在活的有机体内流式细胞术的循环肿瘤相关液

文摘

循环肿瘤细胞(ctc)展示了潜在的预后转移发展的标志。然而,无法治愈的转移已经可以开发的初始诊断与现有CTC化验。另外,肿瘤相关粒子(茶多糖),包括液可以是一个更有价值的预后标志,因为他们可以从原发肿瘤被释放之前ctc和更大的数量。然而,进展甚微的高灵敏度检测茶多糖,特别是在活的有机体内。我们在这里展示在活的有机体内集成光声(PA)和荧光流式细胞术(PAFFC)平台可以提供检测黑色素瘤和breast-cancer-associated单一茶多糖与内生表示黑色素和基因工程蛋白质或外源性染色PA和荧光造影剂。双梁,time-of-light PAFFC可以测量CTC和茶多糖并确定批量的大小和滚动CTC CTC集群,对血液流动不稳定性没有影响。这种技术揭示了茶多糖的浓度高于ctc在癌症早期阶段。因为单个肿瘤细胞可以释放许多茶多糖和在活的有机体内PAFFC可以检查整个血容量,PAFFC诊断平台有可能大大提高(10⁵倍)癌症诊断的敏感性。

1。介绍

大多数死于癌症(90%)结果从转移,没有有效的治疗方法1- - - - - -5]。表现在我们和其他实验室的研究展现出巨大潜力的循环肿瘤细胞(ctc)的预后标记转移发展和治疗效果6- - - - - -14]。目前先进的CTC化验(例如,CellSearch和微流控芯片CTC) (10)提供了许多生物的发现,包括CTC异质性高,肿瘤起源和休眠细胞,CTC epithelial-mesenchymal过渡,和CTC-emboli高转移性活动。然而,尽管巨大的努力开发新的CTC化验,所有现有技术的局限是固有的低灵敏度的检测在1 - 10 CTC /毫升,这主要是由于抽样的小血容量(1 - 10毫升)。因此,现有的CTC化验可以错过10³-10年⁴ctc(即。,99.9% of CTCs) in the entire blood volume, one of which could easily drive metastatic progression to an incurable stage before CTCs can be detected with existing assays [10]。因为现有的CTC化验不能提供足够的癌症早期诊断,可能太晚了治疗病人初始测试的时候。

除了ctc,肿瘤分泌细胞外囊泡,包括液、纳米颗粒和微粒子集体会将这里称为循环肿瘤相关粒子(茶多糖),港口可以与当地和转移性肿瘤细胞签名过程(例如,膜蛋白和微rna) [15- - - - - -32]。特别是,与典型尺寸的30 - 300 nm液endosomal起源(15100 nm-1],而微粒,包括微泡µ米大小,直接从质膜(被释放33]。因为茶多糖可以释放的主要肿瘤之前ctc而且要丰富得多,茶多糖有潜力成为一个有价值的预测工具。单个肿瘤细胞可能产生成千上万的茶多糖。因此,不同于ctc,茶多糖可以存在于血浆浓度很高(例如,在某些情况下茶多糖/毫升与1 - 10²ctc /毫升),也可以用作标记nonmetastatic癌症当没有ctc存在于血液。茶多糖细胞数量之间的交通还可以帮助创造重要premetastatic利基市场(19]。

