膜联蛋白A3击倒抑制肺腺癌

文摘

我们先前的研究发现大量的膜联蛋白升高A3 (Anxa3)作为小说的肺腺癌预后的生物标志物(LADC)通过定量蛋白质组学分析。然而,生物功能的Anxa3 LADC并不完全清楚。在这项研究中,在体外和在活的有机体内化验进行调查的影响增长,差别Anxa3对这些移民,入侵,转移,LADC细胞的信号通路激活。后,差别Anxa3对这些A549的生长和LTEP-a2 LADC细胞被放慢,他们表现出减少迁移和入侵在体外。Anxa3击倒显著抑制A549细胞肿瘤形成在活的有机体内;虽然许多转移形成的控制A549细胞,肺的数量有明显的减少,肝脏和脑转移由Anxa3击倒在A549细胞。此外,Anxa3击倒显著降低MMP-2 N-cadherin表达式和增加钙粘蛋白表达的细胞株在体外和在肿瘤结节检查在活的有机体内肿瘤发生的化验。有趣的是,减少差别Anxa3对这些MEK和ERK的磷酸化水平。总之,Anxa3击倒抑制了增长,移民、入侵和转移LADC,减少MEK / ERK信号通路的激活和调制MMP-2的表达,钙和N-cadherin。

1。介绍

肺癌的发病率快速增长,全球癌症死亡的首要原因,每年导致超过130万人死亡(1]。特别是,肺腺癌(LADC),最常见的非小细胞肺癌亚型,占肺癌发病率的40% (2]。尽管分子诊断和靶向治疗的发展,平均5年生存率LADC约15%,主要是因为癌细胞转移和缺乏有效的晚期治疗3]。因此,迫在眉睫的是更好地了解调节的分子机制LADC的致癌作用和转移。

在我们之前的研究中,膜联蛋白A3 (Anxa3)被认定为小说metastasis-related在LADC使用定量蛋白质组学,蛋白质和其高表达被发现与淋巴结转移相关,高级阶段,肿瘤复发,预后不良4,5]。然而,致癌作用的生物角色Anxa3 LADC进展的不完全理解和需要进一步研究。

Anxa3属于膜联蛋白家族,这是由高度丰富的胞内蛋白calcium-dependent磷脂绑定活动(6]。最近的研究表明,Anxa3可能作为肿瘤促进剂或抑制在不同癌症7,8]。发现,upregulation Anxa3表达可能促进结肠癌和胃癌的发展9- - - - - -11LADC[],提高转移性活动12]。然而,在前列腺癌和肾癌,表明有一个关系和差别Anxa3对这些肿瘤细胞发展(13]。据报道,Anxa3的表达呈正相关,ki - 67和bcl - 2表达在胃癌(11]。在肝细胞癌,Anxa3-mediated癌症干细胞样细胞活动的维护是最有可能涉及HIF-1透露α/ Notch通路(14]。多个证据表明Anxa3表达可能是一个潜在的预后标记肿瘤病人和肿瘤发展的风向标,入侵和转移。

我们之前的研究阐明LADC Anxa3表达和临床病理因素之间的关系;然而,它的生物角色LADC仍不完全清楚。在这项研究中,LADC细胞系与稳定击倒Anxa3表达式建立了和他们的行为进行调查在体外。然后,Anxa3击倒细胞的能力进行肿瘤的形成和转移在活的有机体内在裸小鼠评估。此外,影响的关键信号通路的激活和差别Anxa3对这些基因的表达一些LADC-associated分子也被调查。的生物功能,在LADC Anxa3全面探索了在这个研究。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和转染的shRNA向量

