文摘
小胶质细胞扮演着一个关键角色,保护中枢神经系统从各种内部和外部的威胁。然而,他们的过度和/或慢性激活与各种神经退行性疾病的有害影响。以前,我们已经表明,利巴韦林当应用于临床相关的剂量(10μ米)调节活化的小胶质细胞以复杂的方式诱导反和促炎效应,同时引起细胞毒性。在这里,我们研究了低剂量的利巴韦林的潜力(0.1和1μM)调节BV-2激活小胶质细胞。BV-2细胞的形态和功能的激活是通过脂多糖(LPS)刺激。我们的研究结果表明,低剂量的利巴韦林不诱导细胞死亡,而10μ利巴韦林提升LPS诱导细胞凋亡。我们认为1μM利巴韦林也同样有效的失活10 LPS诱导形态变化μ利巴韦林治疗。利巴韦林显示一半成功减少标记功能激活的小胶质细胞。即没有一个剂量LPS引起的促炎细胞因子的生产有影响肿瘤坏死因子α。另一方面,低剂量的利巴韦林证明其有效性在减少炎性介质,通过抑制一氧化氮,一氧化氮合酶诱导的形式。我们的研究结果表明,低剂量的利巴韦林在神经炎症可能缓解nitrosative压力。
1。介绍
小胶质细胞是中枢神经系统(CNS)的居民细胞免疫功能。一旦他们感觉病原体或危险分子模式,小神经胶质细胞进行形态学和功能激活(1]。活化的小胶质细胞迁移到濒危地区发挥吞噬活动来消除外部抗原和潜在有害的碎片,并开始分泌的促炎因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、一氧化氮(NO)、活性氧、前列腺素E2 (2]。以这种方式组织修复提升,因此人们普遍认为小胶质细胞的激活是有益的(3- - - - - -5]。另一方面,过度microgliosis或持续慢性激活的小胶质细胞构成许多神经系统疾病,包括多发性硬化(6]。
利巴韦林(各类单体1 -β-D-ribofuranosyl-1 2 4-triazole-3-carboxamide,也称为病毒唑)是合成鸟嘌呤核苷类似物施加强有力的抗病毒活性对各种RNA和DNA病毒(7]。生物化学和药理数据显示,利巴韦林的主要分子目标行动是肌苷一磷酸脱氢酶(IMPDH),一个关键酶新创鸟嘌呤核苷酸的合成(8]。由各类单体抑制IMPDH导致细胞三磷酸鸟苷的损耗。除病毒外,不同细胞类型的免疫系统,包括亚型的T细胞(9- - - - - -12),巨噬细胞(13],树突细胞(14),对各类单体敏感的行动。免疫调节和免疫抑制行为的各类单体此外证明在实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)在活的有机体内多发性硬化的动物模型。各类单体强烈影响免疫就是明证的实验性自身免疫性脑脊髓炎的单核细胞浸润数量减少(15),抑制促炎细胞因子的生产干扰素-γ,il - 1β和肿瘤坏死因子-α在淋巴结16]。因防止渗透,在中枢神经系统的免疫细胞实验性自身免疫性脑脊髓炎各类单体调制胶质细胞反应,表明小数量的反应性星形胶质细胞(17)和激活小胶质细胞(15]。的注意,各类单体很容易穿过血脑屏障(18,19[],特别是一个被神经炎症20.]。因此,各类单体可能直接作用于神经胶质细胞在中枢神经系统内。事实上,我们已经表明,各类单体能力调节活化的小胶质细胞在体外(21]。然而,利巴韦林的剂量(10μ米)主要应用于激活的小胶质细胞,尽管治疗建议(22),诱导抗和促炎属性同时温和的细胞毒性(21]。
因此,在目前的研究中,我们使用BV-2激活小胶质细胞线与墙细菌脂多糖(LPS)探索各类单体的效力在低剂量应用时,这十个到数百倍低于临床相关的。在这样的实验设计中,我们评估各类单体诱导细胞凋亡的能力,改变细胞形态、释放肿瘤坏死因子-,没有生产,诱导诱导一氧化氮合酶(间接宾语),构成活化的小胶质细胞的标志在活的有机体内。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
BV-2小胶质细胞系是慷慨的礼物从阿尔巴史博士(意大利佩鲁贾大学佩鲁贾)。在RPMI 1640培养基培养细胞补充10%热灭活胎牛血清(FCS)和1%的青霉素和链霉素,所有从PAA实验室购买GmbH,派斯克,奥地利。当文化达到融合,他们接受了段落通过胰蛋白酶化和被播种在不同板块根据实验。
这些细胞被使用各类单体(0.1、1和10μ米)与LPS刺激前30分钟(100 ng / mL)大肠杆菌血清型026:B6 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH,慕尼黑,德国)额外的24小时。治疗协议应用在所有的实验研究。从议员生物医学各类单体是一种礼物,LLC (Illkirch、法国)。
