将甲醇转化为甲醛在非人类脑脑中甲醛的证据

摘要

许多研究报道，甲醇对灵长类动物的毒性主要与其代谢物甲醛(FA)和甲酸有关。虽然对外周器官中甲醇代谢和毒理学的研究最为深入，但很少有研究聚焦于大脑，也没有研究报告了证明甲醇在灵长类大脑中转化为FA的实验证据。在这项研究中，对三只恒河猴进行单一脑脑室甲醇注射，以研究甲醇对FA的代谢过程是否发生在非人灵长类动物的大脑中。测定不同时间点脑脊液中FA水平。在注射甲醇后的第18小时，发现FA水平显著增加。此外，在注射后30小时，FA水平恢复到正常的生理水平。这些发现提供了直接证据，证明甲醇在非人灵长类动物的大脑中氧化为脂肪酸，产生的一部分脂肪酸从脑细胞中释放出来。本研究提示，非人类灵长类动物大脑中甲醇代谢过程产生的脂肪酸可能在甲醇神经毒理学中发挥重要作用。

1.介绍

单一碳醇甲醇，是一个重要的公共卫生和环境问题，因为它导致代谢酸中毒，视力障碍，中枢神经系统功能障碍，神经变性病症和死亡[1-5.］．在意外或故意摄入和/或暴露于其他外源性甲醇源后，体内甲醇含量升高可能发生。甲醇水平升高也可能是内源性甲醇产量增加的结果，例如通过甲基酯酶或自发非酶反应催化的蛋白质羧甲基酯水解生成甲醇[6.］．

在西周中广泛研究了甲醇代谢和负责其毒性动作的机制。通常，关于灵长类动物的甲醇代谢，涉及三个步骤。代谢途径的第一步是甲醇氧化至甲醛（FA）。醇脱氢酶（ADH）主要负责初始步骤[7.那8.］．第二步是将FA氧化成甲酸。一种专为FA催化FA转化为甲酸的谷胱甘肽依赖的甲醛脱氢酶[1］．另一种依赖于NAD的甲醛脱氢酶，催化人类红细胞中的这种转化[7.那8.和一种高活性的醛脱氢酶负责肝脏线粒体的这种转换[9.］．第三步是甲酸对二氧化碳的氧化。10-甲酰基-THF脱氢酶，哺乳动物组织中的普遍存在酶，催化该步骤[1那10.］．值得注意的是，灵长类动物走最后一步的速度远低于啮齿动物[1那11.］．关于甲醇毒性，许多研究表明甲酸是甲醇毒性的主要原因。例如，甲酸被发现与被甲醇中毒的人的代谢性酸中毒有关[12.那13.和非人类灵长类动物[14.那15.]在甲醇中毒人体中观察到的眼部毒性[12.那16.和非人类灵长类动物[17.那18.］．

此外，在灵长类动物的大脑中也报道了甲醇的毒性作用[2-4.那11.那19.］．鉴于甲醇是不反应性的[20.]比其代谢物的毒性更小[21.]，FA，甲醇代谢中间体被认为是对这些效应的负责，因为有令人焦虑的证据表明FA与AD病理有关在活的有机体内和在体外[22.-26.］．

虽然灵长类动物大脑中的甲醇代谢过程仍不清楚，但很可能大脑会使用类似的酶途径来代谢甲醇，就像在肝脏中发现的那样。据报道过氧化氢酶在人脑中表达[27.]，灵长类动物大脑中ADH1的表达一直存在争议[7.］．过氧化氢酶的表达为灵长类大脑中甲醇氧化为FA提供了可能，但没有研究通过直接评价灵长类大脑注射甲醇后颅内FA水平来证明这一代谢过程。

本研究通过将甲醇直接注射到恒河猴的侧脑室，直接研究甲醇向FA的代谢过程是否发生在恒河猴的大脑中。这种方法允许在动物大脑精确控制剂量的情况下直接研究甲醇代谢过程。在一次甲醇注射后的不同时间点，测定脑脊液中FA水平。

2.材料和方法

２．１．动物和治疗

本研究中所有动物护理和治疗均按照国家动物研究机构(中国)批准的国家护理和使用动物指南进行。所有动物实验均经昆明动物研究所动物保护与使用委员会(IACUC)批准进行。