人类LADC细胞系A549和LTEP-a2获得中国医学科学院(中国上海)。细胞生长根据标准条件。Anxa3击倒向量(shAnxa3)和控制向量是由GeneChem(上海,中国)。目标序列在Anxa3基因5′亚美大陆煤层气有限公司AGA TTA AGA CTT条t - 3′移行细胞癌,这是查询使用RNAi财团的图书馆数据库(http://www.broadinstitute.org/rnai/public/gene/search)。小发夹RNA(成分)序列目标Anxa3 5′gta AGA手枪答CCA广汽TTT CTC GAG AAA GTC TGG ATA ATC TCT TAC-3′。shRNA序列克隆到GV102向量与增强型绿色荧光蛋白和由此产生的身份构建被测序验证。A549和LTEP-a2细胞转染shAnxa3或控制向量使用Lipofectamine®2000转染试剂(技术)和G418添加选择转染细胞如前所述[15]。Anxa3 mRNA和蛋白水平的稳定转染细胞系都检测到定量PCR (qPCR)和免疫印迹,分别。

2.2。MTT试验

MTT试验用于检测细胞的可行性。简单,细胞被播种到96——文化板块2000细胞/。孵化后,20μL MTT(5毫克/毫升;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)被添加到培养基和肿瘤细胞培养4 h在37°C。媒介是小心翼翼地丢弃,然后150年μL二甲亚砜(Sigma-Aldrich)被添加到每个好后跟混合溶解甲瓒晶体震动为10分钟。接下来,测量每个在490纳米波长的吸光度绘制的曲线增长。

2.3。集落形成实验

集落形成试验进行了如我们之前所述研究[15]。总之,细胞被播种密度500细胞/在6-well文化板块和培养大约两个星期。然后,媒介是丢弃和磷酸盐(PBS)细胞被洗两次。然后,细胞被固定在甲醇与结晶紫染色。殖民地已超过50个细胞在显微镜下计算。然后殖民地的数量的比例较对照组进行了计算。

2.4。伤口愈合实验

擦伤的伤口愈合实验,subconfluent每组细胞刮使用消毒10μL吸管技巧,用PBS洗净,在正常培养基培养。观察伤口愈合在CKX41倒置显微镜(奥林巴斯公司(日本东京)和图像每天被抓获。

2.5。入侵检测

入侵检测进行了使用Transwell®钱伯斯(美国纽约康宁公司康宁)与基底膜基质®(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)涂布过滤器由美国(如前所述16]。细胞与基底膜基质涂层添加到插入过滤器。DMEM含有10% (v / v)的边后卫在下院被化学引诱物。孵化后,noninvading细胞上的膜被棉签和入侵细胞被固定和染色为0.1% (w / v)结晶紫。

2.6。免疫印迹

简单地说,30μg蛋白溶菌产物的每个样本被钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳分离10% (v / v)聚丙烯酰胺凝胶和转移到聚偏二氟乙烯膜。细胞膜主要抗体孵育过夜在4°C如下:anti-Anxa3(稀释,1:800;Abnova、台北、台湾),anti-Anxa1 (1: 1000;美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX), anti-Anxa2 (1: 1000;研发系统,明尼阿波利斯,美国),anti-MEK1/2 (1: 1000;细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),anti-phospho-MEK1/2 (1: 1000;细胞信号技术)、anti-ERK1/2 (1: 1000;细胞信号技术)、anti-phospho-ERK1/2 (1: 1000;研发系统),anti-p38 MAPK (1: 1000;细胞信号技术),anti-phospho-p38 MAPK (1: 1000; Cell Signaling Technology), anti-Akt (1 : 1000; Cell Signaling Technology), anti-phospho-Akt (1 : 1000; Cell Signaling Technology), anti-IκBα(1:1000;细胞信号技术),anti-phospho-IκBα(1:1000;细胞信号技术),anti-matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) (1: 2000;细胞信号技术)、anti-E-cadherin (1: 800;圣克鲁斯生物技术)、anti-N-cadherin (1: 800;圣克鲁斯生物技术)、anti-GAPDH (1: 5000;研发系统)和反β肌动蛋白(1:5000;研发系统);和他们孵化anti-rabbit或鼠标辣根peroxidase-conjugated二级抗体。然后,这些墨迹开发使用增强化学发光检测系统(通用电气医疗集团,小都,白金汉郡,英国)和量化微用风暴™光学扫描仪ImageQuant™软件(通用电气医疗集团)。

