文摘

顺铂是一个著名的化疗药物。它是最有效的抗癌药物之一,广泛用于多种肿瘤的治疗。然而,副作用在正常组织和器官,如肾毒性,肾脏上皮细胞发生凋亡,限制使用顺铂。谷氨酰胺是一种基质的合成谷胱甘肽是一种抗氧化剂,促进HSP70释放,保护细胞免受细胞凋亡引起的不同的刺激。在目前的研究中,我们调查了保护肾脏谷氨酰胺对顺铂肾毒性的影响。小鼠被分为三组等一群控制(P0),一组腹腔内注射单剂量顺铂20毫克/公斤体重在7天(P1),和一群静脉谷氨酰胺注射液100毫克/公斤体重在1 - 7和给定的腹腔内注射单剂量顺铂20毫克/公斤体重在7天(P2)。测量AIF的表达和细胞凋亡是由免疫组织化学方法。如果表达式和凋亡细胞的数量是奥尔雷德表示分数。如果表达式结果如下:P0: 3.29±0.79, P1: 5.32±0.68,和P2: 4.49±0.47。细胞凋亡结果如下:P0: 3.04±0.70, P1: 5.26±0.53,和P2: 4.44±0.41。 There is a decreased expression of AIF on intravenous glutamine administration, followed by a decrease in apoptosis in the podocyte. In conclusion, glutamine administration might represent the treatment of nephrotoxic-induced cisplatin.

1。介绍

顺铂(CAS No.15663-27-1 MF-Cl2H6N2Pt;ncf - 119875)或cisplatinum,也称为cis-diamminedichloroplatinum (II),是第一个铂药物批准于1978年全球治疗癌症。顺铂是最有效的抗癌药物之一,广泛用于几种类型的肿瘤的治疗。顺铂可以绑定嘌呤碱基的DNA,干扰DNA修复,引起DNA损伤,然后诱导细胞凋亡在肿瘤细胞1,2]。顺铂的好处的背后,都有各种副作用,其中之一就是对肾脏有害处的。机制cisplatin-induced肾毒性是复杂的,涉及到许多细胞过程包括氧化应激、细胞凋亡、炎症(3,4]。Tsuruya等人在2003年观察到肾上皮细胞缺乏TNFR1和Fas耐cisplatin-induced细胞死亡(5]。赛斯等人在2005年发现顺铂增加caspase-2 caspase-3活动(6]。武田等人在1997年证明caspase-8抑制减少cisplatin-induced体外细胞死亡(7]。

凋亡诱导因子(AIF)是一种线粒体氧化还原酶,在氧化磷酸化过程中发挥作用和氧化还原控制在正常细胞。如果最初克隆和鉴定caspase-independent线粒体凋亡细胞死亡的效应。如果通常局限于线粒体膜间隙和释放死亡刺激的反应。在细胞质中,如果能促进细胞凋亡,与CYP交互,其中CypA协助apoptogenic cytonuclear AIF的易位。相比之下,Hsp70维护如果在细胞质中,因此,可以延缓或防止核细胞凋亡的起始。在细胞核中,如果影响染色体缩合和碎片。此外,如果可以诱导线粒体释放apoptogenic-proteins包括细胞色素c和caspase-9 [8- - - - - -10]。

谷氨酰胺是一种α胺基酸,在体内最丰富的游离氨基酸。(11]。谷氨酰胺的调制HSP表达中起着重要的作用通过生物合成途径己醣胺(HBP)。HSP70 (HSP72和HSP 73)充当antiapoptosis蛋白(12,13]。谷氨酰胺(通过谷氨酸),半胱氨酸,甘氨酸合成谷胱甘肽前体氨基酸。谷胱甘肽是一种抗氧化剂,可以直接与活性氧发生反应生成氧化谷胱甘肽(GSSG) [11]。

细胞损伤由于暴露于顺铂化疗通常是在近端肾小管区域,因为学习是一个过程的重吸收和初级尿液分泌。然而,肾脏细胞损伤可能发生在肾小球脏上皮细胞(足细胞)在泌尿系统过滤网站,导致一切物质通过肾小球的过滤过程在近端小管和直接暴露于顺铂。因此,研究细胞凋亡和AIF的表达进行肾小球脏上皮细胞(足细胞)。本研究分析了nephroprotective静脉谷氨酰胺对细胞凋亡的发生率的影响的肾小球上皮细胞(足细胞)通过检查AIF的表达是细胞凋亡的启动apoptosis-independent半胱天冬酶。本研究有望肾衰竭引起的另一个解决问题的顺铂化疗方法。

