文摘
禽致病性大肠杆菌(亚太经合组织)是禽大肠杆菌病的主要病原体,这是一个重要的系统性疾病的深刻的经济和临床后果全球家禽业。在这项研究中,975年大肠杆菌菌株分离自2169年从泄殖腔拭子样本收集鸡、农业野生动物(蚂蚁、壁虎、苍蝇和老鼠),和环境。最高的比例大肠杆菌隔离是来自鸡泄殖腔拭子为71.05%(95%可信区间(CI) 66.69 - -75.05%)其次是38.15%的比例(95% CI 35.41 - -40.97%)和38.11%(95%可信区间34.15 - -42.24%)从野生动物或环境,分别。的o抗原血清型分布大肠杆菌隔离,包括O1、O2、O18 O78,由PCR决定。最主要的是O18血清型(10.56%),其次是O2 (9.44%)、O1群(7.79%),和O78 (6.56%)。值得注意的是,血清型O18更有可能分布在研究野生动物,特别是在壁虎。多态DNA指纹,由ERIC-PCR代表大肠杆菌每个菌株血清型显示遗传异质性的检查大肠杆菌,和O18更发散63集群由66隔离。此外,几大肠杆菌菌株来源不同的样本共享DNA指纹图谱相似度高,表明存在复杂的传播大肠杆菌从鸡到野生动物和环境,反之亦然在家禽饲养环境。虽然致病型的检查大肠杆菌不确定在这项研究中,我们的研究结果提供了重要发现的流行病学和遗传特征大肠杆菌在湄公河三角洲和强调了先决条件的严格biocontainment降低患病率和亚太经合组织在家禽生产的后果。
1。介绍
大肠杆菌(大肠杆菌)是一个无处不在的生物在人类和动物的胃肠道微生物群。大部分的大肠杆菌是不致病的,扮演着重要的角色在宿主代谢,免疫学,和营养1]。然而,一些大肠杆菌菌株可以获得特定的毒性,成为致病因素大肠杆菌能够引起广泛的疾病在人类和动物(2]。关于动物健康,禽致病性大肠杆菌(亚太经合组织)是禽大肠杆菌病的主要原因;这种疾病的特点是多个colisepticemia等全身症状,airsacculitis、心包炎、肝周炎,志综合症,致命的出血性败血症,导致高发病率,死亡率,和尸体的谴责2]。因此,亚太经合组织负责临床后果严重的经济和全球家禽养殖(3]。除了严重影响家禽健康,许多最近的研究表明,亚太经合组织的一个子集可能引起的人畜共患传染病,构成真正威胁公众健康(4- - - - - -7]。
大肠杆菌可以通过区分其体细胞O血清型(组件表面的脂多糖)和H (H)抗原;因此,可变性的o抗原提供了许多血清学分型的基础方案,成为当前标准分类法的分类和流行病学大肠杆菌(8,9]。目前,181 O-serotypes大肠杆菌,编号从O1和O181认可(8- - - - - -10),几个具体O-serotypes经常亚太经合组织已经证实与严重疾病密切相关的人类和动物。值得注意的是,某些亚太经合组织属于血清型O1、O2, O18, O78被认为是最常见的致病株,占80%以上的亚太经合组织隔离(11- - - - - -13]。
几项研究已经进行调查亚太经合组织的微生物特性,包括血清型的分布,由于毒性,抗菌素耐药性,发展史在西班牙等几个主要家禽生产国14),中国(15)和韩国(16]。然而,小知识阐明关于流行病学和遗传特点,亚太经合组织在越南家禽养殖中存在快速过渡到大型和/或工业规模的家禽企业(17]。因此,这种背景下,本研究进行了(我)来确定APEC的患病率和常见的血清型分布家禽、农业野生动物,环境,(2)识别的遗传关系大肠杆菌菌株在这些样本来源。
2。材料和方法
2.1。伦理批准
所有实验协议机构批准的动物保健和使用委员会芹苴大学的越南。捕获和解剖的野生动物伦理准则后执行依照条例芹苴大学的动物实验。
2.2。抽样地点,时间,和样本收集