然而,在评估进展甚微的茶多糖的诊断价值,因为许多挑战与他们的小尺寸(30 nm-1有关µ米),生物多样性(即。,origins, structures, functions, biogenesis, and secretion mechanisms), and the limitation of detection methods [23- - - - - -32]。例如,在不同的检测方法(例如,rt - pcr、血细胞计数,拉曼显微镜,和透射电子显微镜(TEM)),免疫印迹和化学发光ELISA展示了最好的检测限制10⁵-10年⁷茶多糖(液)的样本只有几毫升。一个新的nanoplasmonic传感器改进这个极限3000茶多糖(29日),它仍然是~ 10³CTC倍低于阈值(~ 1 CTC /毫升)。总之,没有方法,目前存在流通中的茶多糖的选择性探测和识别在活的有机体内。但是,最近的进步发展的多模光声(PA)和荧光流式细胞术(PAFFC) [34- - - - - -41)提供了一个独特的诊断平台直接在血液中检测和识别茶多糖。这个平台提供了机会的考试几乎整个体积的血液(最多3 - 5 L)。这允许一个戏剧性的增加样本容量,因此机会发现罕见的循环疾病有关的标记,相比传统的血液测试涉及几毫升的血液样本。CTC和CTP检测可能显著(100 - 1000倍)的敏感性增加在活的有机体内流式细胞术由于肿瘤的潜在能力释放多达1000倍比ctc茶多糖。在这里,我们证明这个概念的第一证据使用在活的有机体内流式细胞术检测平台的茶多糖在疾病早期阶段。

2。材料和方法

2.1。光声(PA)流式细胞仪和荧光流式细胞术(PAFC、FFC Resp)。平台

PAFC、FFC以及它们的集成(PAFFC)详细描述其他地方(34- - - - - -42]。简单地说,一个或多个激光束直接照射一个循环对象血液流动。这个生产PA波浪或荧光光(称为PA和荧光信号)与超声波检测传感器和光电探测器,分别(图1(一))。皮肤和许多红细胞(RBC)检测卷创建常量背景信号。(即可以被探测到,个人目标。,CTCs and CTPs) must have higher localized absorption and fluorescence than background signals. The integrated PAFFC setup was based on Nikon Eclipse E400 microscope platform (Nikon Instruments Inc., USA) with a high pulse repetition rate (10 kHz) nanosecond (0.6–8 ns) lasers operating at 532 nm and 820 nm (LUCE 532, LUCE 820, and Bright Solutions, resp.) for PA detection of CTPs with endogenously expressed melanin or labeled with nanoparticles as PA contrast agents and a continuous wave 488 nm laser diode (Power Technologies, Alexander, AR) for fluorescence detection of CTPs expressing green fluorescence protein (GFP) or labeled with fluorescence tags. Laser beams were focused on sample into a 6 µm×60µm线使用柱面透镜和40 x目标(计划萤石,NA 0.65;尼康仪器)。相同的目的收集了绿色荧光蛋白的荧光或荧光标签。PA的信号被超声波传感器检测到循环对象(模型6528101,3.5 MHz, 5.5毫米直径;法国贝桑松Imasonic Inc .),然后放大(5662 b放大器模型,50 kHz-4 MHz;Panametrics)。收集信号,设置是配备了一个模拟-数字转换器董事会(pci - 5124,国家仪器、奥斯汀、TX)使用自定义控制虚拟仪器软件。PA信号采样与12位分辨率200样本/ s。荧光信号的光电倍增管的速度采样4兆赫和downsampled 10 kHz,平均400分。所有的数据提出了信号振幅的痕迹,形状和宽度为每个瞬态峰值超过背景值与定制的软件进行了分析。

2.2。在体外PAFFC ctc和茶多糖的分析

在体外PAFFC是用于验证在活的有机体内数据,因为有更高的灵敏度在体外由于低光衰减、自体荧光吸收背景,控制流参数和样品稀释排除从密切位于对象重叠峰。具体地说,在体外茶多糖的分析和执行ctc在50和100µ米(证件)平方石英毛细管磷酸盐(PBS)或血液。1 - 5 mm / s的流速控制注射泵(图1 (b))。确保只有一个细胞/粒子体积检测一次,正常细胞或微粒的溶液稀释。PA和荧光信号检测通过毛细血管壁使用集成PAFFC系统如上所述。PA和荧光痕迹进行分析来确定瞬时增加PA或荧光信号振幅在短时间窗口(通常~ 0.5 ms)。二维散点图构造与每个对象PA信号幅度与荧光强度呈现为一个单一的点。