2。材料和方法

2.1。动物和住房

2 - 3个月大的纯种雄性白老鼠重150 - 200克一个星期后用于适当的驯化动物屋条件(12 h照明周期和29-31°C温度)与自由水和标准啮齿动物食物。所有试验程序进行根据道德标准机构动物伦理委员会批准的动物保健和使用指南,印度尼西亚爪哇Airlangga大学。动物被随机分为三组,每组10个动物。第一组作为对照组(P0)。第二组是用顺铂治疗(20毫克/公斤I.p)作为一个积极的控制(P1)。第三组被注射谷氨酰胺(100毫克/公斤,注射。),克谷氨酰胺悬浮在10毫升溶液毫升0.9%每日连续七天,和注射顺铂(20毫克/公斤I.p)第七日诱导肾毒性(P2)。所有组收到相当于二手车的交易量。老鼠牺牲在第十天。的纵切面左肾切除了每只动物的免疫组织化学检查。

谷氨酰胺产品是购自美国赛瓦,德国,顺铂产品从Kalbe Farma,吊舱从罗氏凋亡检测设备(11684817910),和anti-AIF抗体(AIF单克隆抗体)从ThermoFisher科学(猫。# ma5 - 15880)。

2.2。免疫组织化学检查

肾组织样本在10%中性缓冲福尔马林固定,嵌入在石蜡、剪切、和染色和免疫组织化学染色AIF的表达和细胞凋亡检查使用光学显微镜。

免疫组织化学检测AIF的表达进行了使用anti-AIF抗体(如果单克隆抗体,ThermoFisher科学、猫。# ma5 - 15880)。与anti-AIF抗体免疫组织化学染色法进行了简要步骤如下:deparaffinated准备在玻璃对象,用PBS pH值7.4,阻断内源性过氧化物以3%的H₂O₂了20分钟,阻止非特定的蛋白质有5%的边后卫,孵化主要抗体(anti-AIF抗体)在一夜之间在4°C,孵化与共轭anti-mouse生物素1小时在室温下,孵化与Strep-avidin辣根过氧化物酶为40分钟,民建联和孵化10分钟。与梅耶尔苏木精复染色,准备与dH冲洗₂O和充气、安装用拭子和准备覆盖着一个玻璃盖。

免疫组织化学检测凋亡细胞凋亡是处理的检测装备,POD(11684817910,罗氏公司),用以下简单步骤:deparaffinated组织,准备为15分钟,dH蛋白酶K₂O Coplin jar 2×2分钟,消除内源性过氧化物H为3%₂O₂5分钟在室温下,下降的工作强度的负酶组织培养在37°C 1小时,将准备在Coplin jar包含的工作强度停止/洗缓冲区和孵化10分钟在室温下,下降antidigoxigenin共轭孵化在室温下在一个潮湿的容器30分钟,染色剂与基质过氧化物酶在室温下10分钟,在室温下与甲基绿对比染色30秒,并盖上玻璃罩。

2.3。统计分析

AIF的表达和细胞凋亡研究的结果与H包含IHC染色和评估使用分数显示每组的显著差异。H得分计算公式如下:TS(总分)= PS(分数比例)+(强度得分)14]。数据表示为±SEM手段。统计分析是由单向方差分析其次是LSD postanalysis测试多个比较α= 0.05,被视为具有统计学意义,皮尔森相关α= 0.05,被视为具有统计学意义。

3所示。结果

AIF的表达和细胞凋亡研究的结果与H包含IHC染色和评估使用分数显示每组显著差异(图1)。我管理谷氨酰胺。我之前v顺铂。p管理局(P2)显著降低AIF的表达给顺铂相比没有谷氨酰胺(P1)管理。AIF的表达在P2的平均分数是4.49±0.47相比,P1,得分5.32±0.68(表1- - - - - -3)。我管理谷氨酰胺。我之前v顺铂。p管理局(P2)显著降低AIF的表达给顺铂相比没有谷氨酰胺(P1)(表管理1- - - - - -5)。

AIF的表达变量方差分析测试结果(表4)显示,1组间不同的证据研究变量。LSD P0和P1之间的比较测试,如果表达式的平均评分P0 = 3.29±0.79和P1 = 5.32±0.68(表1和5)从AIF的表达有显著差异蛋白质的肾小球脏上皮细胞(足细胞)。LSD P1和P2测试结果的平均评分P1和P2 = 4.49 = 5.32±0.68±0.47(表5)如果排泄减少参与肾小球脏上皮细胞(足细胞)。