抽样程序执行在后院/小家禽农场Vinh省占地约1526公里长2有大约960万只鸡18),这个省是一个中央部门对家禽生产在湄公河三角洲,越南(补充图1)。从2018年到2020年,共有2169个样本包括泄殖腔拭子从健康鸡、农业野生动物包括蚂蚁,壁虎(房子壁虎,Hemidactylus frenatus壁虎,flat-tailed房子,Hemidactylus platyurus,four-clawed壁虎,Gehyra mutilata)、苍蝇(家蝇,有明显绿头苍蝇,丽蝇科),老鼠,和环境样本收集在这个研究。样品的细节补充表中描述的类型和分布1。所有拭子样品(泄殖腔粪便;谷仓地板)放入Carry-Blair(默克公司、德国)的传输媒介。野生动物被困,将分别在无菌袋通风的洞;饲料(250克)和饮用水(1000毫升)直接在羊群中收集。所有样本在冰箱冷却并立即运送到实验室在24小时内进行处理和识别。
在实验室里,壁虎被冻结在安乐死−在五分钟内20°C,而老鼠用氯仿(默克公司、德国)安乐死。在室温下都是解剖收集盲肠的内容单独和无菌。蚂蚁和苍蝇也灭活通过冻结在五分钟−20°C,和所有的尸体被悬挂在缓冲蛋白胨水的浓缩肉汤培养基(BPW,默克公司,德国)。
2.3。大肠杆菌分离和鉴定
分离和鉴定大肠杆菌按照越南国家标准进行TCVN 7924 - 2:20 08 (19),相当于标准的菌落形态和生化鉴定方法如前所述20.]。简单地说,收集样本放入浓缩肉汤和缓冲蛋白胨水介质(BPW、默克公司、德国)和孵化24小时37°C。然后,丰富暂停接种到MacConkey琼脂(MC、默克公司、德国)和孵化一夜之间在37°C。从每个积极的样本,十可疑大肠杆菌殖民地被选为亚文化在营养琼脂(NA、默克公司、德国)。孵化后24小时37°C,这些隔离单独检查生化测试如前所述[21]。
2.4。DNA提取
单一的总基因组DNA大肠杆菌应变被沸腾的提取方法。铂环量的殖民地在营养琼脂(NA、默克公司、德国)溶解1毫升无菌去离子的蒸馏水和涡10年代。悬架放在一块热在95°C 10分钟,然后在10000转离心5分钟。这个悬挂的上层清液是用作PCR模板(22]。
2.5。使用分子PCR检测血清学分型
所有的单大肠杆菌分离血清型使用传统单一PCR有四个引物对以前开发的检测和区分每一种血清型O1, O2, O18, O78 [23]。每个20μl PCR反应混合物包括1μl的基因组DNA模板和18μl 2 x的无色Go-Taq大师,包括MgCl混合2,10 x PCR缓冲,核苷酸,10个单位的Taq DNA聚合酶(WI猫# M7132, Promega,麦迪逊,美国),和0.5μl每10μ正向和反向引物。下进行PCR扩增反应条件如下:最初在94°C变性5分钟,紧随其后的是30个周期35 95°C的年代,57°C 30年代,72°C 1分钟,最后在72°C扩展10分钟,然后在4°C。结果PCR产品可视化tris-acetate-EDTA 1.5%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色在100个基点梯(英国Bioline)和紫外线透照下拍摄。
2.6。ERIC-PCR和指纹分析
代表大肠杆菌隔离每个样本对应一个殖民地的指纹使用enterobacterial重复基因间的共识——(Eric - PCR)。一组引物ERIC-1 (5′atg TAA GCT有条件现金援助GGG得到柠檬酸颈- 3′)和ERIC-2(5′亚美大陆煤层气有限公司TAA GTG行动GGG GTG AGC三大′)被用来放大了地区之间的细菌基因组定位(Eric序列24]。ERIC-PCR反应混合物的成分是如上所述。的执行ERIC-PCR thermocycler在下列条件:初始变性在94°C 5分钟后跟35周期在94°C组成的变性1分钟,退火在50°C 1分钟,在65°C扩展了8分钟,最终在65°C扩展步骤8分钟,和最终存储在4°C。ERIC-PCR的产品是1.5%琼脂糖凝胶电泳,然后用溴化乙锭染色,可视化紫外线透照。使用凝胶文档系统捕获的图像进一步分析的DNA指纹图谱。