三只十二岁的雄性恒河猴(解剖)纳入本研究。猴子的体重分别为:1号猴子10.8公斤，2号猴子10.3公斤，3号猴子11.4公斤。每只猴子都被单独安置在标准的实验室条件下[28.］．为了在结果中提供右侧脑室的准确位置，避免手术造成的干扰，同时使动物恢复到稳定的FA水平，在实验之前，每个恒河猴都进行了手术，将一根不锈钢管植入右侧脑室。每只动物肌肉注射阿托品(20 mg/kg)、氯胺酮(10 mg/kg)和戊巴比妥钠(20 mg/kg)麻醉。动物的头部被固定在立体定向仪器中，在无菌条件下通过纵向皮肤切口暴露顶叶上方的颅骨，然后移除结缔组织。在颅骨上用电钻钻出一个小洞(直径< 2mm)，位置如下:前后(AP):耳间:17mm;中外侧(ML):−2 mm。然后将长度为40mm (21 gauge, New England Small Tube Corporation, USA)的不锈钢管插入右侧脑室(背腹侧(DV)深度为18 - 22mm)。通过观察脑脊液流出或脑脊液在孔处的脉动来判断穿刺是否成功。然后将不锈钢管的外部部分固定在颅骨上，用钛钉固定复合牙科水泥。 After the operation, each monkey was intramuscularly injected with penicillin (1600 K Unit, Harbin Pharmaceutical Group Sixth Pharm Factory, Harbin, China) for at least seven days. All animals were allowed to recover after the surgery for more than two weeks.

每只猴子都收到了每次注射200 μL体积5% (v/v)甲醇和0.9% (w/v)生理盐水进入侧脑室，持续15分钟。注射后，将针在患处固定5分钟。甲醇购自Sigma(美国)。

2．2．CSF集合

为了确定单次脑室甲醇注射后脑脊液中FA水平是否升高，在给药后0、3、6、12、18、24和30小时收集甲醇注射动物的脑脊液。0hr为甲醇注入前的点。动物被氯胺酮麻醉(10 mg/kg)，使用22号针通过腰椎穿刺抽出约0.5 mL脑脊液。然后立即将脑脊液样本冷冻在液氮中，然后转移并保存在−80℃冰箱中直到分析。

2.3。CSF甲醛测量

根据制造商的指示（生物测定系统，海沃德，美国，美国），用DFOR-100甲醛检测试剂盒测量单甲醇注射后CSF中的甲醛水平。简而言之，在测定之前，CSF样品被剥离和中和。剥夺CSF样品，50 μ每100份中加入L的10% TCAμL样本。将每个样品旋转，14000 rpm离心5 min;100年μ将L清上清转移到一个干净的管中，与25混匀μL的中和剂。样品(50μL)与DFOR试剂混合30分钟，然后在FlexStation 3多模式酶标仪中检测:= 370海里;= 470 nm。

2．4．统计数据

所有统计分析均采用GraphPad Prism 5软件进行。脑脊液中的甲醛水平通过重复测量的方差分析，然后进行Tukey’s组间差异检验。显著性水平为。

3.结果

为了在甲醇注射之后探讨颅内发育的升高，允许猴子的CSF样品在给药前（指出为0“点）和3,6,12,18,24和30小时后注射。然后使用甲醛测量试剂盒测量FA水平。甲醇处理后CSF的FA水平显示出趋势的增加，与注射后18和24小时的基线相比，达到突出差异（图24小时）（图1）.升高的FA水平在30小时后恢复到正常的生理水平(图1）.这些结果表明，内源性甲醇代谢导致了甲醇处理猴子脑内FA水平的升高。