2.7。实时qPCR

使用SV总RNA提取细胞总RNA隔离系统(WI Promega,麦迪逊,美国)根据制造商的指示,然后进行逆转录使用GoScript™逆转录系统(Promega)根据制造商的指示。然后,执行qPCR GoTaq®qPCR大师混合(Promega)根据制造商的指示使用ViiA™7检测系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。Gene-specific引物对人类Anxa1(向前:5′ggt广汽CGA TCT GAG GAC-3′,相反:5′CTG GTG GTA gg ATG GTA TT-3′), Anxa2(转发:5′CCA棉酚CCA ACC gg AGC-3′,相反:5′CTT GCG棉酚GTC ACC AGA-3′), Anxa3(转发:5′atc柠檬酸TGG TGG CCC TAG-3′,相反:5′att TGC CTG CTT GTC CTG-3′),和ACTB(转发:5′GTC ACC AAC TGG广汽广汽a - 3′,相反:5′cac AGC CTG手枪AGC AAC三大′)被设计使用引物5.0软件(美国总理Biosoft国际,帕洛阿尔托,CA)和合成Sangon生物技术公司(上海,中国)。每个PCR反应进行了一式三份。

2.8。肿瘤形成分析在活的有机体内

二十岁的雄性BALB / c裸小鼠大约6周来自中国科学院(中国上海)和在特定条件下培养的病原体。裸体小鼠随机分为两组(每组),两组治疗与A549 /控制和A549 / shAnxa3细胞,分别。皮下注射的A549 /控制或A549 / shAnxa3细胞(1×10⁷细胞/ 100μL PBS)进行的右翼裸体小鼠。通过测量长度()和宽度()每2天,肿瘤结节的体积计算的根据××0.5。6周后,小鼠死亡,肿瘤都是孤立的,体重,浸泡在福尔马林溶液进行进一步的研究。嵌入组织被切割成4μ通过免疫组织化学方法和分析部分。

2.9。免疫组织化学

肿瘤组织部分使用标准的免疫组织化学技术进行了分析。进行免疫组织化学染色技术,在我们之前的研究15]。短暂,肿瘤组织部分首先在4°C主要抗体孵育过夜,然后第二抗体孵育使用MaxVision™工具(Maixin有限公司、福州,中国)。免疫组织化学染色法是使用3 3′-diaminobenzidine试剂(Maixin有限公司)。PBS缓冲用于替换主要抗体-控制。

2.10。实验性转移模型在活的有机体内

二十岁的雄性BALB / c小鼠5周来自中国科学院(中国上海)如上所述。老鼠被随机分为两组(每组),治疗A549 /控制和A549 / shAnxa3细胞,分别。2×10⁶细胞被注入每个老鼠的尾巴外侧静脉。老鼠的身体重量测量每2天。大约45天后,所有老鼠死亡,器官包括肺、肝脏和大脑取出来检查发现为转移性肿瘤的形成。肿瘤结节的数量统计和器官在10% (w / v)福尔马林固定,然后嵌入在石蜡深造。

2.11。统计分析

软件SPSS 10.0(美国、IBM、纽约Armonk)申请在本研究统计分析。所有的实验都重复3次。不同的被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。Anxa3击倒抑制LADC增长在体外

阐明生物角色LADC Anxa3的稳定转染细胞系A549 / shAnxa3, LTEP-a2 / shAnxa3 A549 /控制和LTEP-a2 /控制构造。如数据所示1(一)-1(c), Anxa3信使rna和蛋白质水平A549 / shAnxa3和LTEP-a2 / shAnxa3细胞明显减少与相应的控制细胞相比,虽然Anxa1的mRNA和蛋白水平和Anxa2,这属于相同的膜联蛋白家族Anxa3, shAnxa3和控制细胞之间没有显著差异。然后,下调后的增长能力Anxa3进一步检测。MTT检测结果显示显著减少可行的A549 / shAnxa3细胞培养和LTEP-a2 / shAnxa3细胞的第二天第三天,相比与相应的控制和零细胞每一天,分别为(数字1(d)和1(e))。集落形成实验分析显示更少的殖民地A549 / shAnxa3和LTEP-a2 / shAnxa3细胞比相应的控制和零细胞(数字1(f)和1(g))。这些结果表明,击倒Anxa3表达可以显著抑制LADC细胞的生长在体外。

