文摘

阻力指标纤维化也许可以肾纤维化,特别是,它的特点是增加细胞外基质(ECM)间质形成和发展,是几乎所有的常见途径结束进步的肾脏疾病。这个矩阵的一个来源的上皮间充质转变(EMT)表格上皮。背后的驱动力是一些profibrotic增长等因素转化生长因子-β(TGF -β)负责胶原蛋白在肾纤维化的形成。miR-29c,这是一个antifibrotic微rna,通过下调TGF -会使肾间质纤维化β和胶原蛋白。然而,目前尚不清楚miR-29c介导TGF -β1-driven PI3K-Akt通路和Col-1触发NRK-52E文化。本调查的主要目的是检查的影响的差别miR-29c在对这些TGF -β1-driven PI3K-Akt通路和Col-1触发NRK-52E文化。这项研究显示,miR-29c抑制TGF -β1表达NRK-52E细胞培养。超表达miR-29c显著抑制NRK-52E文化扩散由TGF -β1。miR-29c抑制Col-1的表达和减少PI3K / Akt磷酸化。这些发现揭示了小说机制miR29c抑制肾间质纤维化的文化的扩散通过下调PI3k-Akt通路,控制了TGF -β1。

1。介绍

肾间质纤维化(RIF)在慢性肾脏疾病中起着重要作用和持续的发展大部分肾脏疾病(1]。肾纤维化没有有效的治疗方法,但它的患病率逐渐增加(2]。小说对肾纤维化的治疗方案可能被发现通过研究更多的复杂的机制和细胞因子,导致这种疾病(3- - - - - -5]。因此,保护的实质功能/结构状态是至关重要的防止器官纤维化(6]。

TGF -β有几个细胞功能,包括组织纤维化的发病机制在RIF [7,8]。TGF -β激活经典TGF -β/ Smad信号通路为纤维母细胞启动(9,10]。此外,TGF -β触发TGF -β/ PI3K-AKT信号通路,促进成纤维细胞增殖的RIF [8,10,11]。经典之中(non-smad) TGF -βAkt,效果器,包括c-Abl PAK2 mTOR,和马铃薯球蛋白(TSC2),触发在早期/快速肾纤维发生阻塞性肾病。治疗mTOR或c-Abl抑制剂,雷帕霉素或甲磺酸伊马替尼,分别块中的TGF -β通路,降低间质成纤维细胞、myofibroblasts和ECM蛋白质积累。组合抑制至关重要的监管机构对这些non-smad TGF -β因此网络是一种有效治疗肾纤维发生(8]。

微RNA是一种小型监管RNA调节基因表达的转录后的抑制/目标mRNA不稳定(12]。microrna基因至关重要监管机构涉及众多器官纤维化的模型,包括心脏(13,14)、肾(15),和肝纤维化16),根据以往的研究结果。miR-29 antifibrotic微rna,会使人类和老鼠细胞(RIF17]。众所周知,microRNA-29c会使胶原蛋白1型(Col-1) / 3型(Col-3)在小鼠NRK-49F文化和单侧输尿管梗阻(UUO) [18]。miR-29c显著下调在UUO nephropathic肾小管上皮文化或TGF -β1-exposed肾小管上皮细胞(NRK-52E)文化。miR-29c击倒可以全面增强特异性蛋白1 (Sp1)的生产,但miR-29c的异位表达NRK-52E文化大大减少引发了TGF - Sp1的表达β1 (19]。然而,未知是否miR-29c介导TGF -β1-driven PI3K-Akt通路的激活Col-1 NRK-52E文化。

TGF -的影响β1在NRK-52E miR-29c表达谱文化在这项研究检查。再往下,我们调查如果miR-29c影响NRK-52E文化的扩散所引发的TGF -β1。此外,我们检查是否miR-29c影响PI3K-AKT信号通路调节Col-1表达谱在NRK-52E文化中,施加miR-29c RIF培养增殖的功能属性/ ECM的合成。

2。材料和方法

2.1。文化/ TGF -β1化验

肾脏文化线(NRK-52E)写明ATCC(美国)通过。NRK-52E文化是生长在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)与10%胎牛血清的边后卫和链霉素(100μg / ml;英杰公司™)和青霉素(100单位/毫升)在37°C和有限公司2(5%)。人类重组TGF -β1从收购PeproTech™。融合文化(40%)被暴露于人类TGF -重组β1 (10 ng / ml,研发系统™)或消极控制DMEM只要必需的。

