高海拔急性和慢性暴露对大鼠有氧和无氧代谢的影响

摘要

在本研究中，我们旨在研究急性和慢性暴露于HA对肝脏有氧和厌氧代谢的影响，通过测定肝脏中ICDH和ATP的水平。同时检测肝脏和血液中的乳酸水平。将大鼠暴露于海拔4300 m的环境中30天，未暴露于HA环境的大鼠作为对照。我们观察到急性暴露后(第1、3和7天)肝脏ICDH表达增加，而肝脏ATP浓度在第1天降低。慢性暴露于HA的大鼠，ICDH和ATP的肝脏表达未见变化。在HA暴露后，肝脏和血液的乳酸浓度没有显示任何显著变化。因此，有氧代谢可能是HA缺氧反应的主要代谢途径，以适应应激环境。

1.介绍

缺氧诱导的生化和代谢变化对适应低氧环境(如高海拔)至关重要。急性和慢性暴露于HA对有氧和无氧代谢的影响已引起广泛关注。先前的研究报告指出，急性暴露于透明质酸会导致糖酵解的厌氧刺激[1- - - - - -6]，而慢性HA适应的特点是提高氧气的有效利用能力[1，4，6，7］.然而，其他研究表明，在整个HA暴露期间，厌氧代谢保持不变[8]显然，急性和慢性HA驯化对有氧和无氧代谢的影响仍存在争议。

克雷布斯循环和脂肪酸氧化是耗氧过程;也就是说，它们是有氧代谢途径。根据以往的研究，动物暴露于HA环境中可能通过有氧或厌氧途径产生能量。在我们之前的研究中，我们发现暴露于HA的大鼠在急性暴露期间FA氧化增加，在慢性暴露期间恢复到对照组水平[9］.本研究旨在评估急性和慢性HA暴露对大鼠克雷布斯循环的影响。

ICDH是克雷布斯循环中一种重要的限速酶，被认为是应激条件下代谢改变的潜在靶点[10］.ATP是克雷布斯循环的最终产物。肝脏是克雷布斯循环中最重要的器官β-脂肪酸氧化。因此，我们检测了暴露于4300 m HA环境的大鼠30天后的ICDH水平和ATP浓度。同时，我们选择检测肝脏和血浆中的乳酸浓度作为无氧代谢的指标[7］.

2.材料和方法

2.1。动物

动物研究的详细程序已在我们以前的报告中描述[9］.雄性SD大鼠36只(体重220 ~ 300 g)，按每笼1只鼠的密度饲养，置于海拔400米的海拔高度°C。驯化3 d后，将大鼠随机分为6组，分别命名为H1 (，接触医管局1天)，H3 (，接触医管局3天)，H7 (，接触医管局7天)，H15 (，接触医管局15天)，H30 (，暴露于医管局30天)，及C (作为对照，无HA暴露)。将H1、H3、H7、H15、H30组空气转移到高原实验基地(海拔4300米)进行低气压缺氧暴露。鼠按相同密度饲养在湿度和光线控制的房间里，温度为°C(06:30开灯，18:30关灯)。给大鼠喂食标准的鼠粮和水随意。禁食一夜后，在10%水合氯醛(0.4 mL/100 g体重，i.p。)麻醉下处死大鼠。将血液标本采集到肝素化管中，分离血浆，在−80°C下保存至分析。肝组织在液氮中快速冷冻，然后在−80°C保存至分析。C组大鼠于第1天麻醉处死，按上述方法处理。本研究得到兰州大学动物保护与利用委员会的批准。

２.２.分光光度法测定肝脏ATP

采用分光光度法测定肝ATP浓度，使用试剂盒(南京建城生物工程研究所，中国南京)。记录636 nm处的吸光度，ATP浓度表示为毫摩尔/克组织(mmol/g组织)。

２.３.分光光度法测定血浆和肝脏中的乳酸

因为肝脏几乎不使用乳酸作为能量来源，而乳酸是公认的无氧代谢标志物[7]，我们检测实验大鼠肝脏和血浆乳酸水平，以研究HA对无氧代谢的影响。因此，采用分光光度法测定血浆和肝脏中的乳酸浓度，使用试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国南京)。记录530 nm处的吸光度。冷冻肝脏样本(50-100μg)均质，并用BCA蛋白检测试剂盒(Beyotime生物技术研究所，中国海门)测定蛋白浓度。血浆乳酸浓度表示为毫摩尔每升，肝组织乳酸浓度表示为毫摩尔每克蛋白(mmol/g蛋白)。