3.2。Anxa3击倒显著抑制LADC细胞的迁移和入侵

调查的效果上差别Anxa3对这些LADC的迁移和入侵在体外、伤口愈合和入侵检测进行。如图2(一个)执行抓伤后的第四天,A549 /控制的抓痕和A549 /空细胞几乎已消失,而细胞A549 / shAnxa3没有愈合。LTEP-a2抓伤口愈合的细胞表现出相同的变化Anxa3击倒的A549细胞(图2 (b)),这表明击倒Anxa3表达持续和显著抑制LADC细胞的迁移。入侵检测结果(数据2 (c)和2 (d))的数字显示,细胞入侵到A549 / shAnxa3和LTEP-a2 / shAnxa3组明显低于相应的控制和裸细胞组。这些结果表明,LADC细胞的入侵能力。差别显著减少Anxa3对这些

3.3。Anxa3击倒在LADC细胞改变的效应分子的表达

上述结果表明,Anxa3表达的差别,对这些显著抑制LADC细胞的迁移和入侵。基质金属蛋白酶、钙粘蛋白和N-cadherin是众所周知的癌细胞的迁移和入侵的监管机构,和MMP-2是最高度表达的MMP的肺癌。因此,我们调查MMP-2的表达、钙和N-cadherin Anxa3击倒后LADC细胞。如数据所示3(一)-3(c),与之相比,控制和空细胞,shAnxa3细胞显著降低MMP-2 N-cadherin表达式和钙粘蛋白表达显著升高。结果表明,表达下调Anxa3表达式减少MMP-2和N-cadherin表达式但LADC细胞钙粘蛋白表达增强。

3.4。Anxa3击倒MEK / ERK通路激活在LADC细胞减少

在LADC探索Anxa3的生物角色,我们分析了几个重要的癌症相关的信号通路的激活的变化引起的。差别Anxa3对这些在数据显示3(d) -3(f),在A549细胞,MEK1/2的磷酸化,ERK1/2 Akt,我κBα后显著降低,差别Anxa3对这些没有变化在p38 MAPK的磷酸化。然而,在LTEP-a2细胞,只有MEK1/2的磷酸化水平和ERK1/2被Anxa3击倒显著降低,而Akt,我κBα,p38 MAPK也没有改变。这些结果表明,表达下调Anxa3表达式灭活MEK / ERK通路在A549和LTEP-a2 LADC细胞系,这表明MEK / ERK通路是LADC Anxa3的目标。

3.5。Anxa3击倒抑制LADC肿瘤形成在活的有机体内

的化验在体外如上所述显示击倒的Anxa3表达可以抑制LADC细胞的生长。接下来,我们进一步阐明对肿瘤形成的影响在活的有机体内通过下调Anxa3表达式。因此,肿瘤的生长(图的曲线4(c))显示,肿瘤体积的A549 / shAnxa3组相比明显减少与A549 /对照组注射后25天左右。和肿瘤结节与A549 /对照组明显大于这些A549 / shAnxa3组(图4(b))。此外,大多数的肿瘤结节A549 /对照组显示坏死,明显是棕色的颜色表面的结节(图4(a))。统计分析发现,A549 / shAnxa3组的平均肿瘤体积明显小于A549 /对照组,就意味着肿瘤重量(图4(d))。这些结果表明,推倒Anxa3表达抑制肿瘤形成在活的有机体内。然后,我们做了肿瘤结节部分验证MMP-2,钙和N-cadherin表达改变。免疫组织化学结果发现几乎没有Anxa3表达式中检测出肿瘤结节shAnxa3集团证实击倒的Anxa3成功维护在活的有机体内。此外,MMP-2的表达和N-cadherin钙粘蛋白的减少而增加在A549 / shAnxa3肿瘤(图4(e)),类似于细胞系中所示的结果在体外。此外,我们分析了扩散标记,ki - 67表达的肿瘤结节。发现ki - 67 shAnxa3肿瘤中表达明显低于控制肿瘤,这进一步证实可能差别Anxa3对这些抑制LADC的生长。