2.2。文化转染

文化被播种在完全培养基有10%的边后卫在6-well文化板块(confluency 24小时,直到60 - 70%)。同步文化发展,文化是在无血清培养一天媒体曝光前24小时。

引物miR-29c检测化验都是来自上海GenePharma™有限公司有限公司依法进行了转染工具包的协议。

2.3。实时聚合酶链反应(实时PCR)

从文化/组织总RNA收集使用试剂盒®(英杰公司™,美国)根据设备协议。因此,互补dna是从总RNA准备使用Prime-Script®RT试剂盒(豆类™,日本)。

U6受雇为检测miR-29c作为参考。数据集的结果进行了评估采用ΔCt方法。引物都是捏造的使用表达载体™。完整的数据集的结果反映了 三个独立的实验。

2.4。西方墨点法(WB)

蛋白溶菌产物研发和暴露于钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(SDS /页面),运输/聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF),并通过标准化技术,涂抹用人anti-collagen我抗体(1:100)(美国微孔)或anti-PI3K anti-AKT, anti-phospho-AKT抗体,anti-phospho-PI3K (1: 100) (Abzoom生物学实验室,美国)。Anti-GAPDH抗体(1:1000)(Abzoom生物学实验室,美国)作为标准化控制,确保蛋白质组水平加载。

2.5。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定

利用MTT检测评估被miR-29c / TGF -的影响β1 (10 ng / ml)细胞增殖。文化( 文化/)镀在96 -孔板在DMEM和维护的边后卫(10%)。的培养基培养3天后被撤消了。美国麻省理工试剂(σ5毫克/毫升PBS)个人注入井,孵化2小时颜色发展之后,甲瓒晶体,和DMSO溶液溶解。在570 nm,吸光度测量使用标。个人分析是用来量化每组3井的细胞内容。

2.6。软琼脂试验

500个细胞放入0.5毫升的生长培养基含有琼脂(0.35%)和分层在0.5%琼脂基地,以避免anchorage-dependent文化生长。层凝固后覆盖1毫升的标准化的生长介质和每48小时刷新。可行的殖民地被视为拥有50多个文化或大于100毫米大小。成像后,合格的殖民地量化程度天后进行。

2.7。统计分析

所有的分析都是借助SPSS13.0统计软件进行使用Windows®®。学生的 - - - - - -测试是用来评估统计学意义差异的控制和研究群体,和单向方差分析来比较多个军团。事后Bonferroni测试(post-ANOVA)是用来确定军团之间的显著差异。 值< 0.05被认为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。TGF -β治疗1表达下调miR-29c NRK-52E内文化

TGF -β1负责上皮间充质转变(EMT)管状上皮细胞,和α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)是一个典型的蛋白质激活成纤维细胞的标志(20.,21]。因此,αsma是用来验证TGF -β1-driven EMT模型。首先,这项工作表明适当的TGF -的浓度β1。后一天的刺激与不同浓度的TGF -β1的内容αsma蛋白质和RNA存在于NRK-52E文化进行了分析。数据显示1(一)和1 (b),的表达αsma逐渐增加从1到20的TGF - ng / mlβ1,展示明显量效关系( )。然而,在20 ng / ml的TGF -β1,表情略微增加10 ng / ml的浓度;因此,10 ng / ml的浓度被选为最理想的TGF -β1剂量。最优TGF -β1影响时间被确定。数据1 (c)和1 (d)增加了三倍αsma 24 h组相比,控制队列( ),表明24小时被选为最优TGF -β1时间的影响。理想的TGF -β1剂量和作用时间产生的EMT模型有效地激活NRK-52E TGF -细胞β1 (10 ng / ml) 24小时。的表达miR-29c TGF -然后评估β1-driven EMT模型。后一天的文化接触TGF -β在10 ng / ml(图11 (e), ),50%的差别miR-29c表现出对这些。

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图1
TGF -β治疗1表达下调miR-29c NRK-52E内文化。(一)选择最优TGF -β由世行1浓度(24小时刺激)。(b)选择最优TGF -β通过rt - pcr 1浓度(24小时刺激)。(c)选择最优效果的TGF -β1在世行10 ng / ml。(d)选择最优效果的TGF -β1通过rt - pcr 10 ng / ml。(e) miR-29c表达式EMT模型驱动的TGF -β1。 和 。
3.2。miR-29c挫败TGF -β1-Driven增生性财产NRK-52E文化