２.４.血凝素暴露大鼠ICDH的肝表达

为了研究HA对能量代谢的影响，我们通过定量实时聚合酶链反应(qPCR)在mRNA水平上测量实验大鼠ICDH的肝脏表达，通过western blot在蛋白水平上测量，正如我们之前报道的[9］.

qPCR研究中，使用RNAiso Plus试剂(TaKaRa Biotechnology Co.， Dalian, China)从大鼠肝脏中提取总RNA。大约0.5μ将提取的RNA用Primescript reverse transcription (RT) Master Mix (TaKaRa Biotechnology Co.， Dalian, China)反转录为cDNA。逆转录反应在37℃15 min, 85℃5 s。qPCR在最后25卷中进行μ在一个旋转基因6000热循环器上使用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(TaKaRa Biotechnology Co.， Dalian, China)。每个25μL PCR反应包含2.0μL的cDNA, 1.0μ感觉引物的L, 1.0μ反义引物的L, 12.5μSYBR Green PCR Master Mix的L和8.5μL的pcr级水。循环条件为:95℃30 s, 95℃5 s, 60℃30 s，循环40次。每个样品有两份。折线感应计算使用方法β-actin是内部参考。本研究使用的引物由TaKaRa生物技术公司设计合成。ICDH引物序列为5 ' -GAGGCTTCATCTGGGCCTGTAA-3 '，反义5 ' -CATGGGCAGCCTCTGCTTCTA-3 '。

通过western blot分析蛋白表达，冷冻肝脏样品(50-100μg)在200年4°C人工研磨均质μL添加1mm PMSF的RIPA裂解缓冲液(Beyotime生物技术研究所，中国海门)。4℃，12,000 g离心10min，不溶性物质去除。采用BCA蛋白检测试剂盒(中国海门Beyotime生物技术研究所)检测上清蛋白浓度。大约50μg提取的蛋白样品在加载缓冲液中变性，用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在30 mA恒流下分离，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下用含0.1%吐温(TBST)的三缓冲盐水(TBS)和5%脱脂牛奶封闭膜2小时。膜与一抗(1:50 0)在TBST中4°C孵育过夜。兔子反β-actin(1: 1000)检测β-actin作为负载控制。然后用TBST清洗膜三次，并与辣根过氧化物酶(HRP-)标记的山羊抗兔IgG(1:10 000)室温孵育2小时。经过两次TBST洗涤10分钟和一次PBS洗涤10分钟后，使用增强化学发光(ECL)底物(中国海门Beyotime生物技术研究所)检测信号，并使用ImageQuant 350成像系统(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.， Piscataway, USA)成像。所有抗体均购自中国南京BIOGOT科技有限公司。western blot采用Image-Pro Plus Analysis Software Version 6.0 (Media Cybernetics, Inc.， Rockville, MD, USA)软件进行分析，并以相对集成强度表示β-同一样品的肌动蛋白。

2．5．统计分析

所有数据均以平均值±SD表示。采用单因素方差分析和Tukey检验或Tamhane T2检验对数据进行两两比较。所有统计分析均采用SPSS (version 17.0)和GraphPad (version 5)软件进行。一个被认为具有统计学意义。

3.结果

３．１．ICDH在肝脏中的表达及ATP浓度

为了评价HA环境下葡萄糖有氧氧化的变化，我们测定了大鼠肝脏中ICDH的表达和ATP的浓度。与对照组大鼠相比，在HA暴露后1、3和7天观察到ICDH mRNA的表达显著增加(1 vs .)在H1中，1和在H3中，1和H7,分别地。）.ICDH蛋白也有相同的趋势(与在H1,与H3,与H7,分别地。）.15天后(H15)， ICDH的mRNA和蛋白水平与对照组相似(图)1(一)和1 (b)）.

