文摘
有稀缺在体外研究表明为什么富含血小板血浆(PRP)的基本机制是有用的临床管理和天然OA的狗。方法。软骨及滑膜外植体从六个狗挑战与脂多糖(LPS)和培养48 h和platelet-poor凝胶上层清液(ppg)和富含血小板凝胶上层清液的浓度(PRGS) 25和50%,分别。组织外植体的挑战与LPS cocultured / 48 h和文化媒体采样1 48 h il - 1的决心β、il - 10、透明质酸、TGF -β1,PDGF-BB ELISA。结果。il - 1β浓度明显高于在组织外植体组织培养48 h与ppg PRGS在50%和25%相比,剩下的实验小组在任何时候。il - 10和HA提出类似的浓度在所有评估组织在任何时间。TGF -β1和PDGF-BB提出更高浓度的培养基中组织外植体培养和ppg PRGS为50%,随时间减少。结论。分和PRGS浓度显示对软骨的生物学效应有限和滑膜外植体在coculture有限合伙人。甚至分25%和PRGS 50%表现出促炎的影响这些组织在48 h。
1。介绍
骨关节炎(OA)是最常见的pan-articular疾病在人类和动物如狗1]。这个炎症/退行性条件的特征是进行性关节软骨损伤,软骨下骨重塑,滑膜炎,和内部,peri-articular软组织恶化,有时伴有韧带断裂,引发额外的机械损伤继发关节不稳定(2,3]。
OA会出现作为主要(自发)疾病或与韧带疲乏或破裂,从而产生关节不稳定和关节不一致(4]。在人类,OA狗急剧增加是由于全球宠物寿命的增加。研究在英国和美国之间发现OA会影响6.6和20%的狗超过1年的年龄1,5,6),这可能代表了一群1500万只狗独自在美国(3]。
主要的临床症状与OA包括关节积液和残废,指示性的疼痛。这种情况产生共同的损失函数,降低了患者的生活质量。因此,这种疾病的治疗目标管理是集中在控制疼痛,避免关节恶化[3,4]。
不管OA病理生理学的知识的进步2),这种疾病仍然是通过不同的症状治疗,如系统性或关节内注射止痛剂和消炎药,口服保健品伴随着物理治疗,和生活方式的改变,包括运动限制和减肥3,7]。然而,尽管这种疾病可能进步在某些情况下,手术关节置换是一个潜在的最终选择,安乐死也最激烈的决定对于很多业主由于预算限制或担心与他们的狗的生活质量(3]。
再生医学正成为一种新的治疗方法aimed-among更好的情况下,恢复器官或组织的结构和功能受到创伤,炎症,或者退化的过程。有一些令人鼓舞的再生治疗OA的临床管理狗,比如使用干细胞(8- - - - - -12)和富含血小板血浆(PRP) [13- - - - - -17]。然而,从经济和技术角度,PRP可能是一个更普遍的和负担得起的orthobiologic干细胞治疗OA管理精英,特别是在第三世界国家获取干细胞技术有限。
最好的作者的知识,有一个缺乏已发表的研究表明为什么PRP背后的基本机制是有用的临床管理和天然OA的狗。符合这一点,我们提出一项研究评估抗炎和促蛋白合成的影响两个自体hemocomponents(富含血小板凝胶上层清液(PRGS)和platelet-poor凝胶上层清液(ppg))在一次在体外犬骨关节炎的系统,包括犬的coculture软骨及滑膜移植组织的挑战与脂多糖(LPS)。因此,我们测量和比较抗炎和促蛋白合成生长因子的释放浓度转化生长因子β1 (TGF -β1)和血小板源生长factor-BB (PDGF-BB、促炎细胞因子和白介素1 (il - 1)),以及抗炎介质透明质酸(HA) il - 10和合成代谢指标,在OA系统的培养基培养自体PRGS和分浓度(25 - 50%)超过48小时。我们假设PRGS在任何浓度会降低il - 1的释放,增加释放il - 10公顷。
2。材料和方法
本研究通过动物实验委员会的作者的机构。这项研究是根据国际福利指南进行动物实验的小组安乐死美国兽医协会(18),同时考虑到规则在哥伦比亚为危险的狗19]。
2.1。动物
生物材料(血液、软骨及滑膜)用于本研究获得六个临床健康狗(四个女性和两个男性)1.5和3.5岁,平均24.2±2.87公斤的重量。根据哥伦比亚法律,包括所有动物被认为是危险的狗被主人抛弃或扣押。动物与甲苯噻嗪镇静和布托啡诺,然后收到了静脉注射过量戊巴比妥钠(18]。
2.2。血液采集和Hemocomponent处理
全血收集从每个镇静的狗安乐死。短暂,血液通过颈静脉穿刺和获得无菌存入450毫升输血袋包含CPDA-1作为抗凝剂。10毫升血液样本被用来执行自动化血细胞计数。