2.3。在活的有机体内流式细胞仪使用双光束飞行时间图表

飞行时间流式细胞仪技术的原则优先使用一个激光束被报道之前(38- - - - - -40]。简而言之,在修改后的示意图,CTP或CTC遍历两个线性激光血管(图1 (c))由一个固定的距离分开(20 - 40µ米)。在经过每个激光流中的对象产生一个信号检测到相应的检测器(图1 (d))。因此,同一个对象出现一定时间的转变两个数据痕迹。由于励磁激光束之间的距离是很成熟,数据的时移给确切的细胞速度流痕迹。其次,手机信号的宽度(时间细胞穿过一个激光束)取决于激光波束宽度,物体的速度,和大小。因此,只有一个物体的大小是未知的,激光波束宽度可以校准使用一个已知大小的对象(如珠)。这两种方法的结合为每个循环提供了一套完整的数据对象,这使我们能够确定它的大小和速度流。这种模式可以应用于细胞内生表示造影剂时(例如,与黑色素)或细胞外源性标签的目标(例如,纳米颗粒)。茶多糖具有不同的结构和分子成分取决于癌症的类型和阶段,考评的宽度和形状分析和荧光信号提供特定的CTP的规模从CTC独特的参数。

2.4。细胞

小鼠黑色素瘤B16F10、人类乳腺癌(mda - mb - 231)和大鼠腺癌(MTLn3)细胞株表达GFP和Dendra2用来提供机会ctc的监测和茶多糖在体外在PBS和异种移植裸鼠模型(下图)。写明ATCC并培养细胞系是购自杜尔贝科的修改鹰中(DMEM)与高葡萄糖(Gibco) + 10%胎牛血清的边后卫和penicillin-streptomycin。MTLn3腺癌的细胞表达Dendra2蛋白质是维持在一个最低基本培养基(表达载体和生活技术)和10%的边后卫penicillin-streptomycin(英杰公司/技术)。可行的细胞在PBS resuspended所需的浓度。

2.5。纳米粒子

金纳米棒(GNRs)从Nanopartz (Loveland CO)吸收最大值820 nm (gnr - 820)。这些纳米粒子遵循ctc和茶多糖的主要目标要求:小尺寸(≤40 -海里),低毒性与聚乙烯glycol-coating(挂钩),高近红外(NIR)吸收,容易结合。具体来说,gnr - 820与叶酸结合目标表面叶酸受体表达在乳腺癌细胞中,而不是正常的血细胞。

2.6。动物

按照批准的协议是利用动物的阿肯色大学医学科学机构的动物保健和使用委员会。裸小鼠(ν/ν)8-10-week-old,重达20 - 30克,从商业来源获得的用于实验。动物被异氟烷麻醉,放在加热显微镜在38°C(体温)。要创建一个原发肿瘤和转移性传播,老鼠()注射1 - 3×10⁶Dendra2-MTLn3细胞在一个耳朵。老鼠研究了每隔一天PAFFC检测茶多糖的外观和ctc。

皮下接种1×10⁶肿瘤细胞(B16F10和mda - mb - 231)提供肿瘤模型小鼠。为在活的有机体内监测ctc和茶多糖,老鼠使用异氟烷吸入麻醉(1.2%)。老鼠的耳朵是分布在舞台上的玻璃窗户,测量进行奖金的µ米耳血管。所有实验课程是连续监测ctc和茶多糖使用PAFFC系统。传感器被放置在皮肤上轻轻靠近激光与透明的超声波凝胶用于声学耦合。老鼠尾船的血液收集在体外测试使用在体外PAFFC和荧光显微镜。总共五个动物被用于每个实验除非另有注明。

2.7。液隔离和免疫印迹

一夜之间从写明ATCC购买B16F10细胞,培养在DMEM高葡萄糖(Gibco) + 10%的边后卫。细胞被洗3次1 x PBS和新鲜血清DMEM添加和细胞进一步孵化24小时。无血清培养基收集液和微泡通过一系列超速离心法分离步骤。总之,收集到的媒体受到以下离心步骤,600 g×20分钟和10000×30分钟,其中颗粒都被丢弃和上层的收集。最后,上层清液受到一个超速离心法步骤150000 g×3小时。超速离心法后,形成的颗粒在PBS洗。最后洗后,颗粒在PBS resuspended,用于进一步分析。同样,液也分离出小鼠乳腺癌细胞系4 t1和人类神经胶质瘤细胞系U87。