2.2。流式细胞术
BV-2细胞(2.5105/)被播种在6-well盘子,用利巴韦林治疗和LPS如上所述。涉及的细胞生存能力评估双染色膜联蛋白的细胞V-FITC(美国圣克鲁斯,达拉斯,德克萨斯)和碘化propidium(π;美国圣地亚哥BD Pharmingen CA)。膜联蛋白V与磷脂酰丝氨酸暴露早期凋亡细胞表面,而π吸收标记坏死或凋亡细胞死亡。负染色的染料是可行的细胞的特征。染色根据制造商的说明进行。流式细胞术对CyFlow空间Partec (Partec GmbH,明斯特,德国)和数据分析使用PartecFloMax软件(Partec GmbH,明斯特,德国)。
2.3。形态分析
使用phalloidin荧光显微镜形态学分析。细胞被镀在8104玻璃盖玻片(Ø25毫米)在35毫米菜(Sarstedt、牛顿、数控、美国)。在治疗后,细胞和4%多聚甲醛固定在4°C 20分钟,用PBS洗净,然后permeabilized Triton x - 100 (0.25%, Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)15分钟。封锁后5%牛血清白蛋白(BSA Sigma-Aldrich,德国慕尼黑)肌动蛋白细丝被孵化细胞染色(30分钟,RT) Alexa萤石555 phalloidin(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 1: 50在PBS。细胞被洗PBS和复染色与赫斯特33342 (5μg / mL,生活技术,表达载体,卡尔斯巴德,美国CA)。细胞与Mowiol盖玻片(Calbiochem,达姆施塔特,德国)和图像获得使用蔡司Axiovert荧光显微镜(蔡司,耶拿,德国)。定量描述细胞形态学我们使用AxioVision Rel。4.6软件,自动测量2 d细胞表面积。在138年五个随机领域(细胞进行了分析104年μ米2每盖玻片),每组有三个盖玻片,三个独立的细胞的准备工作。
2.4。没有生产
没有文化上层清液的浓度取决于测量亚硝酸盐,主要的不稳定的产品,使用格里斯试剂。细胞(5104/)培养在24-well盘子和作为描述。100年整除μL(每个培养基混合同等体积的格里斯试剂(1%磺胺(σ,德国慕尼黑)/ 0.1% N - (1-naphthyl)乙二胺盐酸盐(丙烯酰胺、书、瑞士)/ 2.5% H3阿宝4)。使用LKB 5060 - 006光谱光度测量的测量进行ELISA板读者,在540/670 nm测试/参考波长。亚硝酸盐浓度的计算使用已知浓度的标准曲线生成的亚硝酸钠(NaNO2;默克公司,达姆施塔特,德国)。
2.5。免疫印迹和免疫荧光分析
BV-2细胞被镀在6-well板密度为2.5105细胞/治疗24小时,收获了胰蛋白酶化,离心机,享年750岁g为3分钟。颗粒状细胞在冰冷的裂解细胞溶解Triton x - 100缓冲区(50 mM Tris-HCl, pH值7.4,150毫米氯化钠,Triton x - 100, 1%和0.1%钠十二烷基硫酸盐(SDS))的蛋白酶抑制剂(罗氏,潘茨堡,德国)补充道。细胞溶解产物在17 900×g离心20分钟在4°C,和上层的收集。蛋白质含量测定采用BCA蛋白质分析工具包(美国皮尔斯生物技术,罗克福德,IL)。蛋白质样品(20μg) 7.5% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与100 - 120 V和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(罗氏,潘茨堡,德国)与冷却1 h 100 V。5% BSA的膜被溶解在Tris-buffered盐水Tween-20 (TBST)(20毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.6,136毫米氯化钠,和0.1% Tween-20)在室温下1 h。膜是孵化anti-iNOS抗体(1:500;Abcam,剑桥,英国)一夜之间在4°C,清洗与TBST 10分钟三次,然后孵化HRP-conjugated二级抗体(1:5000;美国圣克鲁斯,达拉斯,德克萨斯)在室温下1 h。洗后,蛋白质乐队可视化使用化学发光和发达到电影(柯达)。蛋白质的相对表达水平是由微使用ImageQuant 5.2软件和规范化β肌动蛋白。结果表示为控制(参与细胞)的百分比。数据图表中给出平均值±标准平均误差获得四个免疫印迹。
