文摘
本研究旨在确定蜱虫物种——奶牛在内罗毕,肯尼亚,他们港口的病原体。虽然蜱虫是众所周知的向量的主要致病菌的兽医重要性和公共卫生的重要性,很少有研究调查蜱虫物种的范围和相关的病原体,特别是出现在独特的乳制品生产系统,妥协动物福利,比如那些在城市周边地区。进行横断面研究314名随机挑选109年奶牛小农农场。每只动物检查以蜱形态标记识别在物种水平紧随其后。从每一个节拍,基因组DNA提取和16 s rDNA基因放大了病原体识别。序列的扩增子和随后BLASTn分析,多重序列比对,和系统发育重建进行确认病原体的物种。六十六人(21.0%)的牛了蜱虫。总共有94成年蜱虫在牛被发现,这些,63(67.0%)、18(19.1%)和13个属(13.8%)扇头蜱属,科学家,和Hyalomma,分别。十二蜱虫的物种扇头蜱属属和两个科学家和Hyalomma属被确定。虽然Rh。decoloratus是最常见的蜱虫(24.5%(23/94)),新兴的吗Rh。microplus(6.4%(6/94))也确定了。的DNA立克次氏体发现蜱虫,立克次氏体conorii在h . rufipes和答:variegatum,立克次氏体aeschlimannii在Rh。microplus和h . rufipes而埃立克体属ruminantium和e .犬属在答:variegatum。总之,蜱虫物种的研究报告广泛存在于研究区域包括扇头蜱属microplus,这是一个新兴的蜱虫物种肯尼亚部分地区。虱子怀有的DNA立克次氏体和埃立克体属,强调可能的动物和人类的健康问题。因此,有效的蜱虫控制策略仍然是最重要的防止与包庇病原体相关的潜在疾病。
1。介绍
蜱虫是重要的媒介疾病的兽医和公共健康问题。他们是仅次于蚊子在动物和人类病原体的传播1]。他们已知传输各种病原体包括细菌、立克次氏体、病毒和原生动物,在经济上重要的家畜(2)和人畜共患的潜力(3,4]。除了病原体的传播,会导致动物蜱虫担心和不良反应(5]。蜱传播的疾病的发生与各自的蜱虫向量的空间分布(6]。不可避免的气候变化、人口增长和土地利用模式和畜牧业实践不断发展的变化在肯尼亚的一些原因,导致蜱传播的疾病的流行病学和多样性的变化(7,8]。在肯尼亚有有限的研究,确定了蜱虫物种现在和他们港口的病原体。这样的研究主要集中在牧区(9,10)和livestock-wildlife接口(11,12)几乎没有关注蜱虫出现在独特的生产系统,如那些在内罗毕城市周边地区。
奶牛饲养是一种常见的实践内罗毕城市周边地区的县,肯尼亚,他们已经建立了以满足不断增长的牛奶消费的城市人口近430万人(13]。这些生产系统的特点是不合格的畜牧业的做法,该妥协动物福利(14,15]。不合格的畜牧业实践主要是由于广泛的城市的城市周边地区土地细分导致小尺度土地种植饲料[牛住房和最小的空间16]。破坏动物福利与免疫力下降有关,从而诱发动物疾病(17]。由于土地细分,牛的草和饲料这些生产系统是来自不同地区的国家引入的风险范围广泛的蜱虫物种的动物。
最近的一份报告由彼得·et al。18]表明牛各种蜱传播的病原体的感染这些城市周边地区的内罗毕。本研究进行了进一步识别发现蜱虫附着在这些牛和屏幕红孢子虫属、埃立克体属和立克次氏体病原体。理解蜱虫物种在一个给定的地区被用作指导从疾病条件期望(19]。这个信息是重要的指导蜱虫控制程序,因此预防相关疾病的暴发。
2。材料和方法
2.1。伦理批准
本研究通过生物、动物使用和伦理委员会(BAUEC)兽医学院,肯尼亚内罗毕大学(有限体积法BAUEC / 2016/122)。适当的物理限制在迷恋做牛蜱虫的收集,确保动物没有斗争和所有其他动物福利问题都强烈地坚持。之后详细说明研究的动物的主人,是口头同意之前招聘的动物研究。
2.2。研究区域
