分子的患病率和识别犬埃立克体属和红孢子虫属匹敌从狗不南通鞣制,缅甸

文摘

蜱虫向量不同类型的病毒、原生动物,和其他微生物,包括革兰氏阴性属的原核生物立克次体,埃立克体属,红孢子虫属,包柔氏螺旋体。犬单核细胞的埃立克体病毒传染所致犬埃立克体属和狗循环血小板减少所致红孢子虫属匹敌兽医的重要性。在缅甸,有有限的信息有关蜱传播的病原体,埃立克体属和红孢子虫属spp。以及这些物种的遗传特性。我们执行嵌套PCRgltA属的基因埃立克体属种虫害的16 s rRNA基因属红孢子虫属种虫害的血液样本400看似健康的狗不南通鞣制区域。这些扩增子序列与其他序列从基因库。400狗的血液样本中,3例(0.75%)阳性e .犬属和1个(0.25%)呈阳性答:匹敌。的部分序列e .犬属gltA和答:匹敌16 srrna基因获得非常相似e .犬属和答:匹敌从不同的其他国家孤立。

1。介绍

蜱传播的细菌和寄生虫是家犬的重要病原体,潜在的公共卫生意义。至少五个细菌物种,犬埃立克体属,大肠chaffeensis,大肠ewingii,红孢子虫属匹敌,答:phagocytophilum,在国内已报告的狗1]。e .犬属由布朗transstadially传播狗蜱虫,扇头蜱属sanguineus,所有饲养阶段的蜱虫可以传播感染易感犬,和若虫和成年人可以传输e .犬属至少155天后分离从受感染的主机2]。犬埃立克体属是第一个立克次体中描述的因果代理是狗和狗单核细胞的埃立克体病毒传染(CME),世界范围内的分布,特别是在热带和亚热带地区(3- - - - - -5]。这些细菌在家庭无形小体科进行分类,包括专性细胞内寄生虫原核,驻留在parasitophorous液泡(6]。在狗主人,e .犬属是感染性单核细胞(7]。

红孢子虫属匹敌狗感染分布于整个世界。答:匹敌犬传染性的病原体循环血小板减少,感染血小板,但受感染的狗没有临床症状(8]。答:匹敌感染是很难发现不仅“体内”因为低菌血症还血清学交叉反应与其他红孢子虫属物种(9,10]。因此,PCR试验是一种可靠的检测方法答:匹敌感染的狗(11]。

本研究的目的是确定的存在e .犬属和答:匹敌在狗和比较缅甸隔离与其他地区。在此,我们使用嵌套PCR和系统发育分析检测的分子特征e .犬属和答:匹敌感染的狗不南通鞣制,缅甸。

2。材料和方法

2.1。学习网站和样本收集

这项研究是在四个乡:进行Lewe (19.6349°N, 96.1076°E),要(19.7414°N, 96.2004°E)保护,Tatkon (20.1284°N, 96.1527°E)和扎伊纱线Thi Ri (19.62°N, 96.02°E)(图1)。2016年12月至2017年3月,血液样本收集从400年看似健康的狗。每一个乡镇,城市和农村地区的100只狗被取样。大部分的狗都是免费漫游在缅甸农村,虽然他们属于某人。采取血液样本之前,我们解释目标研究的业主,我们已经获得了狗主人的同意实验。采血(大约3毫升)进行从蝶静脉和颈静脉和放入乙二胺四乙酸(EDTA)管。所有收集的样品都被转移到实验室4°C。24小时内样本收集、DNA提取。在血液采集,狗被检查为蜱虫的存在,如果存在,蜱虫被收集在塑料容器包含一小块湿海绵进行进一步的分类识别。

2.2。从犬血中提取DNA

从血液中提取的DNA样本是由使用一个商业DNA提取试剂(DNAzol®)(美国分子研究中心,Inc .)根据制造商的指示12]。血液用于DNA提取的数量是100μ200年l。提取的dna被筛选了μl洗脱缓冲和存储在−80°C。DNA浓度估计使用NanoDrop 2000分光光度计(美国马ThermoFisher科学)。