MTT检测进行分析文化扩散。TGF -β1促进NRK-52E细胞增殖率( )如图2(一个)。与此同时,miR-29c抑制NRK-52E文化扩散( )。因此,TGF -β1刺激被加入到文化与miR-29c超表达。通过miR-29c NRK-52E细胞增殖率降低后TGF -β1接触( )。这是证明miR-29c抑制NRK-52E细胞的增殖诱导TGF -β1。

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图2
MiR-29c抑制TGF -β1-driven NRK-52E文化的扩散。NRK-52E文化对待消极的控制(NRK-52E), miR-29c模仿(miR-29c), TGF -β1 (TGF -β(TGF - 1),或者两者都是β1 + miR-29c)。(一)文化引入96 -孔板和24,48岁或72小时,通过MTT分析评估。(b)用软琼脂培养基生长的文化程度前几天结晶紫染色/成像。殖民地的数量反映了殖民地的百分比。 和 。(c) RT-qPCR miR-29c表达谱的数据集的结果NRK-52E文化转染miR-29c模仿。 。

软琼脂集落形成试验通常用来评估文化转型在体外(22]。这个测试应用于证实miR-29c的体外抑制活性。miR-29c水平大大高于miR-29c overexpressing文化(图2 (c))。NRK-52E文化和miR-29 overexpressing文化被镀到软琼脂板和允许殖民地的程度天有/没有TGF -β1接触。结果MTT试验完全匹配。TGF -β1刺激增长的NRK-52E殖民地(图2 (b), )。与此同时,miR-29c抑制NRK-52E殖民地(图的增长2 (b), )。之后,TGF -β1治疗,miR-29c overexpressing殖民地文化生成大大少于vector-transfected文化,展示miR-29c的增殖抑制作用(图2 (b), )。

3.3。miR-29c PI3K-AKT通路激活在NRK-52E文化

miR-29家庭激活/表达式与TGF -密切相关β1-driven PI3K-Akt途径激活人类肺成纤维细胞,据几位以前的研究(23,24]。然而,目前尚不清楚miR-29c是否介导TGF -β1-driven PI3K-Akt NRK-52E文化途径激活。总蛋白质表达谱的磷酸化PI3K / Akt overexpressing miR-29c细胞和控制进行研究后受到TGF -β1。显示在图3,miR-29c过度抑制TGF -β1-induced PI3K-AKT磷酸化。P-PI3K转录组和p-Akt蛋白质组水平大幅下调,尽管PI3K和Akt总蛋白质含量没有改变任何的样品。

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图3
miR-29c PI3K-AKT通路激活在NRK-52E文化。(一)负控制和overexpressing miR-29c文化受到TGF -β1,然后,PI3K / Akt的总蛋白质及磷酸化表达谱通过世行进行评估。(b)负控制和过表达miR-29c文化受到TGF -β1,通过RT-qPCR PI3K相对随后计算表达式的值。(c)负控制和overexpressing miR-29ccultures受到TGF -β1,通过RT-qPCR PI3K相对随后计算表达式的值。(d) -控制和overexpressing miR-29ccultures受到TGF -β1,通过RT-qPCR AKT相对随后计算表达式的值。(e) -控制和overexpressing miR-29ccultures受到TGF -β1,然后,一种蛋白激酶磷酸化通过RT-qPCR相对后来计算表达式的值。 和 。
3.4。miR-29c下调Col-1 PI3K-AKT通路

ECM组件之一,Col-1 miR-29家族的目标基因在肝纤维化25和心脏纤维化14]。然而,它仍然未知是否Col-1 miR-29c的目标基因在NRK-52E文化。因此,NRK-52E文化治疗有或没有LY294002 (PI3K-Akt磷酸化抑制剂)在miR-29c-inhibited文化。瞬时转染的miR-29c抑制剂NRK-52E细胞培养,以确定是否成功转染。miR-29c抑制剂明显会使miR-29c,根据数据集(图的结果4 (c))。数据4(一)和4 (b)演示Col-1 upregulation检测到细胞溶解产物处理miR-29c抑制剂( )。Col-1的upregulation miR-29c抑制剂治疗后下降LY294002 ( )。这些数据集的结果表明,通过降低miR-29c抑制Col-1 PI3K-Akt磷酸化水平,因此减少ECM的合成。

