宫颈发育不良患者VEGF + 936c /T基因多态性研究

摘要

目标．本研究旨在分析VEGF +936 C/T多态性在宫颈上皮内瘤变中的潜在作用。材料和方法. 186名患者被纳入研究：75例（诊断为CIN的患者）和111名对照组（HPV检测和细胞学均为阴性）。在进行阴道镜检查时，为每位患者安排一次就诊。对宫颈标本进行细胞学和HPV检测，并对外周血进行VEGF+936基因分型。为了进行统计分析，OR和卡方检验的显著性水平为<0.05。结果．病例与对照组CT基因型检测未发现关联，OR = 0.8295，[0.42, 1.62]。T等位基因与HSIL呈负相关，OR = 0.2121， [0.0473, 0.9517]，．结论．VEGF +936 C/T与宫颈上皮内瘤变之间未发现联系。

1.介绍

子宫颈癌至今仍是发病率和死亡率的一个重要因素，被认为是世界范围内第四大女性癌症[1].宫颈上皮内瘤变相当于癌前病变[2，3.]．世卫组织估计，每年约有1-2%的妇女被诊断为CIN+(宫颈上皮内瘤变)病变[4]．人乳头瘤病毒在宫颈癌发生中起关键作用[5，6]．

鳞状宫颈癌被认为是发生在宫颈鳞状上皮基底膜之上的一个连续过程[2，6]．不同类型的宫颈上皮内瘤LSIL(低级别上皮内病变)和HSIL(高级别上皮内病变)相应的活组织检查的CIN I, CIN II和III分别被视为同等条件下的不同阶段,可以进步或倒退到另一个细胞学分类(2]．在LSIL中，HPV HR在大多数患者中位于细胞质中处于episoms状态[2]在持续性HPV HR（高危人乳头状瘤病毒）感染的情况下，正式的双环HPV被破坏，随后整合到核宿主细胞DNA中，导致大量E6和E7病毒癌蛋白的分泌[2]．

VEGF(血管内皮生长因子)代表一个多肽家族，包括VEGF- a、VEGF- b、VEGF- c、VEGF- d、VEGF- e和胎盘生长因子(PLGF) [7]．VEGF-A基因位于6p21.3，有8个外显子[8]．VEGF作用于VEGF受体促进动脉、静脉和淋巴血管生成[9]．此外，VEGF在肿瘤生长和转移中发挥重要作用[10]．

HPV癌蛋白E6和E7的上调使肿瘤抑制因子p53和Rb(视网膜母细胞瘤)失活，干扰细胞周期控制，宫颈癌发生的关键步骤[11]在原发性包皮角质形成细胞中，HPV16E6和E7等分子的表达也与VEGF（血管内皮生长因子）的增加有关[12]．此外，在宫颈癌及其前体中发现VEGF水平升高[13]．

在宫颈瘤变CINs(宫颈上皮内瘤变)的早期会出现新的血管生成。血管模式评估是阴道镜检查的一个重要步骤，有助于分层上皮内病变。使用绿色滤镜能最好地显示血管。异常血管根据其特征(宽度、外观、形态和分支)被描述为镶嵌、标点符号、极性血管，常见于上皮内瘤变和微浸润性宫颈癌[14]．

VEGF对宫颈血管生成有重要作用;因此，不同的VEGF基因型可能会影响宫颈癌的发生。本研究的目的是分析VEGF +936 C/T (rs3025039)基因型与宫颈上皮内瘤变的关系。

2.材料和方法

2014年，共有186名患者在罗马尼亚Cluj Napoca的第一妇产科诊所参加本研究。本研究设计为前瞻性病例对照，包括75例病例和111例对照。病例的纳入标准以CINs的细胞学诊断为代表。对照组以ge匹配细胞学正常且HPV阴性的女性。拒绝参与该研究是一个明确的排除标准。在签署知情同意书后，所有患者都被安排进行临床访问。为每位患者填写具体的研究表，包括记忆数据（年龄、个人病史、产科病史和以前的CIN）。每位患者都进行了临床检查，然后使用带有集成摄像头Leica IC80HD®（捷克布拉格）的数字视频阴道镜（MIKRO MZ6，捷克布拉格）按照四个步骤（天然、绿色过滤、醋酸和卢戈碘溶液）进行阴道镜检查。为了更好地评估血管模式，在使用醋酸后，也在必要时使用绿色过滤器。在阴道镜检查之前，为每位患者获取宫颈标本。在临床适应症的情况下，在阴道镜指导下进行标本活组织检查。所有HSIL患者（高度鳞状上皮内病变）转诊进行冷刀锥切 抽取外周血mL。

宫颈标本进行液基细胞学检查和HR-HPV分型。宫颈细胞学检查是在上述大学医院的化验室按照Bethesda命名法进行的[15]．

DNA提取和基因分型是在医学遗传学部门进行的。从300株植物中提取基因组DNAμL外周血样本使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Wizard®基因组DNA纯化试剂盒，Promega, MA, USA)。基因分型前将DNA保存在−20℃。使用RFLP(限制性片段长度多态性)检测VEGF +936 C/T SNP(单核苷酸多态性)rs3025039，如前所述[16]．

研究数据库创建后使用Microsoft Excel 2007®和STATA中冷10®(College Station, Texas, USA)进行分析。-test用于不同类别女性的比较。采用卡方检验和比值比(OR)(95%置信区间(CI))评估VEGF等位基因和基因型与宫颈上皮内瘤变的关系。

