细胞毒性评价Ammonia-Modified石墨烯氧化物粒子在肺癌细胞和胚胎干细胞

文摘

氧化石墨烯的潜在毒性(去)是一种近年来越来越多的研究兴趣的话题。在这里,我们的细胞毒性评价ammonia-modified (GO-NH去₂)和原始粒子在人类肺癌细胞A549和胚胎干细胞,Lep3暴露于不同的粒子浓度(0.1、1、10、20、50μg / ml)不同时间(24和48小时)。而去,GO-NH₂粒子具有较小的规模,积极的表面电荷和更高的厚度。增加倾向聚集在细胞培养是GO-NH还发现₂粒子。细胞毒性评价表明GO-NH₂粒子比原始有毒。应用浓度的10、20、50μg / ml 24 h它们显著影响细胞形态学的可行的胚胎干细胞,而人类肺癌A549细胞似乎相对更耐短期风险。48 h后暴露然而强烈抑制A549细胞的细胞增殖方式存在剂量依赖的相关性,而胚胎干细胞的增殖能力没有影响。这些结果表明,这两个粒子施加不同程度的细胞毒性是时间、剂量依赖和细胞。一般来说,ammonia-modified去粒子比原始的有毒应该考虑未来生物医学应用。

1。介绍

石墨烯氧化物(去)是一种具有独特性能的材料适合不同应用于电子、电信、能源和生物医学(1,2]。这些应用程序之一,作为癌症治疗的药物载体,是特别感兴趣的。去为癌症治疗提供了许多优势。反应性官能团的存在的底面和边nanosheets创造了一个机会去共价修改粒子用于靶向药物输送,而丰富的本地化π使电子在nanosheets表面π- - - - - -π互动与芳香抗肿瘤药物(3,4]。药物装载量的显著大于其他传统药物载体,如聚合物胶束,水凝胶微粒子和脂质体,大约200%的体重,这是第一个药物载体加载(可以达到100%以上5]。去能够卸载药物在酸性和碱性条件下由于羧基之间的氢键的断裂和-哦-哦组去和北半球₂药物组(6]。此外,可能诱导活性氧的生成(ROS)在目标癌细胞,这被认为是最重要的一个nanotoxicity机制去(7- - - - - -9]。然而,在癌症治疗周围的正常健康的细胞或细胞快速分裂健康不应损坏(10]。因此,去的毒性可能阻碍其应用用于医疗目的。为了减少去改善它的毒性在活的有机体内生物相容性,许多的毒性影响因素必须被考虑。

毒性的很大程度上是依赖于内在的物理化学性质包括横向大小、厚度、层数、表面性质,合成的方法,除了剂量,曝光时间,细胞类型和管理方法(11- - - - - -14]。在这些因素中,表面性质(例如,官能团,电荷,碳/氧比,和疏水性)是至关重要的在确定去生物分子之间的相互作用的性质(15]。先前的研究表明高度形成血栓的,可以诱导血小板的聚集16,17),而amine-modified石墨烯没有诱导等影响血小板(18]。

表面改性是一种常用的方法改善生物相容性和细胞毒性进行更安全的生物医学应用程序(19]。PEGylation,例如,减少非特异性蛋白吸附生物膜从而防止絮凝和调理素作用和随后的补体激活20.- - - - - -23]。PEGylation之外,其他化学功能化的纳米粒子应该探索与改进的生物相容性材料的发展,减轻免疫反应,延长血液循环(24]。然而,其中的一些修改如GO-COOH GO-PEI,发现了表现出某种程度的毒性T淋巴细胞(25]。因此,减少细胞毒性可以做只有适当的功能化。

氨基化的生物材料用作细胞下层附件已经被证明对粘附有积极影响,正常细胞的迁移和函数(26]。例如,李等人报道提高仓鼠卵巢细胞的粘附和生长在胺化了的聚乙烯聚合物表面(27]。另一项研究表明,密度越高胺组玻璃盖玻片增加附着力,迁移,分化鼠神经干细胞(28]。Amornsudthiwat等。确认NH的积极影响₂组小鼠成纤维细胞细胞粘附在使用氮等离子体处理的蚕丝蛋白表面(29日]。此外一些作者报道,NH₂改性碳纳米材料表现出改善的兼容性与正常细胞和组织。李等人表明,预处理的老鼠amine-modified碳纳米管可以防止神经元死亡和促进脑卒中后神经功能的恢复(30.]。这些数据表明,北半球的存在₂组在纳米材料的表面可以帮助避免一些副作用的化疗期间正常细胞;然而amine-functionalized的影响(NPs)在人类癌症和正常细胞必须彻底研究。