3.6。Anxa3击倒显著抑制LADC转移在活的有机体内

具有代表性的照片在肝转移瘤结节的控制和shAnxa3组如图4(f)。肝转移瘤结节的数量的shAnxa3组明显低于对照组。直方图分析肺转移瘤结节,肝和大脑的控制和shAnxa3组织图所示4(g),与对照组相比,肺转移瘤结节的数量,shAnxa3组的肝脏和大脑都显著降低。这些结果表明,Anxa3击倒有效抑制LADC细胞转移在活的有机体内。

4所示。讨论

在这项研究中,在A549和LTEP-a2 LADC细胞系,可行的细胞集落形成明显下降。差别Anxa3后对这些此外,调查在活的有机体内肿瘤发生分析还表明,注射LACD细胞裸鼠肿瘤形成的A549 / shAnxa3组不如对照组小鼠A549 /。这些结果表明,Anxa3击倒LADC有力地抑制了增长在体外和在活的有机体内。此外,裸体小鼠的肿瘤shAnxa3组显示减少ki - 67的表达与对照组的小鼠相比,表明在LADC Anxa3影响细胞增殖。此外,据报道Anxa3是呈正相关的表达与ki - 67表达在胃癌(11]。上述结果表明,Anxa3在癌症细胞生长起着至关重要的作用。

此外,本研究发现shAnxa3细胞的迁移和入侵显著降低与控制或空的细胞。实验中使用在活的有机体内转移模型表明,转移瘤结节的数量在器官包括肝、肺、脑shAnxa3组与对照组相比均有显著减少。上述结果表明,会抑制差别Anxa3对这些迁移,LADC细胞的入侵和转移。同样,玉等人报道,沉默内生Anxa3抑制增殖、迁移和入侵胃癌细胞(17]。正如我们所知,MMP-2、粘附和N-cadherin效应分子与肿瘤的迁移和入侵的关键角色(18- - - - - -20.]。在差别的影响因此,Anxa3对这些基因的表达这些分子的进一步调查。有趣的是,在细胞系在体外并从裸体小鼠肿瘤结节在活的有机体内,表达下调Anxa3表达显著减少MMP-2 N-cadherin表达式和钙粘蛋白表达增加。结合,上述结果表明,表达下调Anxa3表达式可能抑制的迁移,入侵和转移LADC通过减少MMP-2 N-cadherin表达式和增加钙粘蛋白的表达。

我们也调查了潜在的癌症相关的信号通路调控Anxa3通过筛查后改变了一些常见的信号分子的表达。差别Anxa3对这些减少的磷酸化MEK1/2 ERK1/2, Akt,和我κBα后被检测到表达下调Anxa3 A549细胞中表达。然而,只有MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平降低,差别Anxa3后对这些基因的一种蛋白激酶的磷酸化,我κBα,p38 MAPK在LTEP-a2细胞并没有改变。这些结果表明,表达下调Anxa3表达有效减少MEK / ERK通路的激活LADC细胞,在细胞生长中扮演重要角色,入侵和生存在各种类型的癌症21]。然而,Akt的原因,我κBα,p38 MAPK A549细胞和LTEP-a2细胞之间表现出不同的变化可能被进一步研究。从所有的结果,我们推测,推倒Anxa3表达式可能抑制经济增长,移民,LADC入侵和转移,这些行动可能是通过抑制介导MEK / ERK通路的激活。需要进一步的研究来证实和阐明这种潜在的机制。

综上所述,本研究阐明生物功能的Anxa3 LADC致癌作用和发展,并进一步揭示其作为监管机构的某些效应分子的表达如MMP-2、钙和N-cadherin MEK / ERK通路的激活。研究结果表明,在LADC Anxa3扮演关键角色;因此,它可能是一个新的治疗目标。

伦理批准

在这项研究中,所有动物的程序进行的动物实验伦理委员会批准厦门大学。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81101764)和中国的福建省自然科学基金(2015 j01349)。

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