4.讨论

甲醇是一种危害人类健康的天然化学物质。它存在于香烟烟雾、水果和蔬菜罐头以及阿斯巴甜的食品中[20.)，以及在无意中或犯罪地用甲醇代替酒精的饮料中[8.］．虽然已经发现甲醇会引起中枢神经系统功能障碍[4.那11.和神经退行性疾病[2那3.那19.]，其对大脑毒性的机制仍然是灵长类动物的含量。本研究证明，甲醇可以在灵长类的大脑中氧化成Fa，并且产生的一部分产生的Fa泄漏出来的细胞。这表明由甲醇产生的Fa不仅影响甲醇代谢而且可能影响周围组织的细胞。值得注意的是，CSF中的甲醛水平呈现出逐步增加的趋势，在直接I.C.v之后始于3小时。注射甲醇，尽管在18小时后仅发生了FA水平的显着高度。FA水平第一次显着高程的时间流逝依赖于（a）样品数量;（b）甲醇扩散速度进入脑组织;（c）脑组织的代谢能力和速度氧化甲醇至FA;（d）生产FA至周围分子的反应性;（e）来自生产点的FA的扩散速度为CSF。 Moreover, these results are consistent with formic acid data measured in primates, which suggests that methanol metabolism in the primate brain undergoes oxidation from methanol, via FA, to formic acid and carbon dioxide. FA is a significant consideration for human health because its toxicity is due to its high reactivity. FA readily attaches to proteins forming adducts or causes protein cross-linking by forming methylene bridges between amino groups [29.那30.并能够破坏DNA [31.］．升高的Fa涉及一些神经变性疾病。例如，已经发现患有患者的患者的升高的FA水平，例如阿尔茨海默病（AD）或多发性硬化症（MS）患有神经变性疾病的患者[22.-24.]，其中Fa是已知的交联蛋白质（如AD）或髓鞘碱性蛋白质（MBP，MS），这反过来导致蛋白质失去其正常功能并引发疾病特征的免疫应答[20.那24.］．值得注意的是，一些人在甲醇中毒后出现MS症状，这可能与大脑中甲醇氧化成FA导致反应性FA修饰MBP结构和功能有关[19.］．

尽管毫无疑问，FA是在甲醇给药后产生的，但它并不被认为是甲醇外围的有毒代谢物。这主要是由于给药后血液中检测不到FA。这种有限的检测可能是由于它在肝脏中对甲酸的快速代谢[32.]血液[1]因此，由于静脉注射后，Fa在猴子的血液中具有大约1.5分钟的半衰期[21.］．这表明甲醇通过FA向外周甲酸的代谢是快速的，甲醇毒性在外周和大脑中可能具有不同的机制。发现甲醇在大脑中转化为FA，并在脑脊液中发现18小时后，甲醇毒性可能通过FA对中枢神经系统产生有害影响。

5.结论

总之，在单一甲醇注射之后在本研究中发现了颅内Fa的升高，这是非人类灵长类脑中的甲醇氧化对FA的第一次证明。该研究将甲醇的毒性与其代谢物，FA和/或甲酸的毒性联系起来。

相互竞争的利益

作者声明没有相互竞争的经济利益。

作者的贡献

翟荣伟和郑娜对这一工作做出了同样的贡献。

致谢

国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(no. 2015CB755605, no. 2012CB825503, no. 2012CBA01304);中国科学院战略性先导研究计划;XDB02020005，中国科学院重点研究计划，国家高技术研究发展计划(863计划2012AA0207010)，中国科学院重点计划前沿科学重大突破项目(KZCC-EW-103-2)，国家自然科学基金重大专项(91332120)、国家自然科学基金(81471312、31271167、81271495)和云南省“百名海外优秀人才引进计划”资助项目。

