人脐带间充质干细胞条件培养液对大鼠股骨骨折骨痂形成的影响

摘要

间充质干细胞条件培养基(MSC-CM)是从含有生长因子、细胞因子等生物物质的干细胞培养基中提取的。这些物质在身体调节的各种功能中发挥作用，包括骨形成。然而，人脐带注射骨髓间充质干细胞- cm对大鼠股骨骨折愈合的作用尚未见报道。本研究旨在观察人脐带注射剂MSC-CM对Wistar大鼠骨折愈合后愈伤组织形成的影响(鼠形）.54只Wistar大鼠在无菌条件下按手术方法致股骨骨折。术后将大鼠分为2组，每组27只。分别于术后0、1、2、3、4、5、6、7、8周注射对照组(0.1 mL/kg体重的NaCl)和MSC-CM组(0.1 mL/kg体重的MSC-CM)。分别于术后第1、7、14、21、28、35、60天采集x线照片和股骨标本。骨标本在Bouin溶液中固定。石蜡切片法，将组织块切成5块μm厚度，马洛里苯胺蓝染色。对结果进行了描述性和定量分析。结果表明，与对照组相比，MSC-CM组的软愈伤组织形成迅速，且愈伤组织变宽。大鼠股骨骨折术后给予MSC-CM注射能加速骨痂形成。

1.介绍

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell, MSC)是一种多能细胞，可分化为多种细胞，如软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、肌细胞和神经元[1]．间充质干细胞可从脂肪组织、骨髓、胎盘、脐带、嗅黏液、乳牙、留置、脑等组织中分离[2、血细胞、羊膜、静脉、沃顿氏果冻、脐带基质细胞[3.]．在应用中，MSC可分化成熟细胞并填充受损组织、分泌细胞因子等组织再生和蛋白释放的可溶性介质[4]干细胞已被用于许多研究，并在治疗退行性疾病（如心肌梗死）方面取得了良好的效果[5)、糖尿病(6，骨髓衰竭[7]，帕金森氏病[8]，以及肝硬化[9]．

在大多数干细胞应用的案例中，没有令人信服的证据反对干细胞可以在用药后重建受损组织的说法。干细胞的治疗作用来自于其分泌的因子，如生长因子、细胞因子、趋化因子和代谢物，这些因子在自分泌和旁分泌的机体功能中起生物调节作用[10]．与前面的说法一致，有一些研究发现MSC分泌的因子具有抗凋亡、血管生成、抗损伤、免疫调节和吸引化学活性的治疗作用[11并增加神经元的生长和持久性[2]．

给予参与骨愈合过程的生物物质可以加速骨折愈合时间。各种生物物质已被报道在加速骨愈合。骨形态发生蛋白的管理[12),重组TGF -β［13，14，重组人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF) [15]，以及人体甲状旁腺激素[16]对骨折愈合有良好的效果，表现为在骨愈合过程的早期加速了骨痂的生长。

本研究旨在阐明人脐带间充质干细胞条件培养液对大鼠骨折愈合过程中愈伤组织形成的影响。

2.材料和方法

２.１.伦理批准

本研究中使用的实验动物已由印度尼西亚Gadjah Mada大学伦理审查委员会批准（参考号：00056/04/LPPT/X/2016）。

2．2.动物模型

54只3月龄雄性Wistar大鼠(鼠形)，重量为200-250克。大鼠适应7 d，随机喂食。第8天进行骨折手术。对所有大鼠进行股骨成骨手术后，我们将其分为2组:对照组和MSC-CM组。对照组给予0.1 mL/kg b.w. NaCl肌注，MSC-CM组给予0.1 mL/kg b.w.肌肉注射。术后0、1、2、3、4、5、6、7、8周每周进行一次MSC-CM肌注。观察期2个月。

2．3.人脐带间充质干细胞条件培养基

通过4代传代，从融合度达到60%的人脐带中获得MSCs，并采用温胰蛋白酶模型进行培养。胰蛋白酶中和后，细胞悬液3000转离心10分钟。去除上清，用PBS冲洗细胞沉积3次。然后用浓度为10000细胞/ mL的新培养基重悬细胞沉积物。将干细胞修饰成胚状体，并将其移植到具有完整培养基的培养基上，直到胚状体之间形成融合。用无菌PBS冲洗胚体培养物，在胚体培养板中填充10 mL不含血清的完全培养基，进行MSC-CM的生成。48 h后，将MSC-CM置于−20℃保存至使用。