这项研究是在内罗毕城市周边地区进行城市县如前所述[20.),和方法描述部分再现了措辞。内罗毕,肯尼亚的首都,位于这个县。县位于1.28333 36.81667经度和纬度,海拔1795米,由17个县下,最多的行政单位在肯尼亚一个县。为了数据收集、县映射到四象限以中央商务区(CBD)为中心。在每个象限的,最高的县下牛人是有目的的选择。因此,县下确定是威斯兰德(北象限),Kasarani(东象限),朗'ata(南象限),和Dagoretti(西象限)。
2.3。研究设计
这是2017年1月到5月之间进行的一项横断面研究奶牛招募的一项研究[18)检查对蜱虫不同身体部位。在县下,数据库由县下兽医官员被用作随机选择采样帧的农场。随机抽样是在农场级别使用识别牛被包括在研究中。109年共有314头牛中加入了奶牛场的研究。每个动物都克制的迷恋和身体检查出现蜱虫的头,耳朵,脖子,垂肉,侧翼,腹侧腹部和会阴区域。
2.4。蜱虫收集和形态学鉴定
所有发现蜱虫附着在牛选择使用钳采取预防措施不打破口器。他们存储在标签容器包含70%的酒精在运输之前的寄生虫学实验室部门兽医病理学、微生物学和寄生虫学,内罗毕大学。蜱虫的形态学鉴定物种水平完成基于分类键如颜色、形状和大小的头状花序,眼睛,节日的存在与否,标点符号,在甲状软骨或conscutum槽,存在与否adanal盾所描述的沃克et al。21使用双目显微镜)。每个确定蜱虫是存储在一个单独的标签集合管含有70%的酒精。
2.5。DNA提取蜱虫
蜱虫从70%的酒精中删除,风干,在蒸馏水冲洗两次干滤纸。从蜱虫基因组DNA提取使用DNeasy血液和组织工具包(试剂盒、希尔登,德国)制造商的指示。只在没有吸血蜱虫DNA提取进行避免PCR抑制过剩红细胞所推荐的Silaghi et al。22),避免混淆与蜱虫血DNA。DNA的质量验证使用QIAxpert幻灯片QIAxpert机(试剂盒、希尔登,德国),并证实了完整性运行5μl使用1%的筛选了DNA琼脂糖凝胶(σ,美国)。DNA是储存在−20°C等待分析。
2.6。聚合酶链反应(PCR)扩增和测序的病原体在蜱虫的DNA
聚合酶链反应进行16 s rDNA使用前所述基因引物和协议(18]。为红孢子虫属物种,正向引物5′ANAF -TAGTGGCAGACGGGTGAGTA-3′和反向引物5′ANAR -AATTCCGAACAACGCTTGCC-3′被用来产生一个大约424个基点的乐队,而为埃立克体属物种正向引物5′EHRF -AGCTGGTCTGAGAGGACGAT-3′和反向引物5′EHRR -GAGTGCCCAGCATTACCTGT-3′针对16 s rDNA的约838个基点。重蒸馏的水被用来作为消极的控制。进行PCR扩增反应的热循环(应用生物系统公司Veriti 96 -热循环、热费舍尔)。放大产品是使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳Tris-borate-EDTA(此种)缓冲区,pH值8日与溴化乙锭染色,可视化使用紫外线照明器(UVP GelMax®125成像仪,美国)。扩增子的大小确定使用分子梯(GelPilot 1 kb +阶梯(100)试剂盒,德国)。结果PCR扩增子被净化,桑格测序在Macrogen欧洲实验室(阿姆斯特丹,荷兰)使用相同的正向和反向引物PCR。获得的序列被认为和手动验证使用色谱峰,编辑,和组装使用CLC主要工作台6.8.3软件(CLC生物,试剂盒GmbH,德国)。
2.7。DNA序列分析
从16 s rDNA获得序列的基因进行分析使用基本的局部比对搜索工具核苷酸(BLASTn),多重序列比对(MSA)和系统发育重建。BLASTn序列被用来确认身份,MSA和系统发育重建确定之间的关系研究孤立和来自世界其他地区。多重序列比对是使用Log-Expectation(肌肉)v3.8.31 [23]。序列相似性计算使用Clustalω获取单位矩阵(24]。系统发育重建做了使用大型6.0 (25]。进化历史推断使用最大似然方法基于Tamura-Nei模型(26]。初始树启发式搜索得到自动neighbor-joining和BioNJ算法应用到一个矩阵的两两距离估计使用的最大组合可能性(制程)方法,然后选择拓扑优越对数似值。所有职位包含漏洞和缺失的数据都消除了。的比例复制的树分类群聚集在一起,引导相关测试(1000)复制了旁边的树枝(27]。