3.结果

共有186名患者被纳入研究，包括75名患者和111名对照。表中描述了患者在各自细胞学分类后的分布情况1．病例组平均年龄为40.36岁，对照组为42.32岁。在平均年龄方面，病例与对照组无统计学差异(= 1.178,)．LSIL/HSIL (= 0.182,), HSIL / CIS (= 1.867,)和LSIL/HSIL (= 1.074,)．

如预期，野生VEGF + 936cc纯合子基因型最常见(病例:73.33%;对照:72.97%)，而杂合子CT为26.34%。VEGF + 936tt纯合子基因型仅在1例原位癌患者中发现;因此，将其排除，以作进一步的统计分析。常见变异VEGF等位基因+ 936c在病例(86%)和对照(86.49%)中普遍存在。VEGF +936基因型和等位基因频率见表2．

在检查VEGF +936杂合子CT基因型与不同CINs类别之间的关系时，未发现有统计学意义的相关性(数据见表)3.)．然而，数据显示有潜在的保护作用:病例/对照，OR = 0.8295, CI 95%[0.4229, 1.6271]， 0.0521，结果处于显著性极限。这种效果对HSIL似乎更有保护作用(OR = 0.6452，)，而LSIL (OR = 0.7373，)，但仍然不重要。VEGF基因型与宫颈发育不良关系的完整分析见表3.．

在表4对不同CINs患者和对照组的等位基因频率分别进行了调查。在病例和对照之间以及不同CINs和对照之间没有发现有统计学意义的差异。有趣的是，T等位基因的存在表明，在HSIL患者中，与发挥潜在保护作用的sil患者的行为明显不同(OR = 0.2121, CI 95% [0.0473, 0.9517]，)．

4.讨论

SNP（单核苷酸多态性）可以位于基因结构的任何区域，包括内含子或外显子。SNP要么没有作用，要么可以上调或下调基因表达[17]．它们发生的频率为人类人口的1%，并可影响人体对环境因素、疾病、药物和治疗的反应[17].所研究的多态性位于启动子内，启动子是基因表达的关键区域[17]．在目前的研究中，没有评估表达水平，但其他研究人员已经证明，这种特定的SNP是功能性的[18]．

VEGF是宫颈发育不良的重要分子[13，19，20.]．此外，VEGF-C被确定为CIN II的独立预测因子[19]．

VEGF在宫颈癌发生中的确切作用机制尚不完全清楚。我们甚至不知道究竟是哪种类型的细胞分泌VEGF被归为肿瘤细胞[10，21或肿瘤基质细胞[10]．当然，VEGF在血管生成和实体肿瘤发生的关键步骤中发挥着关键作用，包括宫颈定位[10，21]．在整合形式的持久HPV HR存在时，E6下调p53，刺激VEGF合成[22]．此外，HPV E6通过刺激缺氧诱导因子1 α (HIF-1 α)的分泌独立地增加VEGF的产生[23]．

VEGF刺激肿瘤内新血管的形成和分化，在肿瘤生长过程中极为重要[13，24]．在宫颈癌患者中，高水平的VEGF是放疗的独立的阴性预测因素[25]化疗[26]．此外，Wu等人[27已经证明，来自液基细胞学样本的VEGF mRNA可以作为一种有用的工具，用于异常巴氏染色结果的分类。

VEGF在CINs中分泌量很高[13， VEGF水平与CINs的不同分期和宫颈癌之间存在正相关[28- - - - - -30.]．

VEGF +936 T等位基因的存在与健康女性分泌水平较低有关[18]．这些发现表明CT基因型的存在(在我们的研究中，只有1例TT基因型;因此，我们不能仅对后基因型进行统计分析)与VEGF水平较低有关。此外，可能的VEGF表达降低可能对CIN有保护作用(病例/对照中CT基因型OR 0.8295, CI 95%[0.4229, 1.6271])。保护作用似乎由低级鳞状上皮内病变向高级鳞状上皮内病变进展(低级鳞状上皮内病变，OR = 0.7373;Hsil，或= 0.6452)。病例之间的比较，这里包括LSIL和HSIL，和对照组之间的比较没有达到统计学意义的水平，即使病例与对照比较值极接近上限(0.0521)。此外，与LSIL相比，HSIL患者可能存在保护作用，OR = 0.2121，[0.0473, 0.9517]。考虑到所有的值表3.和4，我们不能得出VEGF +936 CT多态性与宫颈发育不良有关的结论。

既往文献研究表明，VEGF表达与CIN水平、宫颈癌分期和预后成正比[28- - - - - -30.];因此，一个先天的潜在的低VEGF可以调节宫颈癌的发生。

到目前为止，我们只鉴定了两篇分析宫颈癌与VEGF+936之间关系的文章，结果相似，在VEGF+936基因型与宫颈癌之间未发现统计上的显著联系：Kim等人（2010）的CT基因型，病例/对照(/或=0.88，可信区间95%（0.62,1.23），［31]分别由Konac等人（2007年）编写的案例/对照(/106)，或= 0.52，置信区间95% (0.22-1.23)，［32]。除一项显示潜在保护作用外，三项研究中的OR值相似。

VEGF基因多态性与宫颈发育不良的关系我们认为还远未阐明。本研究为今后的研究方向开辟了方向;它将是有趣的分析阴道镜外观，VEGF多态性，和VEGF mRNA。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

Ioana Cristina Rotar和Daniel Muresan同样为这项工作做出了贡献。

致谢

博士后科研基金资助项目(项目编号:POSDRU/159/1.5/S/138776，《生物医学科学研究的机构合作模式在临床实践中的转换——超越》。

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