免疫荧光标记的细胞(8104)镀在玻璃盖玻片(Ø25毫米)在35毫米菜肴。24小时治疗后,细胞被固定,水洗,permeabilized,阻止了5% BSA如前所述。主要兔子anti-iNOS抗体(1:700;Abcam,一夜之间,英国剑桥)被应用在4°C。细胞被冲洗和孵化fluorophore-labeled二级抗体(1:500;驴anti-rabbit alexa - 488表达载体,卡尔斯巴德,美国CA)在室温下1 h。与PBS冲洗细胞后,核与赫斯特33342年和盖玻片复染色与Mowiol安装。负控制染色的,同样的应用程序没有孵化的细胞主要抗体。
2.6。酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验(ELISA)是用来确定肿瘤坏死因子的水平α浮在表面的游离。细胞被播种在24-well盘子(5104/),所述治疗24小时,和文化收集上层的。水平的肿瘤坏死因子-α测量使用商业套装(eBioscience,法兰克福,德国)根据制造商的协议。短暂,与生物素化的孵化后检测抗体,avidin-HRP共轭,随后显色底物3、3′,5、5′-tetramethylbenzidine(三甲,eBioscience,法兰克福,德国)补充道。通过添加1 M H颜色发展停止3阿宝4在450纳米和吸光度测定。肿瘤坏死因子的浓度,α在培养基测定使用使用已知浓度的标准曲线生成重组小鼠肿瘤坏死因子-α。释放值计算每毫升pg细胞因子。
2.7。统计分析
数据值代表的意思扫描电镜。统计学意义决定使用方差分析,其次是Bonferroni的测试。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。细胞生存能力分析
低剂量的影响各类单体治疗的可行性BV-2细胞(图1(一))文化是评估24 h后,膜联蛋白V / Propidium碘染色,区分活(膜联蛋白V−/π−),早期凋亡(膜联蛋白V+/π−)、晚期凋亡(膜联蛋白V+/π+(膜联蛋白V)和坏死细胞−/π+)。有限合伙人的数量减少可行的文化通过增加细胞早期凋亡细胞的数量(数字1 (b)和1 (f))。各类单体管理最高浓度(10μ米)添加到有限合伙人的影响,通过促进细胞凋亡(数据1 (e)和1 (f))。相比之下,各类单体低剂量(0.1和1μ米)并不影响BV-2细胞(数据的可行性1 (c),1 (d),1 (f))。晚期凋亡和坏死细胞的比例没有显著不同的治疗(图1 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。利巴韦林整理BV-2激活细胞的细胞骨架
BV-2细胞(图2(一个))与LPS刺激发达活化的小胶质细胞的典型形态,反映在增加细胞表面积和多个膜突起(数据的形成2 (b)和2 (f))。在各类单体治疗(1μ米和10μ米)细胞恢复他们以前LPS刺激(图的形态2(一个)),发展与减少细胞表面积(圆胞体数据2 (d)- - - - - -2 (f))。利巴韦林的剂量(0.1最低μ米)未能诱导BV-2激活细胞(数字形态学变化2 (c)和2 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。利巴韦林TNF -不影响生产α在激活BV-2细胞
形态LPS刺激后激活的小胶质细胞伴随着功能激活通过突出体现释放促炎细胞因子TNF -(表1)。然而,利巴韦林治疗并不影响生产的细胞因子的应用剂量(表1)。
3.4。低剂量的各类单体治疗降低LPS诱导没有释放BV-2细胞
低剂量的效力各类单体抑制LPS诱导没有释放评估通过测量培养基中的亚硝酸盐的积累。令人惊讶的是,10μM各类单体未能诱导抑制或刺激影响没有生产,而各类单体低剂量(0.1和1μ米)没有水平下降约一半的水平由有限合伙人(图3(一个))。因为没有伊诺催化活性的产物,下一步是评估伊诺的表达水平免疫印迹和免疫荧光标记(数字3 (b)和3 (c))。伊诺LPS诱导三倍增加蛋白质丰富,而各类单体、剂量为0.1和1伊诺的M,减少表达水平与未经处理的细胞类似。利巴韦林在最高剂量(10米)仍没有效果(图3 (b))。
(一)
(b)
(c)
表达伊诺被评估免疫荧光标记在LPS-activated BV-2小胶质细胞(图3 (c))。按照免疫印迹分析数据,表达抑制伊诺的0.1和1M各类单体,而10M各类单体是无效的。