２.４.外科手术

在无菌条件下，按标准操作程序手术造成大鼠右股骨折。10%氯胺酮(10%氯胺酮注射液)。，PT. Otasindo Prima Satwa, Indonesia) and 2% xylazine (Xyla, PT. Tekad Mandiri Citra, Indonesia) with a dose rate of 75 and 5 mg/kg⁻¹分别为麻醉大鼠体重[17]．用骨锯进行股骨截骨。髓内笔(18G针，Terumo®)固定在骨折部位。术后氨苄西林(注射用氨苄西林钠，中国天津光辉科技有限公司)20 mg/kg b.w [18]为抗生素，肌肉注射，每日1次，连续5天。

2．5．样品处理和数据分析

术后第1、7、14、21、28、35和60天拍摄x线照片。分别于第1、7、14、21、28、35和60天采集骨样本。每组处死1只大鼠，取右股骨。然后将骨样本固定在布因的溶液中。骨标本在10%乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中脱钙3周。石蜡切片法将组织块切成5μm厚，马洛里苯胺蓝染色。对结果进行了描述性和定量分析。用Image Raster v.3测量骨痂面积。软件，并用方差分析进行统计分析 ．

3.结果

３．１．射线探伤

术后第1、7、14、21、28、35、60天观察缝隙骨折及骨痂形成情况。在x线检查中，骨痂呈灰色(更透光)，而致密骨(更不透光)。x线照片显示两组患者术后1-7天间隙骨折(图)1）.MSC-CM组于术后第14天形成骨痂，对照组于术后第28天形成骨痂。愈伤组织不断形成，在第60天，两组愈伤组织最终形成致密骨(胼胝体与致密骨颜色无差异，视为致密骨)。

３.２．组织学观察

马洛里苯胺蓝（MAB）进行染色以确定股骨组织中软骨痂和硬骨痂的面积。我们从术后第1天到第60天测量两组的骨痂面积。测量骨痂面积以确定两组的愈合速度。软骨痂由软骨组织和MAB中的浅蓝色组成染色，硬性骨痂由板层骨基质组成，在MAB染色中呈深蓝色。骨痂面积通过Image Raster v.3.软件测量。结果如表所示1．

方差分析结果显示，两组的软愈伤组织形成无显著性差异( ),但在术后35天和60天，对照组和MSC-CM组硬骨痂的形成存在显著差异( ）.

从术后第1天至第60天测量骨痂面积。在MAB染色中，含有增生性和肥大软骨细胞的软骨痂区显示为浅蓝色，含有板层骨基质的硬骨痂区显示为深蓝色(图)2）.两组均在第7天开始形成软愈伤组织。在21-28天继续形成软愈伤组织和硬愈伤组织。骨折后60 d, MSC-CM组硬骨痂面积较对照组宽。MSC-CM组以硬愈伤组织为主，对照组以软愈伤组织为主。

在本研究中，我们通过x线观察两组大鼠股骨骨折的骨痂形成情况，并通过Mallory苯胺蓝染色观察软硬骨痂形成情况。通过x线片图像、组织学图像和愈伤组织测量，发现MSC-CM组大鼠的愈伤组织生长速度比对照组大鼠快。

4.讨论

术后第7天，对照组仅在骨碎片的一侧出现了柔软的骨痂，MSC-CM组则出现了不同的结果，骨痂已经连接了骨碎片，并在骨碎片之间形成了一座桥。然而，从x线照片上看，两组在术后第14天可见骨痂生长，其中MSC-CM组的骨痂生长较对照组更广泛。Kim等人以前曾报道过取自人脐带的间充质干细胞条件培养基[19其中包括内皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞CSF (GM-CSF)、转化生长因子-β1（转化生长因子-β1） 血小板衍生生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和角质形成细胞生长因子（KGF）。血小板衍生生长因子、VEFG、bFGF、IL-6、KGF和TGF-β在骨折修复中发挥重要作用，如细胞增殖、分化和稳态[20.]．转化生长因子-β2,βPDGF和FGF刺激成纤维细胞和软骨细胞的增殖[21]．软骨细胞通过分泌细胞外基质蛋白，如胶原II [22]．因此，软骨细胞分泌的细胞外基质和胶原蛋白使愈伤组织生长得更快，最终能够在骨折的骨头之间搭建桥梁。

骨折愈合是一个复杂的过程，涉及各种细胞、生长因子和骨细胞外基质的作用[23]．在骨折愈合中，出现了继发性骨愈合(间接骨愈合)。这个过程包括炎症或血肿(24-72小时)，修复或骨痂形成(发生在骨折后1-2周)，以及重塑[24- - - - - -26]．术后第60天，x线片显示骨痂已经连接成致密骨，组织学图像显示同样的结果，软痂已经被硬痂取代。坚硬的愈伤组织含有高蛋白和矿化的细胞外基质。这种基质是由成熟的成骨细胞合成的。要形成坚硬的愈伤组织，就必须去除柔软的愈伤组织。骨折愈合的最后阶段是硬骨痂/编织骨向皮质骨的转变。骨折愈合过程中各种因素的相互作用和信号传递对骨的最佳修复是重要的。从愈伤组织的测定结果可以看出软愈伤组织向硬愈伤组织的替代过程。硬骨痂的形成表明骨折愈合的结束阶段，然后骨头会经历重塑阶段。