参考文献

1. J. Lieivuori和H. Savolainen，“甲醇和甲酸毒性：生化机制”药理学和毒理学，第69卷，不。3，页157-163,1991。视图:出版商网站|谷歌学术
2. A. A. Manuchehri, E. Alijanpour, M. Daghmechi等人，“一例甲醇中毒导致长时间依赖呼吸机，进而失明和不可逆转的脑损伤，”凯斯宾内科杂志，第6卷，第4卷。3，页180-183,2015。视图:谷歌学术
3. S. Zakharov, D. Pelclova, P. Diblik等人，“急性甲醇中毒后的长期视力损害:50例患者的纵向横断面研究”临床毒理学，卷。53，不。9，pp。884-892,2015。视图:出版商网站|谷歌学术
4. T. G.Murray，T.C.Burton，C.Rajani，M. F. Lewandowski，J.M. Burke和J.T. Eells，“甲醇中毒”。具有视网膜受累的结构和功能证据的啮齿动物模型，“眼科档案馆，卷。109，没有。7，pp。1012-1016，1991。视图:出版商网站|谷歌学术
5. H. R. Wallage和J.H.Watterson，“甲醇和甲醇浓度在死亡调查中”分析毒理学杂志第32卷，第2期。3，pp。241-247,2008。视图:出版商网站|谷歌学术
6. E.-S.Lee，H.陈，C. Hardman，A.Imm和C.Charlton，“过量的S-腺苷-1-甲硫氨酸依赖性甲基化增加了大鼠脑纹状体匀浆中甲醇，甲醛和甲酸的水平：S中可能的作用-Denosyl-L-蛋氨酸诱导的帕金森病如疾病，“生命科学，第83卷，第2期。25-26，第821-827页，2008。视图:出版商网站|谷歌学术
7. K. Tulpule和R. Dringen，《大脑中的甲醛:神经退行性变中被忽视的角色?》神经化学杂志第127卷，没有。1, pp. 7-21, 2013。视图:出版商网站|谷歌学术
8. M. Pohanka，《毒理学与甲醇和乙醇的生物学作用:当前观点》生物医学论文, 2015年。视图:出版商网站|谷歌学术
9. T. Koivula和M. Koivusalo，“大鼠肝醛脱氢酶的不同形式及其亚细胞分布”，生物化学和生物物理学报(BBA) -酶学，第397卷，no。1，第9-23页，1975。视图:出版商网站|谷歌学术
10. F. C. jolin, C. S. Fortman, D. D. Nghiem, T. R. Tephly，“叶酸和叶酸依赖酶在人类甲醇中毒中的作用研究”，分子药理学第31卷，不。5, 557-561页，1987。视图:谷歌学术
11. J. N. Sweeting, M. Siu, G. P. McCallum, L. Miller, P. G. Wells，“小鼠、兔和灵长类动物中甲醇和甲酸药代动力学的物种差异”毒理学和应用药理学第247卷，否。1，第28-35页，2010。视图:出版商网站|谷歌学术
12. D. jacobsen和K.e.Mcmartin，“甲醇和乙二醇中毒。毒性，临床课程，诊断和治疗机制，“医学毒理学和药物不良经历，卷。1，不。5，pp。309-334,1986。视图:谷歌学术
13. K.E.Mcmartin，J.J.Ambre和T.R.T.T.T. T.“人类受试者中的甲醇中毒。代谢酸中毒中甲酸积累的作用，“美国医学杂志，卷。68，没有。3，pp。414-418，1980。视图:出版商网站|谷歌学术
14. K. E. McMartin, G. Martin-Amat, A. B. Makar, T. R. Tephly， "甲醇中毒"五、猴子体内甲酸盐代谢的作用药理与实验治疗学杂志第201卷，没有。3，第564-572页，1977。视图:谷歌学术
15. J.T. Eells，K.A.Black，C.E.Tedford和T.T.T.T.T.T.T.T.猴子中的甲醇毒性：氧化亚乙基和蛋氨酸的作用，“药理与实验治疗学杂志，卷。227，没有。2，pp。349-353,1983。视图:谷歌学术
16. J.A. Sharpe，M. Hostovsky，J.M. Bilbao和N.B.Rewcastle，“甲醇视神经病变：组织病理学研究”神经学第32卷，第2期。10，pp。1093-1100,1982。视图:出版商网站|谷歌学术
17. G. Martin-Amat, T. R. Tephly, K. E. McMartin等人，“甲醇中毒”。2“利用恒河猴建立甲醇中毒眼部毒性模型，”眼科档案馆，卷。95，没有。10，pp.1847-1850,1977。视图:出版商网站|谷歌学术