2.2.1。富含血小板血浆和血浆采购
首先,10毫升血液样本无菌存入15毫升无菌猎鹰管。然后,五10毫升猎鹰管用于PRP处理和五个额外的管道被用于PPP采购。剩下的血液被用于其他与本研究无关的实验或临床兽医教学医院的作者。
PRP是猎鹰的通过一个简单的旋转管在191 g 6分钟。离心法每个血管后,有一个区分包装细胞体积(∼40%)和等离子体(∼60%)。无菌吸管当时介绍附近的巴菲外套和50%的等离子体轻轻吸气,以避免over-aspiration(污染)的红细胞(红血球)和白细胞(白细胞),特别是多形核的细胞。由此产生的等离子体分数(∼15毫升)被认为是PRP,当时与葡萄糖酸钙激活3 h 37°C。此后,PRGS存储在−80°C供以后使用体外外植体组织coculture和il - 1的基底的决心β、il - 10公顷,TGF -β1,PDGF-BB。
购买力平价是通过离心法额外5猎鹰管3500克10分钟。50%的最高等离子体分数被用于实验。这个分数是激活与葡萄糖酸钙3 h在37°C获得platelet-poor凝胶上层清液(ppg),这是类似于PRGS管理。
2.3。软骨及滑膜收割
安乐死之后,整个femoral-tibial地区从两条腿的狗无菌准备联合组织的收获。手术后扼杀博览会,几个从他们的钙化软骨片自由地区获得手术刀从外侧和内侧髁部。此外,周围的髁关节囊是解剖获取滑膜外植体(中小企业)。软骨移植组织(CEs)和中小企业获得通过使用4毫米圆形活检。值得注意的是,中小企业从圆形关节囊轻轻释放之前外植体获得活检穿孔。
2.4。在体外组织外植体Coculture和研究设计
CEs (n= 12)和中小企业(n= 12)从每个狗与磷酸盐生理盐水冲洗和稳定在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)(高葡萄糖,4500 mg / L)与谷酰胺和碳酸氢钠免费从丙酮酸钠(瑞士巴塞尔DMEM Lonza集团有限公司),并配以链霉素(100μ(100 g / mL)和青霉素μ没有添加血清g / mL)。文化是孵化有限公司5%2分辨率大气24 h,然后更换新鲜培养基。在这个时间点,CEs的一部分,中小企业是挑战100 ng / mL的有限合伙人(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)诱导的炎症/分解破坏这些组织,所述其他研究[20.,21]。
六个实验组(两个CEs和两个中小企业coculture)都包括在内。Cocultured组织外植体进行six-well板块(康宁,配角,TC-Treated多个孔板,默克公司,达姆施塔特,德国)总量的3毫升/好,考虑的最终浓度PRGS和ppg化验培养基。研究设计包括两个cocultured组织外植体控制群体的评价(一个有限合伙人和有限合伙人没有)没有添加任何hemoderivatives,以及四个cocultured组织外植体LPS-challenged组织培养PRGS和分在两个浓度(25 - 50%)。所有组织外植体组织cocultured超过48小时。文化传媒(0.5毫升)得到样品在1 h和48 h。这些样本获取、整除、冻结在−80°C为后续生物分子的决心。图1显示了研究设计和方法。
2.5。细胞因子、透明质酸和生长因子测量
il - 1β、il - 10公顷,TGF -β1,PDGF-BB PRGS浓度测定,分,文化传媒(在1和48 h)的组织在coculture外植体组织。这些介质ELISA测定的复制。所有蛋白质化验从研发系统使用商业ELISA开发工具包(明尼阿波利斯,美国)。il - 1β(犬il - 1β/ IL-1F2 DuoSet DY3747)和il - 10 (il - 10 DuoSet犬类,DY735)化验这些介质特有的犬类抗体和HA(透明质酸DuoSet DY3614)确定使用multispecies检测酶联免疫试剂盒。TGF -β1(人类TGF -β1 DuoSet DY240E)和PDGF-BB(人类PDGF-BB DuoSet, DY220)测定使用人类抗体,因为这些蛋白质序列之间的同源性很高的哺乳动物如人类和狗22,23]。此外,类似的ELISA抗体被用于同样的目的在其他犬PRP研究[24,25]。每个酶联免疫试剂盒提供的标准被用来绘制每个标准曲线根据制造商的指示。吸光度读数进行450海里。
2.6。统计分析