已经进行了各种研究来观察MSC-CM对骨再生的影响，其中包括利用脂肪细胞中的MSC-CM进行骨再生[27，人间充质干细胞MSC-CM用于牙槽骨再生[28]和来源于人胎儿组织的用于牵张成骨的MSC-CM[29]。总的来说，骨折患者服用MSC-CM可获得良好的效果，这一点可以从加速骨再生中看出。据报道，本研究中使用的MSC生长培养基提取物对皮肤烧伤的再生也有良好的效果[30.，皮肤伤口[31和1型糖尿病大鼠胰腺的β细胞[32]．

对于老年患者或骨疾病患者，给予支持骨间充质干细胞生长的生物物质将影响骨恢复的结果[33]然而，局部给予MSC-CM后受损组织的愈合机制知之甚少。目前尚不清楚MSC-CM中包含的因子是诱导受损组织中的细胞增殖和分化，还是MSC-CM中包含的因子诱导受损组织中的细胞产生再生体内组织所需的其他因子。因此，我们需要进行进一步的研究，以全面了解MSC-CM如何加速受损组织的再生，从而找到在退行性疾病病例中实施MSC-CM的有效方法。还需要详细了解本研究中使用的人脐带来源的MSC-CM中的确切含量。

5.结论

结果发现，在骨折患者中给予MSC-CM对骨愈合进程的加速无显著差异。然而，MSC-CM在术后35天和60天显著影响硬骨痂的生长。有可能是MSC-CM中所含的因子，如TGF-β， PDGF和FGF参与骨间充质细胞的增殖和分化过程，导致MSC-CM组比对照组形成坚硬的愈伤组织。

数据可用性

本研究中使用的数据可根据作者的要求提供。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项研究得到了印度尼西亚高等教育总局(DIKTI)和研究、技术和高等教育部科学研究基金(PUPT UGM)的支持。