2.3。聚合酶链反应(PCR)扩增埃立克体属和红孢子虫属仕达屋优先计划

为埃立克体属spp seminested PCR的扩增gltA使用SimpliAmp基因片段是由热循环仪(美国应用生物系统)如前所述13]。外部引物,ehrc - 131 f (CAGGATTTATGTCTACTGCTGCTTG)和ehrc - 1226 r (CCAGTATATAAYTGACGWGGACG),用于第一轮产品的放大(1096个基点),和内心的引物,ehrc - 131 f (CAGGATTTATGTCTACTGCTGCT TG)和ehrc - 879 r (TIGCKCCACCATGAGCTG),用于第二轮产品的放大(748个基点)。为红孢子虫属spp, seminested 16 s rRNA基因的PCR扩增片段进行根据Inokuma et al。14]。外部引物,fD1 (AGAGTTTGATCCTGGCTC AG)和EHR16SR (TAGCACTCATCGTTTA艾瑞泰克),用于第一轮产品(1000个基点),和内心的引物,EHR16SD (GGTACC (C / T) ACAGAAGAAGTCC)和Rp2 (ACGGCTACCTTGTTACGACTT),用于第二轮产品(1000个基点)。聚合酶链反应混合物含有约20 - 100 ng中提取DNA, 0.3μ0.025 M的底漆,U /μL的橡胶草Gflex™DNA聚合酶(豆类生物公司,东京,日本),和1×Gflex缓冲区容量的25μl两个物种,循环条件变性1分钟在94°C,紧随其后的是98°C 10年代。使用的退火温度是50°C为15秒埃立克体属种虫害和55°C红孢子虫属spp。,其次是68°C为40 90年代周期,和最后一个扩展为5分钟68°C。PCR产品都是用1.5%琼脂糖凝胶上电泳沾RedSafe(日本遗传学,Duren,德国)。

2.4。测序和系统发育分析

积极的PCR产品纯化使用NucleoSpin®和PCR清理设备(MACHEREY-NAGEL Duren,德国)根据制造商的指示。纯化PCR产物测序,ABI 3130基因分析仪(型号3130;美国应用生物系统公司,培育城市,CA)正向和反向引物。核苷酸序列与基因库条目使用NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。使用DNA序列进行系统发育分析。

积极的扩增子和多重序列比对gltA和16 s rRNA序列从基因库进行使用ClustalW Version 1.8 [15]。系统发育树推断使用neighbor-joining (NJ)分析使用大型软件7.0版本(16]。核苷酸差异的距离矩阵计算根据大型木村的两个参数模型提供。1000复制的引导重采样技术进行统计支持树上的节点的可靠性。

3所示。道德的考虑

实验进行了按照守则的机构伦理委员会。所有研究使用动物伦理委员会批准的受试者的兽医科学大学不南通鞣制,缅甸(没有批准。309 / pollit(研究生)/ 2016。

4所示。结果与讨论

分析了400只狗,3(0.75%)阳性样品e .犬属,而1样例(0.25%)呈阳性答:匹敌(表1,数据2(一个)和2 (b))。描述性的数据采样和狗蜱虫感染如表所示2。所有pcr阳性样本答:匹敌和e .犬属经测序结果。

基于在系统发育树gltA的基因,e .犬属中检测出狗T1、T8, T9分组在同一集群作为呢e .犬属菌株,以100%的支持引导价值。的答:匹敌16从狗Z4 srrna基因被发现在同一集群和其他答:匹敌菌株,以100%的支持引导价值。获得的序列是相似的e .犬属压力来自菲律宾、意大利、西班牙、法国、中国和泰国(基因库加入。JN391409、AY647155 AY615901、AF304143 KX987357 KU765198, KU765199)(图98.46 - -100%的相似之处3)。答:匹敌16 s rRNA序列的获得是相似的答:匹敌压力来自印度、泰国、意大利、克罗地亚、冲绳加入中国、西班牙、南非(基因库。KT982643、EF139459 EU439943、AF536828 KY114935, KJ659044, KX987336 AY530806, KC189853)(图99.68 - -100%的相似之处4)。系统发育分析结果证实,放大基因属于各自的物种。序列生成在目前的研究已经提交给基因库加入数字LC545959 LC545962。