我管理谷氨酰胺。我之前v顺铂。p管理局(P2)显著减少细胞凋亡的数量而给顺铂没有谷氨酰胺(P1)(表管理1- - - - - -5)。

在细胞凋亡变量方差分析测试结果(表4)显示,1组间显著差异研究变量。与LSD双P0和P1平均凋亡之间的比较测试得分P0 = 3.04±0.70和P1 = 5.26±0.53(表1和5)有显著差异从肾小球细胞经历细胞凋亡的数量内脏上皮细胞(足细胞)。LSD的测试结果与平均分数为P1和P2 P1和P2 = 4.44 = 5.26±0.53±0.41(表5)在细胞凋亡的数量显著减少肾小球脏上皮细胞(足细胞)。

皮尔森相关测试的结果如果和细胞凋亡表达(表6和7)变量显示,相关是非常强烈的,直接成比例关系的方向。

4所示。讨论

在这项研究中,老鼠分成三个小组,如负对照组(P0),阳性对照组(P1)和治疗组(P2),每组由10男白老鼠。P1的最大意味着AIF的表达和细胞凋亡与其他组相比。

使用方差分析的研究数据进行了分析测试,如果有差异,紧随其后的是一个多重比较检验,LSD。使用方差分析测试,必须满足几个条件:样本必须来自独立的数据,组间方差必须均匀,每组中的数据必须是正态分布。同质性测试在这项研究中使用列文测试和显示意义值> 0.05,这意味着本研究中的数据是均匀的;正常测试使用Shapiro-Wilk测试和显示意义值> 0.05,这意味着本研究中的数据是正态分布(表2- - - - - -5)。

使用皮尔逊相关研究数据进行了分析。使用皮尔逊相关,必须满足以下条件:数据必须正常。正常的测试在这项研究中使用Kolmogorov-Smirnov测试和显示意义的值> 0.5,这意味着这项研究是正常的(表中的数据6和7)。

分析了细胞凋亡和AIF排泄在肾小球内脏上皮细胞(足细胞)在所有团体在这个研究。细胞凋亡和AIF的表达阳性对照组(P1)和(P2)凋亡过程由顺铂化疗作为一种物质,有肾毒性的影响(数据2和3)。Cisplatin-induced肾毒性发生的几个途径,包括外在的和内在的细胞凋亡,细胞凋亡可以触发AIF的表达,细胞监管机构、MAPK、炎症和活性氧。同时,细胞凋亡的负对照组(P0)可以引起的生理过程,所有的细胞都能感受到的。不能控制的外部变量的影响也会导致细胞凋亡在肾小球脏上皮细胞(足细胞)。

如果排泄增加阳性对照组(P1)是由于暴露于顺铂,增加自由基和DNA损伤造成的成熟p53基因诱导AIF蛋白转录和bcl - 2诱导导致线粒体功能障碍形成线粒体膜孔,以便AIF蛋白能把细胞质和细胞核(图4)。

这些结果与以前的研究一致由(15),这表示,易位AIF蛋白从线粒体可以由顺铂诱导敏感的卵巢癌细胞,引起细胞凋亡。细胞凋亡,代表还存在执行的细胞死亡形式,历来是生理和细胞程序性死亡的唯一形式。然而,最近的证据表明,程序性细胞死亡(PCD)可能发生在缺乏半胱天冬酶激活。事实上,大量的caspase-independent现在定义的模型,和一个关键蛋白质参与这种类型的纤毛运动,凋亡诱导因子(AIF),已被确认。顺铂引起线粒体PTP的变化导致线粒体的毛孔开放,允许小分子如AIF蛋白逃脱(15]。

AIF的表达的降低治疗组(P2)是由于谷氨酰胺,这是细胞内谷胱甘肽的前体,直接绑定到自由基可以防止由于顺铂政府线粒体功能障碍。此外,谷氨酰胺可以增加Hsp70的表达是一种凋亡剂,可以防止各种细胞死亡途径,其中之一是通过抑制bcl - 2 p53诱导的成熟,防止bcl - 2引起线粒体功能障碍,以便从线粒体易位AIF蛋白能阻止(图4)。