因此本研究的目的是评估ammonia-modified NPs和原始的细胞毒性效应对人类肺泡癌细胞系A549和胚胎干细胞Lep3,对待不同的粒子浓度24和48 h。A549细胞作为细胞肺癌模型,因为肺癌被认为是一个领先的全球恶性肿瘤死亡率原因由于高水平的空气污染和大量的吸烟者在发展中国家31日]。此外许多biodistribution研究表明主要积累在肺部(32]。Lep3细胞作为模型,正常,健康细胞快速分裂。现有的信息缺乏的影响amine-enriched NPs在癌症细胞和胚胎干细胞的细胞毒性以及相互矛盾的信息去粒子让现在工作的一个重要的一步未来生物医学策略包括石墨烯纳米材料。

2。材料和方法

2.1。粒子和粒子表征

2.1.1。粒子

石墨烯氧化物(C1576、Graphenea、西班牙)和ammonia-modified氧化石墨烯(791520年,Sigma-Aldrich德国)商用产品,购买水悬浮液浓度4毫克/毫升,1毫克/毫升,分别。

为在体外曝光,粒子悬浮液作为股票的解决方案准备1毫克/毫升蒸馏水,用超声波水浴(50赫兹,UM-2 Unitra-Unima, Olsztyn,波兰)1小时。NPs的最终浓度(0.1、1、10、20、50μ分别为g / ml)直接从股票的解决方案是通过添加NPs培养基。

2.1.2。粒子表征

x射线光电发射光谱(XPS)。元素组成的纳米颗粒被x射线光电发射光谱(XPS)分析。XPS测量进行了使用一个轴DLD超仪器(英国Kratos-Manchester)。宽光谱在160年收购了eV传递能量。高分辨率核心线光谱进行通过设置分析仪通过能量20电动车通过能源和最后的决议是~ 0.3 eV。适合使用高斯组件执行和雪莉背景减法,用自制的软件基于R平台(https://www.r-project.org/)。

动态光散射(DLS)。粒子大小分布和电动电势测量动态光散射(DLS)技术使用Zetatrac仪器(S3500;Microtrac,缓慢地,FL)。颗粒大小分布的估计速度去GO-NH的布朗运动₂纳米颗粒在悬浮在水中(33]。

原子力显微镜(AFM)。原子力显微镜AFM图像进行英诺华(力量Inc .)在开发模式下在空气中,使用标准的氮化硅(氮)调查技巧(齿顶圆角半径小于10海里)。样本扫描率0.5赫兹在5个不同位置的表面探索领域的10×10μm。捕获的图像(512×512像素)在高度和偏转模式并提出一个简单的一阶压扁。

2.2。细胞和细胞培养

在人类肺泡癌A549细胞的细胞毒性评价,获得美国类型文化集合(ccl写明ATCC®- 185™)和人类胚胎干细胞Lep3细胞,从实验室的细胞培养,获得国家中心传染病和寄生虫病,索非亚,保加利亚。细胞在DMEM培养基成长为单层文化,补充10%胎牛血清,100 U ml-1青霉素,和100年μg ml-1链霉素。文化是维持在37°C湿润有限公司₂孵化器。对于日常段落贴壁细胞分离用0.05%胰蛋白酶和0.02% EDTA的混合物。实验进行在细胞生长的对数期。细胞毒性实验的细胞被播种在无菌盖眼镜与直径12毫米2×10的密度⁴细胞/在24-well板和孵化24小时。第二天中被新的取代,NPs与不同浓度添加到细胞中。经过另一个24小时的孵育细胞根据实验协议处理。控制细胞处理测试样品没有纳米颗粒。

2.3。相差和荧光显微镜

相差和荧光显微镜是用来评估细胞的形态改变NPs聚合和接触NPs后24小时。相衬显微图被与一个倒置显微镜放大10倍Axiovert 25(德国卡尔蔡司),配备了数码相机。荧光可视化的可行的细胞的形态学的样本染色2分钟0001%荧光素二乙酸(FDA)(σ,德国)溶解在丙酮。经过多次清洗与PBS荧光显微图被放大10倍。进一步,分析了荧光显微图使用图像J软件获取连接细胞的数量和平均细胞扩散面积一天后A549细胞暴露于纳米颗粒。