在这项研究中,分子识别从400年当地狗样品表现出的患病率为0.75%e .犬属感染和0.25%答:匹敌感染。在这项研究中没有混合感染。根据本研究的发现,e .犬属被发现是更常见的犬蜱传播的病原体相比红孢子虫属spp。在这项研究中,目前的结果表明低流行率的亚临床感染的狗。在土耳其的患病率e .犬属从无症状的狗是4.9%,答:匹敌0.5%,混合感染的e .犬属和答:匹敌被发现为0.3%17]。在巴西,只有4.8%的狗被seroreactivee .犬属(18]。先前的研究已经描述的分子流行e .犬属从3.1%到88%不等19- - - - - -23]。变化可能是由于样本大小,直接影响蜱虫种群的气候条件,样品收集的时间。

一个更高的患病率e .犬属和答:匹敌也报道了一些工人。在普拉亚,奥地利,Gotsch et al。24)表明,PCR检查e .犬属在狗和26.2%答:匹敌是7.7%。在北卡罗莱纳,美国33%的27个狗答:匹敌pcr阳性(25]。在冲绳,日本,200年32%的流浪狗是积极的答:匹敌特殊技能PCR (26]。事实上,在先前的研究,积极的狗生病的动物与临床症状符合媒介传播疾病和承认接受治疗,虽然在目前的研究中,所有狗采样显然是健康的。

红孢子虫属匹敌是狗的thrombocytotrophic细菌的特点是临床异常如发烧、厌食,瘀斑的出血,和葡萄膜炎27]。的检测答:匹敌在缅甸感染狗是第一次。在这项研究中,它是降低患病率答:匹敌(0.25%)比在意大利(4%)、尼日利亚(6.6%)和委内瑞拉(16%)。在葡萄牙,答:匹敌DNA检测在临床疑似狗住在葡萄牙北部和南部[28),而整个国家seroprevalence红孢子虫属种虫害在看似健康的范围从4.5%到9.2%在临床上怀疑狗29日]。患病率较低答:匹敌在这个研究可能是由于不同的DNA提取方法,和当地品种的检查狗在这项研究似乎基因抗蜱传播的病原体。在这项研究中,老狗更有可能是积极的,可以有一个更大的蜱传播的疾病的风险。此外,年轻的狗可能是母体免疫的蜱虫感染。由于当地狗自由漫游在农村地区,他们从来没有治疗或删除蜱虫,他们自然会抗蜱传播的疾病。然而,进一步的研究是必要的感染e .犬属和答:匹敌蜱虫和主机。

在这项研究中,所有的蜱虫期间收集的样本抽样是形态学和分子诊断r . sanguineus(数据没有显示)。然而,在狗蜱虫感染的发生在研究区低(11%,44/400)30.]。收集237蜱虫从44和平均4 - 5蜱虫狗狗。四分之三的积极的狗感染蜱虫的研究领域。这些数据表明,e .犬属和答:匹敌可能共享相同的向量,r . sanguineus。在缅甸,秋儿(31日)研究的流行r . sanguineus蜱虫不南通Taw地区是夏季的0%,84.7%在雨季,15.3%在冬天的季节。Asebe et al。32]还讨论了在热带气候,在蜱虫有明显降低人口的雨季和进步在旱季几乎降至零。事实上,如上所述,黄等。33),发病率较低的原因之一e .犬属和答:匹敌也可能是由于一个非常小的数r . sanguineus蜱虫在本研究收集。此外,这可能是由于气候条件在采样周期(从12月到3月),这并不有利于发展和生存r . sanguineus。

的部分序列gltA和16 srrna这一研究获得的基因非常相似的e .犬属和答:匹敌从不同的其他国家孤立。这暗示e .犬属和答:匹敌隔离在缅甸发现没有发散从其他国家的压力。这可能是由于这样的事实:跨界流动的家畜和野生动物可能携带感染蜱虫在缅甸和邻国之间。病原体基因相似向量可能分布在这些国家。

5。结论

这项研究的结果有关的基本信息e .犬属和答:匹敌感染在缅甸。此外,进一步研究相关基因的多样性e .犬属和答:匹敌缅甸从另一个方面应该进行。

数据可用性

序列生成在目前的研究已经提交给基因库加入数字LC545959 LC545962。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者的贡献同样的研究和写作手稿。

确认

这项研究支持在寄生虫学实验室的部分,研究生院兽药、日本北海道大学。作者感谢教授Ken Katakura博士和博士副教授坂Nakao寄生虫学实验室,研究生院兽药、日本北海道大学的部分支持与合作。

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