Shapiro-Wilk测试是用来评估数据设置为正态分布的拟合优度。所有评估参数表现出正态分布 ,除了hemocomponents WBC计数。PLT的全血、PRP和购买力平价比较使用单向方差分析(方差分析),后跟一个事后图基测试。白细胞计数分析利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验一个Mann-Whitney紧随其后U测试。的女朋友,细胞因子和HA中分和PRGS而使用t以及对未配对样本。
一个广义线性模型(GLM)单变量分析之后Games-Howell测试(必要时),这是用于比较生物分子浓度培养基从每个实验组1和48 h。统计模型评估的相互作用随着时间的推移,从两个层面(1 h和48 h)和实验组六级(对照组,对照组加LPS,分,25%和50%,25%和50% PRGS)。 被接受为所有的测试具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。细胞计数在全血和Hemoderivatives
在全血血小板计数均明显不同,PRP,购买力平价,PRP的最高数量,其次是全血和PPP(图2(一个))。类似的重大发现是观察全血白细胞计数和hemoderivatives。然而,全血白细胞浓度最高,其次是PRP和购买力平价(图2 (b))。
(一)
(b)
3.2。生长因子、细胞因子和透明质酸浓度在富含血小板凝胶和Platelet-Poor凝胶上层清液
基底的浓度il - 1β(图3(一个)),il - 10(图3 (b)HA(图),3 (c)分和PRGS之间(图)相似3(一个)- - - - - -3 (c)),而TGF -β1(图3 (d))和PDGF-BB(图3 (b))浓度明显不同的两国hemocomponents PRGS浓度越高。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。生长因子、细胞因子和透明质酸浓度在文化媒体1和48 h
il - 1β浓度有显著 受到时间的影响,实验小组,他们的互动。
实验群体对待分25%和PRGS 50%有显著提高这些促炎生物分子浓度相比,相同的组1和48 h。il - 1β浓度明显高于在组织外植体组织培养与PRGS 50%,分在25%在48小时相比,剩下的实验小组在任何时候。
值得注意的是,在这个分解代谢的分子的浓度显著高于组织外植体培养PRGS 50%在48小时比文化传媒组织外植体的文化同时分25%(图4(一))。
(一)
(b)
il - 10含量明显 受到时间的影响,实验小组,他们的互动。所有的实验小组,除组织外植体培养与PRGS为25%,呈现类似的浓度的抗炎生物分子。然而,滑液膜和CEs cocultured PRGS 25%表现出显著 更高的il - 10浓度在1 h实验相比,组织培养分和PRGS 50%然后显著 减少在48 h(图4 (b))。
透明质酸浓度培养基从实验只组明显 受时间和这个与实验小组的互动因素 。在一般情况下,这种合成生物分子倾向于更低的浓度在48小时相比,获得的浓度在类似的实验小组在48小时相比,这两个组织外植体控制组织,这些组织孵化PRGS 25% 1 h。这种现象明显明显组织外植体培养分25% 1 h(图5)。
TGF -β1和PDGF-BB浓度都显著 实验组的影响因素、时间和他们的相互作用。TGF -β1浓度在1 h明显 不同培养基从两个对照组,两组培养与分25%和50%,两组培养PRGS在25%和50%。
类似的浓度模式这个女朋友是注意到在48小时;然而,尽管不重要的,有一个减少的TGF -β1浓度在文化媒体组织外植体组织培养PRGS浓度和略有增加浓度的培养基的女朋友两对照组组织外植体和培养与分浓度(图6(一))。另一方面,1 h, PDGF-BB浓度明显高于实验组织培养的培养基与PRGS相比其余实验小组。然而,在48 h,这个女朋友的浓度减少文化媒体组织外植体培养PRGS,特别是在50%;然而,他们PDGF-BB浓度仍明显高于其余实验相比,组(图6 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
从机械的角度来看,办公自动化已经被认为是一种疾病,是由一个失衡锁不住的合成代谢和分解代谢,维持体内平衡。因此,当分解代谢的因素占主导地位,临床疾病变得更加明显(26- - - - - -28]。有几种生物分子与保持健康联合环境,而其他人则过度繁殖一旦OA触发过程(29日]。轴承这一点,我们选择了关键的生物分子,如细胞因子(il - 1β和il - 10), GFs (TGF -β1和PDGF-BB)和合成代谢中介哈,涉及关节内稳态和疾病的影响评估两个platelet-related hemocomponents (PPRGS和PRGS)在某种程度上在两个浓度在短的时间内(48小时)在体外系统,包括中小企业的coculture与LPS CEs的挑战。