上述变化与HA暴露1天(H1)大鼠肝脏ATP水平显著降低相关(与，)(图1 (c)）.

３．２．血浆和肝脏乳酸浓度

与对照组大鼠相比，各时间点血浆和肝脏乳酸浓度均无明显变化(图)2(一个)和2 (b)）.

4.讨论

高原适应是适应低气压缺氧的过程。有氧代谢还是无氧代谢是缺氧条件下的主要代谢途径，这仍然是一个争论的问题[1，4，6- - - - - -8］.克雷布斯循环和脂肪酸(FA)β-氧化是一个耗氧过程，ATP和酮体分别是这两个过程的主要最终产物。ICDH是克雷布斯循环中的关键限速酶，CPT-I是控制FA的关键限速酶β而这两种酶的水平可能反映了应激下代谢的改变[10- - - - - -13］.

在本研究中，我们选择了几个指标来确定有氧代谢或无氧代谢是HA条件下大鼠的首选代谢途径。我们首先在mRNA和蛋白水平上测量了ICDH的肝脏表达。我们注意到，在急性HA暴露的大鼠中，ICDH在mRNA和蛋白水平上的表达显著增加(1,3,7天)，并且在慢性HA暴露组中与对照组大鼠的水平相似。同时，急性HA暴露后(1天)肝脏ATP浓度降低。我们推测ATP产量的减少会导致ICDH表达的增加，这反过来会加速Krebs循环，进而使ATP产量增加到对照组水平。在我们之前的研究中，我们观察到CPT-I在早期急性暴露(3天)显著增加，CPT-I在早期慢性HA暴露(15天)显著降低，而CPT-I在慢性暴露(30天)显著恢复[9］.此外，我们观察到线粒体增加β-肝脏中FAs的氧化导致酮体的生成增加[9］.有氧代谢可能是HA驯化的主要途径。这些发现也表明肝脏有很强的适应缺氧的能力，以维持必要的能量生成水平。

在我们的研究中，我们没有发现无氧代谢增加的证据，这反映在暴露于HA条件下的动物的肝脏和血液中的乳酸水平几乎没有改变。

需要指出的是，我们的发现与别人发表的数据并不完全一致。例如，有报道称，在暴露于急性HA(6或8小时)的小鼠中，肝脏ICDH显著降低，血浆乳酸水平升高[2，5］.布鲁克斯等[1]已经报道，与海平面上的对照组相比，健康男性急性暴露在4300米的环境中会导致动脉乳酸出现率(Ra)增加4倍。Dutta等人[14]报道，暴露于急性HA(1天)的大鼠肝脏线粒体CPT-I显著降低，而稍长的暴露(7天)没有引起任何显著变化。研究发现，在接触HA的动物中，乳酸是主要的能量底物，特别是在急性适应期间[1，2，5，6]表明在急性HA条件下，厌氧代谢在能量产生中起主要作用。我们推测，报告的结果和我们自己的数据之间的这种部分差异可能反映了实验设计的差异。在海拔8000处模拟HA暴露 我在陈的书房里，6000 我在刘的书房，6096 m在Dutta的研究中，而在我们的实验中，大鼠暴露在4300的海拔高度 M因此，在其他研究人员的研究中，受试者暴露在非常严重的缺氧环境中。实验对象需要对其代谢系统进行非常严格的调整，以满足其能量需求。在Brooks等人的研究中[1]，所有研究对象均为健康男性，限食，但在采集血样前给予静脉葡萄糖。这种不同的实验设计可能解释了上述研究和我们自己的数据之间观察到的差异。

综上所述，增加有氧代谢可能是应对ha诱导缺氧的重要机制之一，以适应应激环境。有氧代谢可能是HA慢性暴露的主要代谢途径。需要更多的研究来发现潜在的分子机制。

缩写

ICDH:	异柠檬酸脱氢酶
CPT-I：	肉碱palmitoyltransferase-I
哈:	高海拔
费尔南多-阿隆索:	脂肪酸。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

工具书类

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