参考文献

1. M.Secco，E.Zucconi，N.M.Vieira等，“脐带多能干细胞：脐带比血液更丰富！”干细胞第26卷第2期1，页146-150,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. D. Drago, C. Cossetti, N. Iraci等，“干细胞分泌组及其在脑修复中的作用”，Biochimie第95卷第1期12, pp. 2271-2285, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. M. L. Weiss和D. L. Troyer，《脐带中的干细胞》，干细胞的评论，第2卷，第2期2，页155-162,2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. E. Horwitz和M. Dominici，“间充质间质细胞如何发挥它们的治疗作用?”Cytotherapy，第10卷，第8期，第771-774页，2008年。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. C.斯坦姆，B.韦斯特法尔，h . d。Kleine et al，“自体骨髓干细胞移植用于心肌再生”，《柳叶刀》，第361卷，第9351号，第45-46页，2003年。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. J.C.Voltarelli，C.E.B.Couri，A.B.P.L.Stracieri等，“新诊断1型糖尿病的自体非清髓造血干细胞移植，”日本汽车制造商协会，第297卷，第2期14, pp. 1568-1576, 2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. V. F. Gonzaga, C. V. Wenceslau, G. S. Lisboa, E. O. Frare, I. Kerkis，“在骨髓衰竭和获得性再生障碍性贫血中观察到间充质干细胞的益处”，干细胞国际， vol. 2017, Article ID 8076529, 12页，2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. a . Brederlau, a . S. Correia, S. V. Elmi等，“人胚胎干细胞来源的细胞移植到帕金森病大鼠模型:体外分化对移植物存活和畸胎瘤形成的影响，”干细胞，第24卷，第2期6, pp. 1433-1440, 2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. K. Pedram, M. H. Per, N. Babak等，“自体间充质干细胞注射后肝硬化患者肝功能的改善:I-II期临床试验，”欧洲胃肠病学与肝病杂志，第21卷，第1199-12052009页。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. S. Pluchino和C. Cosseti，《在炎症性脑疾病中，干细胞如何与宿主免疫细胞对话》，胶质细胞，第6卷，第9期，第1378-14012013页。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. M.M.Carvalho、F.G.Teixeira、R.L.Reis、N.Sousa和A.J.Salgado，“脐带间充质干细胞：表型特征、分泌组和在中枢神经系统再生医学中的应用，”当前干细胞研究与治疗，第6卷，第3期，第221-228页，2011年。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. S.N.Lissenberg Thunnisen，D.J.J.de Gorter，C.F.M.Sier和I.B.Schipper，“骨形态发生蛋白在骨折愈合中的应用和功效，”国际整形外科第35期9, pp. 1271-1280, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. S. Gerhard, B. Wildemann, D. Ostapowics等，“局部生长因子(IGF-I和TGF-)的长期影响β1） 骨折愈合的治疗使用生长因子的安全性研究，“骨科研究杂志第22卷第2期3, 2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. M. Lind, B. Schumacker, K. Søballe, J. Keller, F. MelsenC。Bünger，“转型增长因子-。β增强兔胫骨骨折愈合Acta Orthopaedica Scandinavica号，第64卷。5，第553-556页，1993。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. T. Nakamura, Y. Hara, M. Tagawa等人，“重组人基本成纤维细胞生长因子通过增强实验性狗胫骨骨折的骨痂重塑加速骨折愈合，”骨与矿物研究杂志，第13卷，第2期6、1998年。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. A. Nakajima, N. Shimoji, K. Shiomi等，“间歇性低剂量人类甲状旁腺激素治疗大鼠骨折愈合的机制(1-34)”，骨与矿物研究杂志，第十七卷，第二期第11页，第2038-2047页，2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. J. W. Carpenter, T. Y. masima，和D. J. Rupiper，珍奇动物规定，桑德斯公司，美国宾夕法尼亚州费城，2001年。
18. J. W. Carpenter和C. J. Marion，珍奇动物规定， Elsevier，圣路易斯，密苏里州，美国，2013。
19. J. Kim, J. H. Lee, S. M. Yeo, H. M. Chung, J.- i。Chae说:“成熟内皮细胞不分泌的脐血干细胞分泌的干细胞募集因子可以增强伤口愈合。”体外细胞和发育生物学-动物，第50卷，第5期。2, pp. 146-154, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. F. Loi, la . Córdova, J. Pajarinen, T.-H。Lin, Z. Yao, S. B. Goodman，《炎症、骨折和骨修复》，骨头，第86卷，第119-130页，2016年。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. L. C. Gerstenfeld, D. M. Cullinane, G. L. Barnes, D. T. Graves，和T. a . Einhorn，“骨折愈合作为出生后发育过程:其调控的分子、空间和时间方面”，细胞生物化学杂志第88期5，第873-884页，2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. A.Schindeler、M.M.McDonald、P.Bokko和D.G.Little，“骨折修复过程中的骨重塑：细胞图像，”细胞与发育生物学研讨会第19卷第2期5，页459-466,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. R.Marsell和T.A.Einhorn，“骨折愈合生物学，”受伤，第42卷，第2期6, pp. 551-555, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. D. R. Marsh和G. Li，“骨折愈合的生物学:优化结果”，英国医学公告，第55卷，第4期，第856-869页，1999年。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. T. A. Einhorn和L. C. Gerstenfeld，《骨折愈合:机制和干预》，自然评论风湿病学，第11卷，第5期。1, pp. 45-54, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. N. Little, B. Rogers, M. Flannery，《骨形成，重塑和愈合》手术(牛津大学)，第29卷，第2期4, pp. 141-145, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. I.Linero和O.Chaparro，“来源于人类脂肪组织的间充质干细胞在骨再生中的旁分泌效应，”《公共科学图书馆•综合》，第9卷，第5期。9、Article ID e107001, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. W. Katagiri, M. Osugi, T. Kawai，和H. Hibi，“人类间充质干细胞分泌体再生牙槽骨的首次人体研究和临床病例报告，”头部和面部医学，第15卷，第5期。第5页，2016年。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. Xu，B.Wang，Y.Sun等，“人胎儿间充质干细胞分泌体在牵张成骨中增强骨巩固，”干细胞研究与治疗，第7卷，第5期1, p. 134, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
30. I.Padeta，W.S.Nugroho，D.L.Kusindarta，Y.H.Fibrianto和T.Budipitojo，“间充质干细胞条件培养基促进皮肤烧伤创面的恢复，”亚洲动物和兽医进展杂志，第12卷，第2期3，页132-141,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
31. D. L. Kusindarta, H. Wihadmadyatami, Y. H. Fibrianto等，“人脐间充质干细胞条件培养基促进原创面愈合再生”，动物世界，第9卷，第6期，第605-610页，2016年。视图:出版商的网站|谷歌学者
32. W.S.Nugroho，D.L.Kusindarta，H.Susetya等人，“胰腺癌的结构和功能恢复”β- 1型糖尿病诱导的间充质干细胞条件培养基中的细胞动物世界，第9卷，第5期。5, pp. 535-539, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
33. E. Jones和X. Yang，“间充质干细胞与骨再生:现状”，受伤，第42卷，第2期6, pp. 562-568, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者

版权

版权所有©2021 Marla Anggita等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。