il - 1β被选中,因为这种促炎细胞因子和异化的涉及的主要介质负责关节炎症,软骨侵蚀,软骨细胞异常凋亡[27,30.,31日]。因此,它提出了封锁这个分解代谢的细胞因子可能是一个治疗的目标控制或改善OA (31日,32]。然而,同样重要的是要考虑,在生理条件下,这种细胞因子是重要的维持关节内稳态通过调节基质金属蛋白酶(MMPs) [30.]。il - 10是包含在本研究由于其chondroprotective效应在OA组织通过增加II型胶原蛋白的合成和aggrecan下调促炎细胞因子的表达和分泌,如il - 1β和TNF-a。此外,这个抗炎细胞因子抑制软骨细胞凋亡的差别,对这些基质金属蛋白酶(27]。
公顷被选为本研究因为这nonsulfated粘多糖产生的B型滑膜成纤维细胞和软骨细胞的关键重要性在维持关节润滑和粘弹性和改善软骨抗压刚度属性(33]。因此,HA的生产可能会被视为一个潜在生物标志物评估hemocomponents评估的影响在目前的研究。此外,我们还包括评估TGF -β1和PDGF-BB浓度合成代谢和抗炎生物分子与OA积极影响组织和为什么他们都包含在platelet-related supraphysiologic浓度产品(17,25]。
例如,TGF -β1扮演几个角色在正常软骨和营运过程中。在正常情况下,这个女朋友是至关重要的细胞外基质(ECM)营业额增加II型胶原蛋白的合成,aggrecan,和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)。这个生物分子有敌对的行动对异化的软骨退化细胞因子,如il - 1β和肿瘤坏死因子-α(28]。另一方面,PDGF-BB促有丝分裂的,合成生物分子为软骨。它促进干细胞移植软骨缺陷和提高软骨细胞增殖和分化以及蛋白合成。此外,这个女朋友可以抑制il - 1β软骨分解代谢的影响的核因子k B (NF表达下调κB)信号(31日]。
的在体外LPS引起的软骨损伤的系统(OA)在目前的研究中是一种常见的和广泛的验证方法,阐明致病机制在营运过程中(34)或调查几个治疗物质的影响(35- - - - - -38),包括platelet-related产品(39,40]。一般来说,有限合伙人可以与toll样受体(TLR)滑膜成纤维细胞或软骨细胞(例如,TLR4和TLR-IL-1)的发生与促炎的防御被NF的激活κ诱导il - 1 B转录β和肿瘤坏死因子-αupregulation随后炎性刺激(20.,34,41]。
PRP-related产品(PRGS)评估在目前的研究中是一个副产品来自血小板集中归类为纯PRP,特点是一个非常低的或可以忽略不计的白细胞浓度(42]。值得注意的是,这些类型的PRP产品更有效治疗关节病PRP制剂相比,丰富的白细胞(15,16,43),这被称为白细胞PRP (L-PRP) [42]。然而,一个实验性研究狗没有发现两种PRP产品之间的区别的关节软骨修复(44]。另一方面,PRP评估在这项研究中提出了PLT计数低于先前报告的临床研究与OA(狗15- - - - - -17]。然而,正如前面提到的,类型的释放血小板评价集中在本研究提出了一个重要的介质浓度有可能诱发生理反应的组织处理。
根据综述文献,没有发表的研究评估PRP产品在软骨的影响,中小企业,孤立的软骨细胞,或滑膜成纤维细胞在狗。这个事实让我们在本研究获得的结果进行比较在体外实验上执行不同的动物种类,如马(39,40)和人(45]。符合这一点,il - 1β培养基的浓度在1 h所有评估群体仍低,突然增加在这些组织外植体培养48 h与分25%和PRGS为50%。本研究的结果不同于那些通过Sundman et al。45),没有检测il - 1β显著的浓度培养基从人类软骨和OA滑膜cocultured P-PRP产品96 h。有限合伙人添加到培养基从实验小组在当下研究可能导致一种更健壮的炎症反应,在这些加剧了组织外植体组织培养与分25%,特别是PRGS为50%。