多态DNA指纹分析使用Bionumerics软件7.0版本(应用数学、Sint-Martens-Latem、比利时)。亚太经合组织的四个集群系统树图显示每个血清型菌株产生的基于平均相似度矩阵的使用未加权的算法对集团与算术平均法(UPGMA)分析和骰子相似系数(24]。截断值≥85%相似系数应用于指定集群(25]。
2.7。执行和数据统计分析
数据收集是使用Microsoft Excel。流行比例(表示为一个百分比)大肠杆菌隔离决心,及其置信区间(CI)计算95%二项比例代表威尔逊分数间隔。统计分析、图形和可视化进行了通过计算平台R版本4.0.126ggplot2[],贡献包27],binom [28],epiR [29日]。
3所示。结果
3.1。普遍存在的大肠杆菌
总共有975大肠杆菌菌株分离自2169年从泄殖腔拭子样本收集鸡、农业野生动物(蚂蚁、壁虎、苍蝇和老鼠),和环境。的比例和CIs大肠杆菌隔离/样本呈现在图1。大肠杆菌孤立的从319年的449 (71.05% (95% CI 66.69 - -75.05%))泄殖腔拭子样本的鸡,这是明显高于的数量吗大肠杆菌要么远离野生动物446 1169 (38.15% (95% CI 35.41 -40.97%))和环境的210 551 (38.11% (95% CI 34.15 - -42.24%),分别为(图1(一))。在研究野生动物的数量大肠杆菌分离大鼠是35 52 (67.30% (95% CI 53.76 - -78.48%))这是最高比例与壁虎相比278年的620 (44.84% (95% CI 40.97 -48.77%)),苍蝇108 297 (36.36% (95% CI 31.10 -41.98%)),和蚂蚁25 200 (12.50% (95% CI 8.61 - -17.80%))、(图1 (b))。
(一)
(b)
3.2。血清型分布O1、O2、O18 O78大肠杆菌隔离
所有975大肠杆菌菌株血清型与O1、O2, O18, O78使用常规PCR(补充图2)。检查O-serotypes的分布如图2。的比例大肠杆菌属于血清型O1、O2、O18 O78分别为7.79%,9.44%,10.56%,和6.56%,分别。大量剩余的比例(65.64%)大肠杆菌是未知的血清型(图2(一个))。在鸡、O1群的分布,O2, O18, O78大肠杆菌几乎是等价的比例为11.29% (95% CI 8.26 - -15.22%), 9.72% (95% CI 6.93 - -13.46%), 7.84% (95% CI 5.36 - -11.31%),和分别为8.46% (95% CI 5.88 - -12.03%)。同样,这些四种血清型的存在相当的环境样品(O1群)的比例从2.86%到6.19% (O2)(图2 (b))。值得注意的是,O18大肠杆菌占较大比例的15.47% (95% CI 12.41 - -19.12%)的吗大肠杆菌与野生动物,大多数O18大肠杆菌被隔绝在农业壁虎(46.39%)、45 O18大肠杆菌总97 O18的隔离从壁虎大肠杆菌隔离所有收集样本(数据未显示)。
(一)
(b)
3.3。基因组DNA指纹图谱和基因的关系O1、O2, O18, O78大肠杆菌
代表大肠杆菌分离株的血清型O1(42隔离),O2(39隔离),O18(66隔离),和O78(39隔离)选择基于样本类型和时空来源ERIC-PCR识别遗传差异和关系大肠杆菌隔离。四个基因指纹识别的系统树图生成大肠杆菌分别隔离属于检查血清中描述的数据3(一个)- - - - - -3 (d)。这些结果表明,DNA指纹图谱模式大肠杆菌是异构的,表现为分配多个基因subclusters /血清型:O1 42隔离)(38集群,O2(35集群39隔离),O18 66名(64集群),和O78(35集群39隔离),所有这些subclusters被分为两个(O78)三(O1、O2和O18)主要集群。