2.4。细胞计数Kit-8化验

细胞计数Kit-8 (CCK-8 Sigma-Aldrih有限公司)是一个简单的比色测定测定细胞活力的细胞增殖和细胞毒性分析。它是基于减少Dojindo高度水溶性四唑盐,WST-8细胞中给一个橙色甲瓒染料,这是溶于细胞培养基。甲瓒染料的量,由脱氢酶在细胞的活动,直接与活细胞的数量成正比。如前所述执行CCK-8 [34]。短暂,细胞都被转移到一个新的24-well板用PBS然后新鲜培养基和比例10:1的CCK-8试剂添加到每个样本。4小时孵化后37°C在黑暗的颜色反应的产物测定spectrophotometrically波长λ= 450海里。

2.5。统计分析

所有的实验进行了一式三份,提交结果的平均水平。误差棒表示标准偏差。与学生的实验数据进行了分析测试。接受了统计学意义p < 0.05的水平。

3所示。结果

3.1。去GO-NH的表征₂粒子

纳米粒子的基本组成如图1。我们可以看到在图1(一),去揭示了四个组件的c1 XPS谱对应不同的功能组:碳碳(284.7 eV) sp2碳原子在基底平面的石墨烯薄片,切断(286.2 eV), C = O (287.8 eV), O C = O (289.1 eV) (35]。在GO-NH₂(图1 (c)),相同的氧官能团依然存在,但峰值强度要弱于那些去,这意味着GO-NH中的氧含量₂ammonia-modification后减少。元素分析还表明,C: O配给在原始是2:1(分别为66.36%和33.64%)而在GO-NH₂C: O配给ca。3:1(70.12%和25.64%,resp)。GO-NH中的氧含量₂低于8%,说明部分减少功能化过程中去。元素分析表明含氮量在GO-NH ca。3.47%₂,而在原始的0 - 1 %根据数据表。所有这一切都表明的脱氧去功能化石墨烯氧化物氮的合并。

两座山峰为n1 GO-NH注册₂。n1峰值为397.8 eV是由于C (O) N的氮,氮在北半球₂观察到的峰值为400.3 eV (36)(图1 (e))。各自的百分比的比较这两种氮GO-NH₂揭示了氮的粘结状态的结构。C (O) N的含氮量高于债券在北半球₂这表明大多数的氮是共价连接到表面(37]。

拓扑的胺化了的去了NPs AFM和相应的AFM图像nonsonicated和用GO-NH₂NPs沉积在云母衬底如图2(一个)和2 (b)。Nonsonicated GO-NH₂片显示不规则形状和横向维度几微米(数字2(一个)和2 (c))。厚度在GO-NH粒子之间的变化之一₂单层(1 - 2 nm)和双分子层(3 - 4海里)。声波降解法引起横向分散粒子的随即不规则颗粒的长度100 - 200 nm分离胺化了的GO-flakes(数字2 (b)和2 (d))。然而分离颗粒的厚度是相同的。

DLS测量粒度分布表明,原始的粒子由两个分数与完全不同的大小。9.7%的去颗粒大小为250±68海里可以得出从第一个注册(图峰值3,黑线),而大多数粒子明显大,约为1.5±0.7μ从第二个峰值。只有一个峰值在GO-NH检测₂表明粒子的百分比最高(大约87%)和大小在纳米尺度范围内560±300海里。

去GO-NHζ电位₂粒子以水解决方案显示一般的潜在改变从负值(−24日5±0.4 mV)为GO-NH积极₂NPs (38.5±2.8 mV)(表1)。这种逆转是意料中的,因为积极的氨基酸组。这种电动电势的变化已经报道的胺改性后的介孔二氧化硅纳米粒子(38]。