收获媒体后,细胞细胞溶解里帕缓冲区中含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂。细胞溶解产物和液的总蛋白质含量测定采用BCA蛋白质从热科学分析工具。同等数量的细胞溶解产物,微泡,液被解析到sds - page凝胶和转移到PVDF膜。PVDF污点被有5%的牛血清白蛋白(BSA) tris-buffered盐水(TBS)含0.1%渐变20。这些墨迹被探测与主多克隆抗体CD63(印度国家银行生物科学,帕洛阿尔托,CA)或beta-actin (Abcam、剑桥、马)。这些墨迹被探测与辣根过氧化物(合)共轭二次抗体(圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)对主要抗体。这些墨迹被开发使用化学发光试剂和印迹检测使用BioRad Chemidoc议员系统(大力神,CA)。

2.8。统计分析

老鼠受到在活的有机体内监控从30分钟到3小时根据实验任务。平衡数据变化由于船舶大小、位置的日常测试,和鼠标个性,老鼠耳朵的类似血管直径的奖金的µ米被用于监测至少两次在不同的激光位置具有类似容器的大小。结果表示为手段的标准误差+ / -至少有三个独立的实验()。MATLAB 7.0.1(MathWorks)是用于统计计算。

3所示。结果与讨论

3.1。检测模拟茶多糖在体外在毛细管在活的有机体内控制老鼠

黑色素的黑色素瘤细胞已经被我们实验室以前作为一个内生表示PA造影剂时ctc的检测在体外和在活的有机体内在动物模型和癌症患者(34,35]。基于这些经验,我们从黑色素瘤细胞分离液和微泡(B16F10)(数据2(一个)和2 (b)使用的隔离程序(图)2 (c))来验证的能力综合PAFFC系统检测茶多糖在体外。TEM(图2(一个)和2 (d)(图)和黑暗的领域2 (b))成像显示液在60 - 90纳米的范围大小。部分液相对黑暗的黑色素的存在。我们还观察到罕见,更大的外来体集群大小~ 1µm。进一步描述隔离液和微泡是利用免疫印迹进行探测exosomal CD63标记蛋白质。CD63、tetraspanin分子在液高纯度与总细胞溶解产物。免疫印迹显示,而细胞溶解产物,CD63存在于丰富的数量(图2 (e))的隔离液和微泡。Beta-actin被用作加载控制描述相对大量的蛋白质样品装上sds - page凝胶。液和微泡从B16F10细胞分离与PKH26染色荧光染料(脂质膜染色)和分析使用PAFC和FFC模块在体外在一个50µm毛细管流管。B16F10外来体和微泡与明亮染色膜荧光染料(PKH26)产生了许多荧光峰(数字3(一个)和3 (b)(数据)和重合PA瞬态信号3(一个)和3 (b))由820纳米脉冲激光器的光谱范围没有染料吸收(染料吸收在可见光范围)。像传统的流式细胞仪、荧光PA数据在2 d绘图(数字3 (c)和3 (d))。这个数据的分析使我们能够识别三种类型的茶多糖释放B16F10细胞:(1)nonpigmented茶多糖(只荧光信号),(2)色素茶多糖(melanin-related PA和荧光信号),和(3)裸露的黑色素颗粒(见图3 (c)和3 (d))。平均而言,色素茶多糖的总比~ 10%。然而,超过30%的茶多糖含有黑色素也笼罩成一个脂双分子层液的最喜欢。这样的信封可能大幅增加液的扩散速度让他们容易进入血液循环,提供一个自然的早期癌症生物标志物的诊断和监测的来源。