3所示。结果
3.1。蜱虫的形态学鉴定
314年的动物研究,21.0%(66/314)被发现与一个或多个蜱虫出没。总共有118成年蜱虫附着在被发现牛时取样,但24被塞得满满的;因此,只有94蜱虫进一步进行分析。蜱虫中分析,十二蜱虫的三个属的物种扇头蜱属(Rh。),科学家(一个。),Hyalomma(H。)被确定(表1)。绝大多数(67%(63/94)的人扇头蜱属物种,而Hyalomma物种最少(13.8% (13/94))。在扇头蜱属属,Rh。(b)。decoloratus是最常见的蜱虫物种和蜱虫被确认为只有一个吗Rh。praetextatus。扇头蜱属microplus(牛蜱属)还确定了6%(6/94)的检查了蜱虫。科学家variegatum和Hyalomma rufipes在各自的属是最普遍。所有的蜱虫物种只有在牛从Kasarani县下。
3.2。病原体DNA发现蜱虫——奶牛在内罗毕小农农场在城市周边地区
使用底漆之前使用的彼得et al。18)检测红孢子虫属物种,25.6%(24/94)的样品产生预期的PCR乐队大约在424个基点。八个代表扩增子选择排序。BLASTn分析,七人的DNA立克次氏体和一个红孢子虫属羊属(表2)。
的DNA红孢子虫属羊属中检测出Rh。evertsi evertsi蜱虫,而所有的三个发现蜱虫属港口的DNA立克次氏体物种。的DNA立克次氏体aeschlimannii中检测出Rh。(牛蜱属)microplus和Hyalomma rufipes蜱虫。另一方面,的DNARi。conorii中检测出科学家吉玛和答:variegatum(表2)。立克次氏体conorii检测序列扩增子的62.5%(5/8),表明序列相似性在98.30%和99.38%之间。立克次氏体aeschlimannii确认两个测序的扩增子(25%(2/8))的序列相似性在99.30%和99.76%之间(表吗2)。
使用引物的检测分析埃立克体属94蜱虫的物种,分析,8.5%(8/94)是积极的PCR乐队大约在838个基点。五个代表性样本测序检测的病原体。三个序列的一个Rh。(牛蜱属)decoloratus和两个从a . variegatum是类似于犬埃立克体属用一个序列的身份(表99.76至100%3)。一个隔离答:variegatum100%相似e . ruminantium而其他序列Rh。sanguineus是一个身份不明的埃立克体属密切相关埃立克体属种虫害隔离KX987325来自中国武汉。两个科学家variegatum蜱虫观察合并感染两个病原dna:一个Ri。conorii和e .犬属(隔离508 b)和其他Ri。conorii和大肠ruminantium524(隔离)(表2和3)。
3.3。多序列比对的立克次氏体和埃立克体属物种的DNA与蜱虫——从内罗毕城市周边地区奶牛
多重序列比对是在完成的Ri。conorii和e .犬属隔离检测牛在内罗毕城市周边地区,肯尼亚。的核苷酸序列立克次氏体conorii基因出现多样化与多个核苷酸序列多态性(snp)(图1)和核苷酸多样性高达4%(表4)。相比之下,核苷酸序列犬埃立克体属是高度保守的。
3.4。系统的定位立克次氏体和埃立克体属物种的DNA发现蜱虫Infesting从内罗毕城市周边地区奶牛
系统发育分析是为了证实的DNA序列立克次氏体和埃立克体属检测和识别全球其他隔离的遗传相似度(数字2和3)。Ri。conorii肯尼亚隔离密切相关,对那些来自美国,中国,埃及和尼日利亚,但不同于那些来自赞比亚和乌干达。立克次氏体aeschlimannii肯尼亚的隔离与孤立被聚集到一起从塞内加尔(KY229715.1)和黎巴嫩(HM050274.1)(图2)。