这些结果与以前的研究一致由(16),这表明HSP70 caspase-independent通路的调节细胞凋亡主要皮质神经元和SH-SY5Y细胞通过与AIF互动和防止易位细胞核(16]。

增加细胞凋亡阳性对照组(P1)由于顺铂暴露引发自由基的增加,可以激活各种细胞死亡通路。此外,顺铂诱导成熟的p53基因和凋亡(图4)。

这些结果与以前的研究一致由(17],显示,顺铂暴露诱发mitochondrial-dependent活性氧反应大大有助于细胞杀死通过增强细胞毒性效应产生的形成nDNA损伤(15),即易位的AIF蛋白可以诱导线粒体顺铂在敏感的卵巢癌细胞,引起细胞凋亡。(15,17]。

细胞凋亡的减少治疗组(P2)是由于谷氨酰胺是谷胱甘肽的前体,这是一种强大的抗氧化剂,可以绑定自由基引发的顺铂。此外,谷氨酰胺可以增加Hsp70的表达,是一种抗凋亡剂通过阻止细胞凋亡caspase-independent通路和caspase-dependent通路,这样细胞凋亡导致可预防顺铂(图4)。

这些结果符合理论所描述的(12,18- - - - - -20.)表示,谷氨酰胺是谷胱甘肽,谷胱甘肽的前体是一种强大的抗氧化剂和扮演着一个重要的角色在外源性和内源性物质的代谢。谷胱甘肽参与许多细胞反应。它直接进行清除自由基等活性氧(羟基自由基、脂质过氧化氢自由基、过氧亚硝基和过氧化氢)和间接与酶反应,可以减少细胞凋亡。此外,谷氨酰胺可以增加Hsp70的表达,是一种抗凋亡剂通过HBP通路,还可以减少细胞凋亡12,18- - - - - -20.]。

AIF的表达增加,增加了细胞凋亡阳性对照组(P1)密切相关。AIF的表达的增加顺铂引起的接触触发AIF合成和AIF易位原子核,引起冷凝和大规模染色质分散,引发细胞凋亡(图4)。

这些结果与以前的研究一致由(15),这表示,易位AIF蛋白可以诱导从线粒体顺铂在敏感的卵巢癌细胞,导致细胞凋亡15]。

减少AIF的表达和细胞凋亡的减少治疗组(P2)密切相关。减少AIF的表达在注射前谷氨酰胺顺铂政府由于nephroprotective谷氨酰胺是一种抗氧化剂前体的影响,可以直接绑定到抗氧化剂,所以,它可以抑制/防止线粒体功能障碍可导致AIF蛋白可能促使细胞质和细胞核。此外,谷氨酰胺可以增加Hsp70的表达,是一种抗凋亡剂通过防止易位AIF细胞核,成熟的p53基因bcl - 2 proapoptosis,防止AIF蛋白把细胞质和细胞核,并导致大规模的染色质凝聚和条块分割,从而防止细胞凋亡(图2)。

这些结果是按照先前的研究指出,Hsp72抑制释放AIF蛋白可以抑制细胞凋亡的线粒体,肾上皮细胞暴露于代谢抑制剂(21]。

5。结论

根据已经进行的研究,AIF的表达的改变,凋亡细胞静脉谷氨酰胺管理肾小球脏上皮细胞(足细胞)的男性白色小鼠暴露于顺铂;在这项研究中所发生的变化是减少的形式。减少AIF静脉谷氨酰胺管理是相关的表达与细胞凋亡减少肾小球内脏细胞(足细胞)。谷氨酰胺管理可以减少AIF的表达和顺铂诱导细胞凋亡。谷氨酰胺政府可能代表nephrotoxic-induced顺铂的治疗。

数据可用性

数据用于支持本研究的结果都包含在这篇文章,也可以在线。

附加分

主要样本,雄性Wistar鼠,在本研究收集单位Pemeliharaan Hewan Coba医学药理学系意大利Airlangaa。纯种老鼠的样本的数量或大小决定使用费德勒公式。Wistar鼠的数量是30。肾脏牺牲老鼠收集的样本10天考试衡量AIF的表达和细胞凋亡。被处理的数据利用统计软件SPSS 17版本。如果数据使用参数统计测试曲线是正态分布;如果数据曲线倾斜,将使用非参数统计检验。数据显示,有一个减少的表达如果静脉谷氨酰胺管理,其次是在足细胞凋亡减少。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究受到了Airlangga大学的医学院。作者要感谢病理和解剖和各方参与的这篇文章。