相关。在晚期癌症患者中,肿瘤细胞凋亡增加(15),伴随着增加非整倍性细胞(16,17和p53表达降低18),这可能提高肿瘤细胞对放疗的反应。患者的局部控制利率高凋亡指数改善,和远处转移是减少;因此,预后好。肿瘤细胞和肿瘤细胞凋亡机制抗辐射性密切相关(14]。因此,HBP1调节细胞周期的进展,可能调节辐射诱导细胞凋亡在前列腺癌细胞,因此影响放射治疗前列腺癌的细胞的效率。目前,主要有两种caspase-dependent凋亡途径:一是激活细胞外信号,触发细胞内细胞死亡信号通过细胞外配体结合相应的膜死亡受体和招聘和激活caspase-2, caspase-8, caspase-10;第二个途径是激活细胞内压力信号,主要由线粒体细胞色素C激活导致caspase-9激活(19,20.]。然而,细胞凋亡的调控包括一系列复杂的级联,涉及p53 [21],RB [22],E2F [23),和其他因素。细胞凋亡的机制是不同的一样,不同的组织。需要进一步的研究来确定HBP1与细胞凋亡有关,如果是由辐照的交互。

目前,尽管知道是上游HBP1监管,对其下游目标和他们的角色在放射治疗前列腺癌的治疗。作为一种重要的转录抑制因子,HBP1可能调节许多目标基因和信号通路。未来实验确定HBP1在细胞凋亡中的作用是值得的。新技术,如基因芯片,可以用来确定HBP1下游效应器的前列腺癌放射治疗。

5。结论

综上所述,我们的数据表明,抑制HBP1表达不仅辐射敏化前列腺癌细胞,也增加了前列腺癌细胞的凋亡。此外,进行异种移植模型,结果表明,抑制HBP1减毒体内辐射的敏感性。此外,结果暗示HBP1可能通过调节CCND的表达发挥其功能,MIF和N-Myc。所有这些发现具有重要意义治疗前列腺癌的放射治疗和进一步的前瞻性调查可能需要一个更大的患者人群。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。81101929也没有。81101930)和浙江省医学科技项目中国没有。2015 rca014)。

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