另一方面,犬埃立克体属隔离来自肯尼亚的蜱虫狗密切相关隔离从伊拉克和土耳其和蜱虫从乌干达隔离(图3)。大肠ruminantium分离菌答:variegatum在这个研究是集中在一起,从牛蜱虫隔离来自坦桑尼亚和其他隔离在南非和美国。身份不明的埃立克体属物种是密切相关的e .犬属和大肠minasensis但冷淡地从大肠ruminantium。
3.5。核苷酸序列加入数字的病原体检测确定肯尼亚蜱虫
部分16 s rDNA基因序列获得病原体在蜱虫从这项研究沉积下的基因库加入以下数字:MT366066 MT366070Ri。conorii,MT366164 MT366165Ri。aeschlimannii,MT366207红孢子虫属羊属,MT734401 MT734403e .犬属,MT738235e . ruminantium和MT738242不明埃立克体属物种。
4所示。讨论
蜱虫感染与所有的研究中相对较低的牛蜱虫收集来自Kasarani县下。蜱虫感染的问题,因此蜱传播的疾病已被记录为一个挑战在内罗毕小农乳品业在城市周边地区28),特别是在Kasarani县下(29日]。然而,增加使用杀螨剂,这是一个常见的做法在小农奶牛场在肯尼亚(30.),旱季时抽样(21),可以解释低蜱虫感染在这项研究报道。
的高蜱虫感染Kasarani县下与开放的牧场,吸引有关田园牲畜从邻近卡贾多县,通常很大程度上爬满了虱子(31日]。尽管沉重的侵扰,但通常是最小影响田园牛的健康因为他们表现出一定程度的抗蜱传播的疾病(30.]。然而,他们的牧场污染蜱虫。自切,路边的饲料喂养牲畜的常见的方法在这一领域(16,32同时,蜱虫带到zero-grazed牛。
蜱虫的属扇头蜱属包括亚类牛蜱属,科学家,和Hyalomma在这项研究中发现。蜱虫在这三个属在肯尼亚之前报道(33)、坦桑尼亚(34)、乌干达(35),和埃塞俄比亚(36]。广泛的物种中确定本研究可能是受到支持蜱虫的有利气候条件向量(4,7]。蜱虫在这些属包括传播疾病的重要物种的经济影响畜牧业生产以及那些关注人类健康的21]。
非洲蓝色蜱虫(扇头蜱属(牛蜱属)decoloratus)是最常见的蜱虫物种识别研究中牛。这种蜱虫是最普遍的一个宿主蜱虫在东部,中部,南部非洲(37,38];因此,这些结果并不令人惊讶。它是已知的传输巴贝西虫bigemina(39),红孢子虫属边际(40),这是流行的病原体在研究区28]。的确,答:边际的样本中检测出牛的蜱虫收集(18]。
亚洲蓝色蜱虫(Rh。(牛蜱属)microplus)是研究中还发现了牛。这种蜱虫在肯尼亚沿海地区首次报道Hoogstraal和沃克(41),自那以后,没有报告这种蜱虫直到最近当Kanduma et al。12]这滴答Kwale县使用分子标记的特征。这些蜱虫物种高度侵袭性和已报告代替Rh。(牛蜱属)decoloratus在地区蜱虫物种存在(42,43]。他们是经济最重要的亚类牛蜱属由于他们在致命的传播作用巴贝西虫宝感染(44)和小说大肠minasensis(45]。蜱虫的鉴定物种在这个国家的其他地方意味着可能出现感染的地区没有以前的报告。事实上,Adjou Moumouni et al。46和彼得et al。18报告的存在b宝和大肠minasensis第一次牛在内罗毕城市周边地区,分别提出的可能存在向量蜱虫Rh。牛蜱属microplus在这个研究报告。不受控制的在肯尼亚动物运动(7并继续已经提出气候变化的关键驱动程序在不同的蜱虫物种的传播47]。
在这项研究中,棕色的狗蜱虫(扇头蜱属sanguineus),一般寄生于犬,时下的牛被发现。大多数农场的牛被取样观察养狗,可能解释这些蜱虫的存在。这可能导致感染的牛狗类病原体等红孢子虫属匹敌正如前面观察研究牛(18在世界其他地方的[]和报告48,49]。扇头蜱属sanguineus还发现港口不明埃立克体属物种,聚集在一个不同的进化枝e .犬属的病原体是什么Rh。sanguineus已知向量(50,51]。全基因组测序的未知埃立克体属病原体将阐明其身份,并研究其致病性牛和的作用Rh。sanguineus在其传播是必要的。