3.2。细胞毒性

3.2.1之上。短期的细胞毒性

观察细胞形态变化对接触相差和荧光显微镜。代表相差A549细胞显微图,暴露NPs(图24小时4),表明这两种类型的粒子,有或没有氨改性,倾向于聚合成细胞培养,影响有效的规模和可能影响诱导细胞毒性。原始的聚合粒子是弱于胺化了的去观察它只在20 - 50的最高浓度μ克/毫升(图4,更高的面板)。聚合的GO-NH₂粒子更明显甚至0.1的最低浓度μ克/毫升(图4较低的面板)。聚合或聚集也观察到非Lep3细胞接触去GO-NH₂粒子(数据未显示),这表明聚合GO-particles并不依赖于粒子的细胞类型但主要类型。许多类型的NPs已报告形成聚集在生理的解决方案(39)包括碳基纳米粒子(34]。GO-NH₂聚集在细胞培养基清晰可见,因为大骨料不能通过跨细胞膜因其大尺寸和他们仍然在细胞周围。去GO-NH₂粒子并没有引起收缩、坏死或凋亡的细胞可以得出从整体细胞A549细胞的形态。一般来说,基于分析阶段的对比图片,A549细胞的形态不是从粒子的类型和浓度的影响。更大的集群NPs然而可能导致细胞的机械损伤导致分离的细胞基质,细胞损失,降低细胞生存能力。

细胞生存能力评估FDA染色证实了结论相差照片制成的,可行的A549细胞的形态没有明显改变后24小时接触原始和胺化了的NPs(图5)。只有在GO-NH的最高浓度₂和原始的粒子(20到50μg / ml)一个大数量的增加,检测表明:细胞弱细胞毒性效应。一些较大的细胞内观察粒子和粒子聚集,与箭头指出图5表明一些NPs可以穿过细胞膜。

A549细胞的细胞生存能力的定量评价由测定细胞数量和平均传播领域表现出最小的细胞毒性已被观察到在接触到这两种类型的纳米粒子,但只有在高浓度。Ammonia-modified粒子浓度的10、20、50μg / ml和原始粒子浓度的20 - 50μ克/毫升(图6)造成轻微的可行的附加A549细胞的数量的减少。有趣的是,一个轻微的刺激中可观察到细胞中附件A549细胞治疗NPs - 0.1和1浓度最低μg / ml的NPs类型,而控制细胞。细胞A549细胞的扩散能力也不会曝光不足去GO-NH而受到影响₂粒子(图7)。

利用Lep3细胞去GO-NH评估细胞毒性₂颗粒对肿瘤细胞我们发现Lep3细胞短期暴露去GO-NH更加敏感₂粒子相对于A549细胞。Lep3单个细胞和骨料,变得越来越小,越来越萎缩特别是GO-NH曝光不足₂(图8)。定量评价的细胞生存能力评估CCK-1试验表明,光密度值(OD)(指的是可行的细胞的数量),最高浓度降低的NPs(20去20 - 50μGO-NH g / ml₂)虽然不存在剂量依赖性相关可行的细胞数量和浓度的NPs(图9)。

3.2.2。长期的细胞毒性

细胞增殖率的一个重要指标是NPs细胞毒性的潜力。因此,为了更好地理解去GO-NH的细胞毒性效应₂颗粒细胞A549和Lep3我们已经研究了蚀变后,细胞增殖/代谢能力进行长时间的曝光。我们使用CCK-8化验,一个标准在体外试验测定NPs毒性尤其是石墨烯材料,因为WST-8试剂被发现不与石墨烯材料反应40]。获得的结果显示,去GO-NH₂粒子导致剂量依赖性降低A549细胞的增殖率(图10在48小时)。控制未经处理的细胞相比,光密度值(OD)对A549细胞明显减少。浓度之间的线性相关性被发现的原始粒子,测量在A549细胞而OD值最低浓度的胺化了的NPs(0.1和1μg / ml)导致无意义(p > 0.5)减少细胞增殖率。GO-NH浓度越高₂粒子(10年,20年,50μg / ml)然而受损甚至比原始A549细胞的增殖能力。治疗后的测量OD值10μg / ml GO-NH₂几乎2倍低于控制细胞,而对原始走在这个浓度的减少细胞数量不到1-fold。观察同样的趋势在20 - 50μg / ml最高浓度的细胞的数量减少超过3.5倍相比,控制细胞去GO-NH(0.93和0.87₂分别控制vs 3.12和3.09)。

相比之下,非Lep3细胞增殖能力是不影响浓度的两种类型的NPs证实了我们以前的观测与DND粒子,纳米材料的细胞毒性是非常依赖于细胞类型。没有观察到明显的差异在细胞治疗或GO-NH₂粒子(图10较低的面板)。