重要的是,在同一血清型,几个大肠杆菌不同样本来源的菌株分离共享遗传相似度高(≥85%)和组合成不同的subclusters,例如,O1血清型(P4-O1-C / P5-O1-G P18-O1-C / P19-O1-E和P37-O1-C / P38-O1-E);O2血清型(P9-O2-C / P10-O2-E P12-O2-C / P13-O2-E和P28-O2-G / P29-O2-C), O18血清型(P23-O18-R / P24-O18-G),和O78血清型(P17-O78-E / P18-O78-C和P35-O78-C / P36-O78-E)。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
禽致病性大肠杆菌禽大肠杆菌病的主要病原体,被认为是最重要的细菌性疾病在全球家禽行业由于其巨大的经济影响2,30.]。除了对家禽的健康和生产造成严重后果,决定了亚太经合组织菌株作为潜在的人畜共患病原菌(4- - - - - -7]。因此,全面的生物知识和流行病学特点,亚太经合组织是至关重要的减少禽大肠杆菌病的发病率在家禽生产和对人类健康的威胁。在这项研究中,我们首先进行隔离和标识大肠杆菌收集从鸡、野生动物和环境。然后,获得大肠杆菌分离血清型使用PCR针对o抗原基因的显著O1, O2, O18, O78种血清型,最后,这些遗传关系大肠杆菌从ERIC-PCR检查使用DNA指纹生成的。
总共有975大肠杆菌菌株被分离从2169个样本(隔离率44.95%)鸡、野生动物和环境。鸡肉样品的分离率最高(71.05% (95% CI 66.69 - -75.05%))与野生动物和环境样品(图1)。在野生动物中,相对较高的隔离率也从老鼠(67.31% (95% CI 53.76 -78.48%))和壁虎(44.84% (95% CI 40.97 -48.77%))。这个结果符合共同的生物合理性大肠杆菌共存共生共生体在胃肠道无害,温血动物(1]。然而,患病率高大肠杆菌从鸡、亚太经合组织的主要水库之一,在农业以来家禽饲养野生动物可能是一个问题的一个子集否则共生体大肠杆菌压力来源于动物可能致病大肠杆菌并可能影响局部或全身性感染鸟类患有免疫抑制时,压力,或伤害(2]。
一些研究已经完成阐明微生物的特点大肠杆菌在越南现有在家禽生产。大多数研究集中在调查毒性属性和/或抗生素耐药性大肠杆菌获得的菌株从禽类宿主物种和环境(31日,32];然而,这样的血清型分布的信息大肠杆菌仍然是难以捉摸的。在这项研究中,所有975大肠杆菌使用常规PCR受到菌株血清型。文献综述,亚太经合组织血清型O1、O2, O18, O78目标目前血清学分型,因为它被广泛报道大肠杆菌菌株在这些APEC致病型血清型是最常见的导致大肠杆菌病在动物和人类7,33]。总共有335大肠杆菌975 (34.35%)大肠杆菌属于血清型的菌株被定义为O1、O2, O18, O78(图2(一个))。这些血清型分布在几乎相同的比例在鸡、野生动物和环境(图2 (b))。这是符合先前的研究表明的患病率大肠杆菌范围从9.52%到36.73%在所有年龄组的鸡34]。值得注意的是,血清型O18更有可能主要与比例最高为10.56% O2(9.44%),紧随其后O1群(7.79%),和O78 (5.56%)。O18的比例就越高大肠杆菌给予更多考虑由于某些O18 APEC菌株已报告人畜共患的重要性,导致尿路感染和脑膜炎在人类35]。另一方面,45隔离,总数的97 (46.39%)O18大肠杆菌隔离从样本,都是来自壁虎。以前的一些研究也提高担忧壁虎的作用在疾病传播的物种可以是天然的水库和致病菌,如亚太经合组织和发射器沙门氏菌(16,36- - - - - -38]。也值得注意,超过一半(65.64%)的大肠杆菌隔离不分配他们的血清型。可能有重要的大肠杆菌菌株与亚太经合组织其他致病型,为进一步的研究应该包括血清型目标为了提供明确的亚太经合组织的人口特征的信息。