红孢子虫属羊属、羊的无形体病的病原体检测扇头蜱属evertsi evertsi附加到牛相似的报告Berggoetz et al。52]。虽然这种病原体通常是孤立的小反刍动物(53),共享主机不同的蜱虫物种可能使蜱虫获得多个病原体不同血餐(54]。这些病原体的检测在蜱虫并不总是意味着向量的能力(6,55时可能发生),但机械传动易感宿主如牛接触感染蜱虫(54]。
科学家variegatum和答:芽在这项研究中发现。科学家物种是最重要的蜱虫物种在非洲传播破坏性动物疾病如heartwater疾病(43,56]。这些蜱虫物种曾在肯尼亚被确认和报告(10,33]。立克次氏体conorii中检测出答:variegatum蜱虫,先前的一项研究报告的穆塔伊et al。38在肯尼亚]。虽然Ri。conorii已经检测到经常在吗Rh。sanguineus,这是文档向量蜱虫(57,58),它也可以探测到在其他蜱虫物种59]。科学家物种已经被称为主要水库的DNA立克次氏体在非洲(60),因此,这是不足为奇在这些蜱虫检测这些病原体。高的吸引力科学家蜱虫对人类[1)增加了人类感染的病原体的风险。
在这项研究中,科学家variegatum还发现港口吗e .犬属和大肠ruminantium在两种情况下合并感染的DNA立克次氏体spp。这不是令人惊讶的发现大肠ruminantium在答:variegatum蜱虫因为它们是病原体的记录能力向量(61年,62年和以前报告在肯尼亚63年]。自答:variegatum强烈被涉及的传播立克次氏体物种(64年,65年),双方的检测立克次氏体物种和大肠ruminantium是可能的(66年]。的激进的喂养习惯这种蜱虫物种在不同的主机上(10也许可以解释发现的蜱虫e .犬属,这是一种病原体的狗,本研究报告的合并感染。
Hyalomma rufipes和Hyalomma truncatum本研究亦发现了。之前这些蜱虫物种已报告在肯尼亚的各个部分(33,56,63年]。立克次氏体aeschlimannii中检测出Hyalomma rufipes在这项研究中。Hyalomma物种的文档向量Ri。aeschlimannii(60]。这种病原体是第一个发现和特点Hyalomma marginatum在摩洛哥[67年),自那时以来,它已被隔离在不同种类的Hyalomma蜱虫在肯尼亚(9,63年)、埃塞俄比亚、乍得(68年],塞内加尔[59),和欧洲69年,70年]。此外,Ri。aeschlimannii也发现Rh。microplus蜱虫。这种病原体的检测Rh。(牛蜱属)microplus并不奇怪,因为穆塔伊et al。38和急性脑病等。54)检测到这种病原体的密切相关的物种Rh。(牛蜱属)annulatus分别连接到牛从肯尼亚和尼日利亚。此外,普里托里厄斯和Birtles [71年)还发现了Ri。aeschlimannii在Rh。appendiculatus从南非蜱虫。这表明Ri。aeschlimannii可以发现在许多其他蜱虫物种虽然向量为这些蜱虫物种需要评估能力。
虽然能力向量的蜱虫物种携带病原体识别在这项研究中尚未建立,他们承认在这些蜱蜱虫心怀病原体,扩展了知识——内罗毕城市周边地区的奶牛。病原体的监测蜱虫被看作是一个好的开始抢占病原体可能会感染动物和人19]。此外,蜱虫物种的识别和检测的病原体港口各领域的国家被视为开发适当的蜱虫的先决条件控制程序在有针对性的蜱虫(2]。