18. G. Martin-Amat, K. E. McMartin, S. S. Hayreh, M. S. Hayreh, T. R. Tephly，“甲醇中毒:甲酸盐引起的眼部毒性”毒理学和应用药理学，第45卷，第4期。第201 - 208,1978页。视图:出版商网站|谷歌学术
19. 慢性甲醇中毒伴多发性硬化症的临床和病理解剖特征医学假设第13卷，没有。1, 63-75页，1984。视图:出版商网站|谷歌学术
20. W. C. Monte，虽然科学睡眠：甜味剂杀死，创建空间出版，旧金山，加利福尼亚州，2011年。
21. K. E.McMartin，G. Martin-Amat，P. E. Noker和T.T.T. T.T. T.T. T.T. T. T.T. T.T.T. T.T. T. T.T. T. T.T. T. T.T. T. T.T. T. T.T. T.T.T. T. T.T. T. T. T.T. T.T. T.T. T. T. T.T. T. T. T.T. T.T. T.T. T.T. T. T.T. T.T. T.T.T.T.T. T.T. T.T.T.T. T.T.T. T.T. T.T. T. T. T.T. T.T. T.T. T.T. T. T.T.T. T.T. T.T. T. T.T. T.T. T.T. T. T. T.T. T. T.T. T.Otephly，“缺乏对猴甲醇中毒的甲醛中毒的作用”生物化学药理学第28卷，第2期。5，页645-649,1979。视图:出版商网站|谷歌学术
22. 佟哲，韩昌，罗文等，“海马甲醛累积导致年龄依赖性记忆衰退，”年龄，卷。35，不。3，pp。583-596,2013。视图:出版商网站|谷歌学术
23. Z. Q. Tong，J.L. Zhang，W.H.L.Luo等，“尿甲醛水平与老年痴呆症的迷你精神状态检查分数与迷你精神状态检查分数相反，”神经生物学衰老的第32卷，第2期。1，页31-41,2011。视图:出版商网站|谷歌学术
24. Lu J.， Miao J.， Su T.， Liu Y.， and R. He，“甲醛诱导Tau蛋白在体内外的过度磷酸化和聚合，”Biochimica et Biophysica Acta（BBA） - 一般性受试者，第1830卷，第3期。8, pp. 4102-4116, 2013。视图:出版商网站|谷歌学术
25. Yang m, Lu j, Miao j, et al.，“阿尔茨海默病和甲醇毒性(第一部分):慢性甲醇喂养导致小鼠记忆损伤和tau蛋白过磷酸化，”阿尔茨海默病杂志，卷。41，没有。4，pp。1117-1129,2014。视图:出版商网站|谷歌学术
26. J. D. Rizak，Y.Ma和X. Hu，“甲醛缺少广告病理的缺失链接吗？淀粉样蛋白β与atpoe同种型的差异聚集，“目前老年痴呆症研究，卷。11，不。5，pp。461-468,2014。视图:出版商网站|谷歌学术
27. J.Van Horssen，G.Schreibelt，J. Drexhage等，“多发性硬化病变中的严重氧化损伤与增强的抗氧化酶表达一致”自由基生物学和医学，第45卷，第4期。12页，1729-1737,2008。视图:出版商网站|谷歌学术
28. J.-H.王，J.D .Rizak，Y.-M。陈，L.LI，X.-T.胡，y.-y.马，“吗啡和多巴胺能化合物在恒河猴中的空间工作记忆中的”交互式作用“，”神经科学通报第29卷第2期。1, 37-46页，2013。视图:出版商网站|谷歌学术
29. B. Metz，G. F. A. A. Kersten，P. Hoogerhout等，“鉴定甲醛诱导的蛋白质修饰：与模型肽的反应，”生物化学杂志，卷。279，没有。8，pp。6235-6243，2004。视图:出版商网站|谷歌学术
30. B. Metz，G.F. A. kersen，G.J.E.Baart等，“鉴定甲醛诱导的蛋白质修饰：与胰岛素的反应”，“生物杂本化学，卷。17，不。3，PP。815-822,2006。视图:出版商网站|谷歌学术
31. R.C.Grofstrom，A.J.Fornace Jr.，H. Autrup，J.F. Lechner和C.C.C.Harris，“对DNA的甲醛损伤和人支气管细胞中的DNA修复损伤”，“科学，卷。220，没有。4593，第216-218,1983。视图:出版商网站|谷歌学术
32. E. skrzydlewska，“甲醇中毒的毒理学和代谢后果，”毒理学、机制与方法第13卷，没有。4，页277-293,2003。视图:出版商网站|谷歌学术

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