ERIC-PCR来确定分子指纹检查大肠杆菌由于这种技术是可再生的和成本效益,已被广泛用于评估细菌的遗传相似度不同的起源39]。系统树图生成ERIC-PCR指纹的42 O1隔离,39个O2隔离,66 O18隔离,39 O78隔离显示大肠杆菌在家禽饲养的设置高度发散。多个subclusters被分配在每一个血清型人口(O1群:38集群,O2: 35集群,O18: 64集群和O78: 35集群)。subclusters /血清型的数量在这个研究前面的调查中观察到的明显高于使用相同的方法(40- - - - - -42]。更多的异构集群模式在我们的研究中可能造成更多的隔离或各种样本的来源在我们的分析中,也可能是由于更快速的进化大肠杆菌在湄公河三角洲(31日,32]。因此,本研究重申了这一点大肠杆菌存在的家禽饲养在越南经历了大规模、快速的遗传多样化。
本研究更强调推断遗传关系和交叉污染的潜力大肠杆菌不同宿主物种和环境的基础上所产生的DNA指纹ERIC-PCR。很明显从四O1, O2, O18 O78指纹系统树图,几个大肠杆菌压力来自鸡、野生动物和环境与高分组在同一subclusters遗传相似性(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。这个结果表明可能有交叉的传播大肠杆菌家禽饲养不同来源之间设置。此前,一些研究也表明,从家禽粪便污染是主要的传播和传播的来源大肠杆菌对环境和周围的动物43,44]。事实上,从我们的经验观察,几乎所有的小/后院农场在湄公河三角洲相对贫穷的卫生习惯,和野生动物如壁虎,老鼠、苍蝇和蚂蚁一般存在于家禽养殖场。因此,交叉传播几乎是肯定的。这项研究表明,监测大肠杆菌以及亚太经合组织污染环境和耕地的野生动物可能会被认为是种间屏障换位在家禽生产的一项指标。此外,观察到的高患病率大肠杆菌属于O1、O2、O18 O78野生动物的血清型家禽养殖场也有关,因为这些物种也扮演了一个重要的角色在食源性疾病传播,但它们通常被忽视的常规监测项目(36,38]。
本研究成功地检查部分的人口结构大肠杆菌提供的四种常见亚太经合组织血清型和基因的交叉传播这些证据大肠杆菌血清型不同来源之间的家禽饲养。然而,也有一些不可避免的在本研究的局限性;例如,毒性、致病型和抗生素耐药性的特点大肠杆菌没有检查或大部分大肠杆菌不是血清型。然而,这项研究提供了重大的生物学特性和流行病学动态信息大肠杆菌更好地控制所需的禽大肠杆菌病和预防由亚太经合组织引起人畜共患疾病的威胁。
5。结论
大肠杆菌主要是与世隔绝的小/后院家禽养殖场。血清型O1、O2 O18, O78占的比例很高大肠杆菌人口和O18检查之间的主要血清型大肠杆菌。鸡、耕地的壁虎,老鼠被确定为传播的主要来源和传播大肠杆菌。多态DNA指纹分析显示,亚太经合组织从不同来源的家禽饲养展览大遗传异质性和关闭基因的关系。因此,这项研究提供了重要的信息关于流行病学和遗传的特点大肠杆菌家禽生产的必要性,强调严格biocontainment禽大肠杆菌病的预防和控制由亚太经合组织引起的。
数据可用性
所有生成的数据或分析在本研究中包括发表的这篇文章及其补充信息文件。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
林Thanh阮和阮同庆Thuan贡献同样这项工作。
确认
这项研究的部分资金由芹苴大学支持的改进项目VN14-P6和日本官方发展援助贷款。
补充材料
补充表1。总结样品类型及其分布。补充图1。地图显示的位置采样地点:长福省(黑)位于湄公河三角洲的中心(灰色)越南地图。补充图2。使用allele-specific基因的PCR产物扩增的O1群(3)、O2 (3 b), O18 (3 c)和O78 (3 d)血清型。莱恩M: 100个基点DNA梯;雷恩P:积极的控制;雷恩N:负控制(蒸馏水作为模板);巷1巷6:DNA样本大肠杆菌测试。箭头表示尺寸的放大DNA片段如下:263个基点(O1群),355个基点(O2)、459个基点(O18),和623年英国石油公司(O78)。。(补充材料)