在这项研究中,Ri。conorii和Ri。aeschlimannii,动物传染病的病原体,被发现在蜱虫——牛。立克次氏体conorii与发热性疾病造成严重的发病率有关(72年游客从肯尼亚回来[]甚至死亡病例。73年),而Ri。aeschlimannii,这是病原体密切相关,体现与轻微疾病(74年]。感染人类立克次体病的发生与接触国内动物或宠物作为储存宿主的蜱虫叮咬出现(54]。事实上,Thiga et al。75年]报道更高seroprevalence和浓度的斑点热群立克次体病(SFG)牧民保持大量的家畜比其他社区在肯尼亚。发热性疾病的疟疾和伤寒立克次体病常见的困惑了,尤其是在非洲,包括肯尼亚在这些疾病流行[76年,77年]。在肯尼亚,有证据表明,立克次体病导致很大比例的发热病例在医院(78年]。
因为蜱虫仍然终身感染立克次体病而传输transstadially和卵巢(58),公共卫生检测带来的风险是在蜱虫(54,74年]。此外,因为狗和反刍动物的涉及国内水库立克次体病(79年),一个遍及全国的监测了解国内水库的状态信息。此外,进一步描述立克次氏体物种和品种中发现蜱虫和牛使用更具体的引物针对外膜蛋白(Omp和OmpB),柠檬酸合成酶,17 kDa的蛋白质(80年,81年)是必要的。
16 s rDNA基因是用来推断系统发生学的病原体检测蜱虫从这个研究。立克次氏体物种有一个高度保守的基因组,线粒体16 s rDNA之前一直用来检测蜱虫微生物(82年- - - - - -84年]。立克次氏体conorii发现在这个研究显示高多样性和密切相关的隔离尼日利亚,美国和中国,但不同于那些来自乌干达和赞比亚。这表明不同的变体立克次氏体在研究区可能存在一些可能是惟一的肯尼亚。e .犬属隔离是高度保守的,类似于孤立的来自土耳其,伊拉克,和邻国乌干达,一个建议的菌株可能类似于孤立的世界和他们的介绍可能与国际宠物运动有关,已与病原体传播(85年]。
这项研究的局限是在旱季进行的,因此可能无法提供整个光谱的蜱虫物种和相关病原体预计将在研究区域。未来的研究覆盖干燥和潮湿的季节将提供一个更大的多样性在这些城市周边地区蜱及其病原体。
5。结论
肯尼亚内罗毕城市周边地区的奶牛,与不同的蜱虫物种属出没扇头蜱属,科学家,和Hyalomma。虱子怀有不同的DNA埃立克体属物种包括dog-associated犬埃立克体属和人畜共患立克次氏体病原体。这突显出动物的健康威胁和公共健康问题造成这些蜱虫在奶牛的侵扰。因此,有效的控制这些蜱虫控制仍然是最重要的病原体。牛的角色作为dog-associated替代宿主病原体等e .犬属需要调查中发现蜱虫——牛,特别是当牛靠近狗。需要发现蜱虫物种使用特定基因的分子特征如空隙(其)和CO1基因确认新兴侵入性的存在Rh。microplus蜱虫在肯尼亚各县。
数据可用性
使用的数据在这个手稿可从相应的作者的请求。病原体的DNA序列分析可以在基因库加入使用数字表示在这个手稿。
信息披露
这手稿是博士论文的一部分,以前公布的(86年由第一作者)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
HWK下界,果阿DWG、纳米和CMM设计研究;SGP和DWG收集数据;HWK,下界和纳米分析数据。所有作者都参与起草,阅读,和批准最终提交的手稿。
确认
作者感谢实验室支持理查德先生Omulo Otieno在蜱虫在分子识别和阿尔弗雷德Mainga先生实验室。作者表达自己真诚的感谢威斯兰德的农民,Dagoretti,朗'ata, Kasarani内罗毕县下县同意他们的动物被纳入本研究。这项研究受到了非洲联盟高级研究培训(法令)。法令是共同领导的非洲人口和健康研究中心和威特沃特斯兰德大学的和由纽约卡耐基基金会资助(批准号B 8606. r02), Sida(批准号54100113),非洲三角洲计划(批准号107768 / Z / 15 / Z),和德国Akademischer Austauschdienst(德意志)。三角洲非洲倡议是一个独立的非洲科学院的资助计划(AAS)的加速科学卓越联盟支持的在非洲(AESA)和非洲发展新伙伴关系计划和协调机构(NEPAD机构)与资金来自威康信托基金会(英国)和英国政府。陈述和观点是完全的责任。