从机械的角度来看,这促炎细胞因子的浓度的增加在文化媒体的实验小组在48小时可以与不同的细胞响应由两hemocomponents中包含的特定生物分子的浓度。然而,不幸的是,在这个体外的犬OA系统,我们测量有限数量的介质可能有助于建立更高的il - 1β浓度是平行与另一个职业,或者增加抗炎生物分子,如肿瘤坏死因子-α,il - 1受体拮抗剂(IL-1ra)和il - 4。
符合这两个马在体外研究[39,40),独立评估的影响类似hemocomponents滑膜和软骨移植组织的挑战与有限合伙人提出类似的TNF -α在48 h浓度培养基;然而,这些组织外植体培养与hemocomponent富含血小板(PRGS)表现出更好的抗炎概要文件增加IL-1ra浓度和il - 4比hemocomponent贫穷产生的血小板(ppg)。此外,我们观察到一个类似的促炎反应模式从马挑战与有限合伙人和韧带外植体培养与两相的反应表现为类似hemocomponents il - 1的显著增加β在第一个48 h,紧随其后的是一个戏剧性的下降在96 h (46]。因此,预计PRGS 50%可以引起最初的健壮的促炎组织反应,主要是由PDGF-BB浓度高。不幸的是,目前的评估阶段的研究仅限于48 h。
我们观察到文化媒体组织外植体在coculture表现出非常相似的il - 10浓度1和48 h,与组织外植体的免税集团对待PRGS高达25%,这提出了一个更高浓度的生物分子在第一个小时然后在48小时显著下降。可能的具体浓度介质中包含这个hemocomponent 25%有诱导一种更健壮的释放的抗炎细胞因子在第一个小时比其他评价hemocomponents在不同浓度,可能由细胞concentration-sensitive受体刺激特定中介的il - 10的生产。然而,它似乎是,尽管生产的细胞因子被PRGS刺激在25%在第一个小时,有补偿机制,诱导变性相同的量更多的长时间保持在一个最佳的浓度,观察抗炎细胞因子,如il - 4 (39,40]。这最后的假设可以表明为什么PRP注射人类OA的膝盖没有影响il - 10的滑液浓度随时间(47]。
另一方面,我们观察到HA是由组织coculture外植体组织。一般来说,这个中介的生产可能主要是由LPS刺激1 h。然而,在48 h, cocultured组织外植体分呈现显著降低25% HA浓度相比对照组和相同的hemocomponent 1 h,这可能表明,这种物质在25%无法逆转的分解效果有限合伙人在48 h。值得注意的是,HA释放模式从我们的研究是评估在很短的时间内(只有48小时)。这个事实可能会限制我们的结果的解释,因为最健壮的反应在哈马生产联合组织外植体已经观察到96 h (20.,39]。因此,有必要进行新的研究评估的影响这些类型的hemoderivatives犬长期联合组织。
我们观察到TGF -的浓度β1所有cocultured组织外植体的文化群体治疗与在任何浓度呈现高hemocomponents GF浓度在1 h,其次是明显降低在48 h。然而,PDGF-BB浓度,特别是PRGS高达25%,大大减少在48 h。一般来说,类似的这些介质浓度模式曾被观察到在马其他研究由我们组软骨及滑膜外植体培养独立的(39,40]。
目前的研究也有一些局限性,必须承认,提高读者的理解。首先,这是一个在体外研究涉及生物系统,包括一些更大的迷代表病人或关节受到OA的影响。值得注意的是,它提供了有用的信息告知更为理性的OA的未来研究动物模型和OA患者。一般来说,本研究的结果出人意料,因为所有评估hemocomponents产生抗炎作用有限,他们中的一些人(分25%和PPRGS 50%)甚至明显促炎。这些有争议的结果的原因可能与短期(只有48 h)的研究中,这可能限制了生物过程与生物分子的生产评估。因此,未来的研究应该在长时间内执行。
5。结论
在浓度,分和PRGS显示有限的生物效应与有限合伙人在coculture软骨和中小企业,而甚至分25%,PRGS 50%表现出促炎效应在这些组织48 h。值得注意的是,应该进行进一步的研究来评估的影响hemoderivatives在长时间学习。
数据可用性
本研究中使用的数据是根据客户要求提供相应的作者。
信息披露
这个手稿代表MSc的一部分论文的第一作者(MG)兽医学硕士卡尔达斯大学的计划。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究是由Vicerrectoria de Investigaciones y Postgrados卡尔达斯大学,马尼萨莱斯、哥伦比亚(批准号0417118)。