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图4
miR-29c减少通过PI3K-AKT Col-1通路的表达。(一)有/没有LY294002 (PI3K-Akt)的磷酸化抑制剂治疗,NRK-52E文化发展与miR-29抑制剂使用白平衡进行了分析。(b)有/没有LY294002曝光,NRK-52E文化被rt - pcr检测培养后随之而来的接触miR-29抑制剂。 。(c) RT-qPCR miR-29c表达的数据集的结果关于概要文件在miR-29c inhibitor-transfected NRK-52E文化。 。

4所示。讨论

这样的数据集的结果揭示小说miR-29c的分子机制是至关重要的早期损伤诱导的肾组织。受损上皮文化可能表现出更杂合的表型与器官纤维化(EMT过程不完整26]。扩散压力和其他相关压力因素,如macrophage-derived TGF -β1、有经验的RIF文化,已经损坏(27]。RIF文化启动主机修理/再生反应反应激活PI3K-Akt通路的影响。TGF -β1触发PI3K-Akt通路,增加胶原蛋白我文化水平在人类间质(28]。这个响应结果在基底膜改性27,29日]。在这个调查中,它发现miR-29c抑制PI3K-Akt的激活途径,抑制Col-1gene的表达,使矩阵重建,并降低了培养细胞的增殖(图5)。Downregulation miR-29c已经观察到TGF -β1-stimulated管状上皮细胞和纤维化的肾脏。此外,miR-29c过度抑制Col-1表达式由TGF -β1,而击倒miR-29c能够提高Col-1表达式(19]。击倒的miR-29c UUO小鼠肾脏阻力指标纤维化也许可以显著增强的强度,取决于αsma,而miR-29c超表达可以增强肾通过抑制肾脏纤维化的发展条件,根据先前的研究30.]。目前,动物研究和相关病理结果在我们实验室正在进行。从动物实验初步结果表明miR-29c可以抑制肾纤维化。


图5
一个模型在NRK-52E miR-29c影响文化。Macrophage-generated TGF -β1抑制miR-29c表达式,从而激活PI3K-Akt通路,从而提高Col-1表达式,采样矩阵和促进文化在RIF扩散。这样一个过程起着至关重要的作用在肾纤维化的病因和miR-29c抑制这一过程。

TGF -β1可以下调miR-29c;然而,这表明它直接影响miR-29c水平。除了通过PI3K-AKT miR-29c-driven ECM形成通路,额外的途径,包括Smad Wnt,和MAPK通路,也与这种机制,促进人类的肾脏成纤维细胞增殖。因此,无序miR-29c表达可能是一个混乱的结果许多至关重要的信号通路与肾纤维化有关。需要额外的调查来确定中间信号通路/ s TGF -配体之间的绑定β1和miR-29c以及交替途径miR-29c-mediated ECM生产和矩阵重建。

miR-29a、miR-29b miR-29c有antifibrotic属性。的差别通过蛋白质组学对这些TGF -β通路,这microrna的家庭改善肾纤维化。TGF -β全身抑制miR-29表达式是由Smad3信号触发器。Smad3结合的SBE miR-29启动子区域和调节的转录率培养近端小管上皮细胞(PTECs)和成纤维细胞,以及post-UUO小鼠体内的肾脏。相比之下,Smad3-deficient老鼠表现出miR-29超表达,改善UUO肾纤维化小鼠模型。根据最近的研究,TGF -β1通过Wnt /调节miR-29c的表达β连环蛋白信号。miR-29c可以作为重要fibrosis-linked microRNA由成纤维细胞产生肾纤维化引起的TGF -β1 / Wnt /β连环蛋白(30.- - - - - -32]。基于这些数据集的结果,本研究假设miR-29c可以抑制引起的RIF TGF -β1通过PI3K-AKT信号通路,在文化研究中被证实。

5。结论

总之,我们的研究表明,TGF -β1激活PI3K-Akt通路矩阵重建,这激活是重要的人类肾成纤维细胞的增殖。miR-29c起着关键作用的抑制PI3K-AKT通路和随后Col-1表达,文化扩散和ECM的合成。目前的研究结果表明,能引起差别miR-29c对这些基因的异常增加RIF矩阵重建和肾纤维化的发病机制中起着关键的作用。这些数据集的结果进一步增加定制PI3K-Akt级联抑制剂的潜在价值,因为他们可以给优惠避免致病人类肾成纤维细胞纤维化的影响。

数据可用性

数据将被要求向作者提供。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

FWF和HJX设计的研究。SPZ执行内的数据分析。FWF和JL XXY起草了手稿。系统修改了手稿。所有作者出版研究批准。

确认

本研究支持的基础研究基金中央大学(排名11620405)。