因此,一些茶多糖分泌的黑色素瘤细胞与PAFC label-free模式能被探测到。的确,静脉注射从控制小鼠黑色素瘤细胞分离液后的监测液在一只老鼠的耳朵PAFFC导致PA峰值的出现(图3 (e))。清除率(一生)的外部引入粒子(模仿茶多糖)约10 - 15分钟;然而一些信号出现后一个小时期间连续PA监测过程。PA的数量及其振幅的信号在活的有机体内在背景的存在从皮肤和血液低相比几乎理想的光学条件在体外(数据3(一个)和3 (b))。显然,与生物组织中光衰减相关联的条件和背景噪音限制大多数光学方法的敏感性在活的有机体内。PAFFC平台的优势,尤其是PAFC模块进一步提高性能的潜力在活的有机体内,特别是由PA非线性放大信号从茶多糖通过使用微微秒激光有效考评的一代是最优的信号从小型吸收目标像茶多糖(声学监禁[34),通过使用一个优化的声学探测系统。

3.2。爸爸发现真正的茶多糖在活的有机体内使用带有肿瘤小鼠模型

测试的能力PAFC针对茶多糖在临床情况下,我们使用了一个正交的异种移植小鼠模型的黑色素瘤和转移性乳腺癌。这些模型的特点是早期生产的血液ctc的高概率的茶多糖的外观。黑色素瘤ctc和茶多糖中发现label-free模式使用内生表示黑色素作为PA对比剂时,在乳腺癌ctc GFP是分子靶向枪花乐队的共轭与叶酸(37]。如先前所述的论文(34,37),分子最初目标进行优化在体外。特别是,检测乳腺癌细胞标记,我们使用激光能量,略低于乳腺癌细胞的label-free检测阈值控制样本。标签提供了特异性的bioconjugation gnr - 820与叶酸的目标表面叶酸受体高表达在乳腺癌细胞但几乎没有在正常的血细胞。我们探索的标记效率依赖纳米颗粒的浓度。乳腺癌细胞标记枪花乐队- 820叶酸浓度从500到10000纳米粒子的每一个细胞。令人惊讶的是,500年GNR配合每一个细胞甚至足够有效PA检测30 - 40%的细胞在体外。在2000 - 3000年GNRs每一个细胞,血液中的细胞提供了可检测PA信号背景。标签在活的有机体内是由静脉(注射)注入GNR解决方案(100µL ~ 10¹²GNRs /毫升)向小鼠的血液循环系统。后立即注入我们观察到的外观从GNR PA信号,主要来自他们的总量。然后,PA信号很快就消失了~ 5分钟后由于快速清除GNR聚集20 - 30分钟后,再次出现标记细胞(34]。

我们观察到PA信号与窄、媒介和宽宽度与茶多糖,CTC和CTC总量(数字4(一)和4 (b))。令人惊讶的是,广播信号的振幅从茶多糖只有一点低比从ctc(3 - 5次),这表明一个高度本地化的PA造影剂浓度茶多糖(如黑色素和GNRs)。图像分析收集到的老鼠血液证实在体外ctc和茶多糖(人物的存在4 (c)和4 (d))。

CTC的旅行时间与一个典型的直径()目前消费量µ通过3 - 5米µ米宽一个激光点()决定了信号的持续时间(通过简单的关系):(3 - 6)女士,流速(3 - 7 mm / s在一只老鼠的耳朵船)。因此,CTC (CTP)大小如果可以找到和是已知的(34,38,40]。通常情况下,不是精确已知。因此,在数据4(一)和4 (b),我们可以明确地操作与茶多糖的宽度和ctc和一些预防措施的规模估计使用单一激光束。