4所示。讨论

调查的第一个步骤的一个潜在的抗癌剂的评价在体外毒性对肿瘤和正常细胞(41]。因此,在目前的工作旨在研究几个方面的潜在细胞毒性效应的原始和ammonia-modified纳米颗粒在肿瘤细胞株A549和非胚胎Lep3细胞。结果细胞短期暴露的NPs一般显示轻微的细胞毒性效应的NPs在最高浓度(20 - 50μg / ml)对肿瘤细胞对肿瘤细胞和更强大的影响,如GO-NH的毒性作用₂更明显。我们的结果会是相当同意张等人发表的结果没有发现任何负面影响继续A549的形态和增殖后孵化24小时(7]。也观察到轻微增加连接细胞的低浓度的NPs(0.1和1μg / ml)可以解释可能的毒物兴奋效应的影响,这是刺激引起的细胞生存能力低剂量的潜在的有毒代理人。在低剂量去NPs(原始和ammonia-modified)显示毒物兴奋效应的影响通过改善细胞依附和生存能力。这样的效果由银NPs焦最近被证明对人类肝癌细胞et al。42]。在一个更长的潜伏期48 h一个非常明确的剂量依赖性的细胞毒性效应,尤其是GO-NH₂NPs在观察A549细胞的增殖能力。相反,长期接触的胚胎干细胞粒子不影响其增殖能力。这表明,纳米粒子的路径通过影响肿瘤细胞是耗时与胚胎干细胞。因此,我们可以得出结论,比较肿瘤和肿瘤细胞Lep3细胞更敏感比A549细胞短期暴露的NPs(原始和ammonia-modifed)在48 h A549细胞更敏感比胚胎干细胞特异性毒性反应。

在大多数进行的实验的细胞毒性效应ammonia-modified去强于原始的可称为不仅化学还NPs的物理性质。粒子的大小是最重要的参数之一,可能严重影响其与细胞的相互作用43]。然而,仍然有争论关于之间的关联尺寸和粒子的毒性。一些文件显示,暴露于更大的颗粒大小(100海里)会导致更多的负面生物效应比越小(10 nm) (44]。其他作者报道相反:较强的细胞毒性引起纳米颗粒较小的尺寸(45,46]。在我们先前的研究爆轰金刚石(DND)粒子我们发现小尺寸的DND粒子更骨肉瘤mg - 63细胞毒性和基层大鼠间充质干细胞(34]。从目前的工作成果也证明了小尺寸的NPs (GO-NH₂)抑制肺癌A549细胞的增殖程度大于原始在微尺度的大小,而是来自另一方面并不影响胚胎Lep3细胞扩散。

电动电势的NPs是另一个重要因素可能影响粒子的细胞毒性。积极的电动电势NPs可以增加聚合物纳米粒子的内化在A549和其他non-phagocytic细胞(47]。放缓和同事证明了介孔二氧化硅纳米粒子与氨基酸组的surface-functionalization导致一个特定的受体介导内吞作用的癌症海拉细胞(38]。除了有证据表明,带正电的NPs可以更有前途的药物载体为他们更耐比带负电的调理素作用和间隙的巨噬细胞在病人的血液48]。因此,我们推测,规模较小的组合和积极GO-NH电动电势₂使NPs能够更有效地交流的癌细胞的抑制主要重要功能和减少肿瘤细胞的生活。此外辛格等人的研究和李et al。18,28Lep3)结合我们的结果表明,amine-modified纳米材料表现出较低的亲和力更敏感的细胞像神经元,血小板,胚胎干细胞是一个额外的理由认为这些材料作为抗癌药物的潜在候选人。

5。结论

在目前的研究细胞毒性比较原始和氨修改已经完成。一般来说,粒子产生时间和浓度变化在细胞形态、生存能力和扩散能力,尽管有一些显著的差异。我们发现ammonia-modified粒子更明显倾向于形成聚合物,更比原始的毒性在两种类型的细胞,肿瘤肺癌A549细胞,肿瘤,胚胎Lep3细胞。GO-NH₂明显受损A549细胞的增殖活动在10 - 50浓度μ克/毫升以及可行的A549的数量和Lep3细胞和胚胎Lep3细胞的形态。NPs(原始和ammonia-modified纳米粒子)应用于小剂量在短期内没有显著改变肺癌A549细胞的生存能力,但影响胚胎干细胞。比较肿瘤和肿瘤细胞短期暴露于NPs后我们发现胚胎细胞在长期接触更敏感,更敏感的是肺癌细胞指向一个细胞去GO-NH的具体影响₂粒子。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是由一个双边项目,Bulgaria-China(批准号被平反种族成员/ 01/6/2016]。

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