4所示。讨论
众所周知,培养小胶质细胞与炎性刺激的挑战,如有限合伙人、细胞凋亡和激活的细胞(23]。treatment-induced细胞损失可能代表一个自我监管机制小胶质激活(24]随着细胞损失被发现参与炎症的决议23]。事实上,在我们的研究LPS诱导细胞凋亡在BV-2细胞约10%的文化中,而10μM各类单体的凋亡细胞的数量增加额外的10%。相同的各类单体用量已经显示诱导类似巨噬细胞的细胞死亡(25和在初级小神经胶质细胞21]。因为我们没有发现显著的凋亡或坏死的证据与低剂量治疗各类单体(0.1和1μ米),本研究的目的是探索各类单体低剂量是否有能力减弱的迹象炎症激活的小胶质细胞在体外。
结果清楚地表明,低剂量的各类单体治疗不影响TNF -生产但没有抑制生产的感应干扰诱导的形式没有合酶(间接宾语)。与此同时,低剂量的各类单体治疗(1µ米)是有效的恢复BV-2细胞形态学未激活的状态,也就是说,控制细胞形态学观察,nonstimulated文化。这些发现表明,低剂量的各类单体,不诱导细胞死亡,可能同样有效减少小胶质激活的迹象,可能有助于解释之前出版在活的有机体内数据,显示各类单体治疗效率减弱神经炎症和创伤性脑损伤在实验性自身免疫性脑脊髓炎16,26]。
利巴韦林有效恢复LPS-activated BV-2细胞静止形态,通过诱导肌动蛋白细胞骨架重排和减少意味着胞体面积。我们最近的研究表明,10的效率μM细胞的形态改变各类单体回复LPS诱导(21)可能是由于其能力以外的减少细胞内三磷酸鸟苷池水平所需的适当的细胞骨架网络的组织(27,28]。本研究表明,各类单体在十次低剂量比较有效的诱导类似细胞骨架重组而不影响BV-2细胞生存能力。
肿瘤坏死因子-α是主活化的小胶质细胞产生的细胞因子在炎症状态在活的有机体内(29日,30.]。我们的研究结果清楚地表明,各类单体,在全方位的应用剂量,并不影响细胞因子的生产LPS-activated BV-2细胞。先前发表的一些研究报道,各类单体降低TNF -发布在一些细胞类型,包括巨噬细胞和树突细胞(13,14]。因此,以前的和现在的研究结果表明,调节各类单体对肿瘤坏死因子的影响释放特定细胞类型,取决于刺激(13和各类单体用量31日]。
一氧化氮是中枢神经系统的重要调控分子,在生理和病理条件。它可能起到神经保护和神经毒性作用取决于其整体浓度(32]。一般来说,生产过剩的没有激活小胶质细胞的神经炎症的标志33,34)和响应与一些神经退行性疾病的进展(32,35]。炎症的挑战后,水平没有增加了几倍的和长期的时间,由于感应诱导形式的号,这可能会导致nitrosative压力和细胞死亡。因此,代理商能够干扰伊诺表达可能是有益的治疗条件与生产过剩的关联,包括脓毒性休克,炎症和神经退行性疾病(32,36]。在我们的在体外模型中,低剂量的各类单体治疗减少伊诺表达式和生产的,就像之前报道(37- - - - - -39]。各类单体的影响可能是由于抑制IMPDH的催化作用,导致减少细胞内的guanosine-based核苷酸,因此四氢生物蝶呤水平下降,这是代数余子式伊诺所需的活动(38,40]。它最近表明,各类单体减少的核质运输伊诺mRNA IMPDH独立通路(41),这表明各类单体调节进气阀打开通过多种方式表达。然而,各类单体似乎是剂量依赖性的影响,为各类单体剂10M伊诺表达未能产生任何影响,没有释放。
这里我们采用预处理与各类单体和显示其潜在的预防能力。然而,以前我们证明,各类单体在终止神经炎症有效在活的有机体内(42,43和我们之前在体外研究还显示,这种药物的潜在调节活化的小胶质细胞即使与有限合伙人(同时应用21]。总之,各类单体是一种药物与潜在的预防和治疗属性存在。
5。结论
的没有考虑到生产过剩导致活化的小胶质细胞在神经炎症活性氮物种的发展,如过氧亚硝基、二氧化氮,这对神经细胞(造成的毁灭性影响了(32]),获得的研究结果有力地表明,低剂量的各类单体治疗可能是神经保护,由于没有抑制毒性低、效率高。衰减nitrosative压力通过调制伊诺可能是有益的,如果应用在神经炎症的早期状态与脱髓鞘疾病(44,45),如多发性硬化症。
利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
作者的贡献
Iva Bozic和Danijela萨维奇的贡献同样这项工作。
承认
这项工作是由教育部、科学和技术发展的塞尔维亚共和国格兰特三世41014年。