3.3。分析CTC和CTC大小使用在活的有机体内双光束飞行时间流式细胞术

如前所述在前面的小节中,飞行时间数据不准确的信息在线性单元速度不能使用如果有一些变化在一个生物系统在一段时间。这个问题是探索使用MTLn3腺癌细胞系表达Dendra2荧光素蛋白质和PAFFC的FFC模块。图5(一个)表明难估计绝对细胞大小甚至为一个统一的人口少得多的一个概率识别小茶多糖。增加血流速度(图5(一个)插图)减少飞行时间,引入了一个错误估计细胞大小。为了克服这个问题,我们探索了双梁示意图(图1 (c)之间的延迟),我们可以测量两个信号的峰值(顺序)时创建一个CTC或CTP穿过两束(图1 (d))。这使我们能够计算细胞(对象)速度(),从而增加细胞尺寸测量的准确性(例如,没有使用校准单元幻影)。对细胞产生信号通道(图5 (b)),正如上面提到的,细胞的速度可以计算只使用信号之间的延时(实验数据)和激光束之间的距离,(恒硬件参数)。事实上,我们的数据表明,在相同的容器可能会有缓慢的细胞,有大型飞行时间信号持续时间(作为峰值)和长间隔的应用数据记录红色和绿色的山峰之间,以便快速细胞与窄峰值接近对方。因此,从细胞(对象)的速度,和飞行时间数据,应用,一个可以计算单元(对象)的大小;这一个因素2是用来计算细胞的直径。

在这种情况下,单元尺寸数据不依赖于流速(图5 (c))。我们执行分析的细胞注入荧光细胞大小分布的血液循环和监测使用FFC瞬态信号。获得细胞柱状图数据显示单个细胞的存在的流量和总量(图5 (d))。平均细胞大小来衡量在活的有机体内(14±1.4µ米)只使用获得的先验数据光束分离和激光波束宽度与相关在体外数据为同一批次的细胞,细胞大小12.8±0.26µm,获得使用透射显微镜幻灯片。我们的数据表明,一些信号可能归因于荧光微粒或细胞碎片有几微米的大小。

3.4。监测茶多糖在癌症的早期阶段

为了开发一个早期癌症诊断工具基于茶多糖的量化,重要的是确认原假设小肿瘤相关粒子出现早于ctc在流通和更高的数字由于高扩散率通过健康血管比全尺寸的肿瘤细胞(疾病早期阶段)。的双色PAFFC在飞行时间运营模式不仅提供了一个独特的机会来量化CTP和ctc在血液循环,而且评估循环粒子(数据的大小6(一),6(b)6(c)。小鼠模型中Dendra2-MTLn3细胞植入老鼠的耳朵被用于这项研究。这些细胞表达可切换的Dendra2提供蛋白质和双色荧光绿色和橙色通道PAFFC系统。的双色飞行时间PAFFC模式是用于检测和尺寸分析循环细胞和细胞碎片。数据6(一),6(b)6(c)(左)表明,茶多糖的数量更高的癌症的早期发展(第五天)。在15天的相对数量信号从细胞(9到18µ米)高于茶多糖,25天的细胞簇开始出现在循环。应该注意的是,茶多糖的实际数量远高于数字检测到这里,小细胞和细胞碎片更低荧光,更很难发现这种粒子。体外在数据分析(类似于数据4 (c)和4 (d))透露许多液在100 - 300纳米的范围大小。

4所示。结论

茶多糖的检测和识别,尤其是在疾病早期阶段,仍然是具有挑战性的,因为它们的体积小和异质性,以及有限分析方法的敏感性和特异性。我们最早建立的一个结果表明高潜力在活的有机体内多色PAFFC平台,集成了PA和荧光方法检测茶多糖。验证茶多糖的检测,我们使用了考评的巧合和荧光信号(数字3(一个)和3 (b))使用茶多糖表达黑色素和贴上PKH26膜荧光染料作为PA和荧光的参考信号。这种集成PAFFC (PAFC + FFC)技术可以被视为一个独特的研究工具,使用动物模型提供洞察茶多糖的作用在癌症分期和预后,虽然PAFC有潜在的未来的临床应用,特别是在label-free黑色素瘤的无创性检测模式。本文的重点是对茶多糖的检测在体外和在活的有机体内在动物模型中使用内生黑色素表达时,染料,与荧光蛋白转基因细胞PAFFC造影剂。当然,荧光蛋白可提高茶多糖的临床前研究;然而,在病人使用这种蛋白质是困难的,如果不是不可能的。在以后的实验中,我们希望利用分子针对肿瘤特异性抗体和工程纳米颗粒等区分肿瘤相关液和液。针对茶多糖使用工程纳米颗粒是一个不错的选择,但需要可靠的消除非特异性相互作用和毒性问题。

在我们目前的研究在肿瘤小鼠模型,我们能够区分茶多糖与窄宽度和峰值较小的振幅和CTC或CTC总量与复杂形状和较大的峰值宽度使用先进PAFFC诊断平台(数字4(一)- - - - - -4 (c))。用PA检测label-free模式和循环老鼠B16F10黑素瘤细胞的检测标记乳腺癌mda - mb - 231细胞,我们观察到一个戏剧性的不同时间细胞穿过辐照血容量。ctc的典型的过渡时间为2 - 4 ms,而一些信号出现只有很短的时间内0.1 - -0.5 ms。这表明小大小的茶多糖存在于流。我们还发现,茶多糖出现在早期阶段癌症的进展和在更大的数字比ctc(数字6(e) -6(f))。虽然茶多糖的假设是摆脱从原发肿瘤在ctc尚未被证明在诊所,我们的研究结果支持这个茶多糖和ctc之间的联系。基于获得的数据,我们认为,茶多糖可以在癌症分期是有价值的工具,疾病的预后,侵略性的决心。

如前所述,我们不能排除聚合(聚集)的ctc和茶多糖以及ctc和潜在的相互作用与血小板茶多糖。特别是,我们已经观察到CTC总量为积极的PA信号提供一些山峰有更广泛的宽度相对于单一CTC(例如,34)和数字4(一)和4 (b)在目前的手稿)。我们也开发了负反差PAFC代理、血小板聚集或所谓的白凝块组成的低吸收血小板,纤维蛋白、白细胞产生负面PA瞬态峰值相对强烈吸收RBC背景(34,35]。此外,使用这种模式我们观察到CTC-platelet团提供一个复杂的正负峰(34]。因此,我们的技术可以监测色素CTP与血小板的聚集导致正负PA的山峰。

PAFC诊断平台的安全使用相对较低的激光能量影响验证了我们之前的出版物和总结综述(34]。在我们目前的研究中,我们使用了类似的激光参数(例如,30 - 50 mJ /厘米²),因此我们并不指望激光CTC和CTP外来体photodamage。然而,安全问题将会仔细检查我们的未来研究。

Label-free茶多糖的检测可能至少有一个癌症类型,黑素瘤,这可能是一个最优模型探索PAFC的临床潜力。我们想强调,第一次,我们提出了一种精确测量茶多糖的大小在活的有机体内通过两个激光束之间的飞行时间检测茶多糖(之前我们和其他实验室估计相对CTC大小使用只有一个单波束)(38]。

假设,我们诊断平台可以提高癌症诊断的敏感性10⁶倍相比,现有的在体外CTC化验的协同作用增加的血液量,可以检查的在活的有机体内PAFC平台(~ 10³倍)和血液癌症标记的扩增结果的潜在的单个肿瘤细胞释放许多茶多糖(~ 10³次)。我们的第一代的局限性在活的有机体内PAFC平台包括小目标的低灵敏度和大小控制≥0.5 - 1µm由于可行的软件都不允许我们实现这一戏剧性的潜在的改进。平均而言,发现着色液的比例是在~ 10%的范围。然而,极大地提高了灵敏度可以弥补缺失或低色素细胞。此外,超过30%的茶多糖中含有黑色素也被包裹进一个脂双分子层液的最喜欢。这些信封可能大幅增加对茶多糖的扩散速度,这样才会使他们很容易进入血液循环,并提供一个早期癌症诊断生物标记物的自然来源。我们相信,敏感性和特异性的检测和识别血液中茶多糖可以显著增强了一个先进的使用在活的有机体内PAFFC-based平台,集成高脉冲重复率微微秒激光、双光束飞行时间示意图,多色电浆调查。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这部分工作是支持由国家卫生研究所(NIH)赠款R01CA131164 R01EB017217,美国国家科学基金会(NSF)资助伊1457888和DBI 1457888,和转化研究所格兰特阿肯色大学的医学科学。作者要感谢萨米尔·詹金斯博士,提供这个手稿的显像。

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