不同益生元和新合成制剂对4月龄犊牛真胃胃饥饿素免疫反应细胞的影响

摘要

本研究的目的是测定益生元（菊糖）和新合生元（菊糖和屎肠球菌不同剂量对食物分解时皱胃免疫反应(IR)细胞数量和冷胴体重量的影响。胃饥饿素是在胃的底部合成的。在胃肠系统中，胃饥饿素影响多种功能，包括胃酸的分泌、胃的运动和胰腺的蛋白质输出。试验选用49头荷斯坦公犊牛(23±5日龄，50±5 kg)。对照组和试验组仅以早餐源中添加的添加量进行区分。三个益生元组分别饲喂菊芋粉(菊粉含量提高50%)3个量:6 g(最低)PreG₆, 12 g（中等）妊娠₁₂，及 g（最高）PreG₂₄.添加三个合生元组0.25 益生元g屎肠球菌(2109 CFU/g)，获得新的共生物(SynG .₆, SynG₁₂, SynG₂₄)。56天后屠宰小牛，以获取皱胃样本进行ghrelin IR细胞检查，并测定胴体重量。结果表明，皱胃中的ghrelin IR细胞计数为( ）菊粉用量在6g和12g时降低，但胴体重量显著降低( ）PreG更高₁₂和PreG₂₄（）然后为CoG (CoG 42.6 kg;怀孕的₁₂51.4 公斤;及₂₄54 公斤）及( ）对于SynG₁₂和SynG₂₄(SynG₁₂52.3 kg和SynG₂₄49.6 千克）结果表明，12周龄犊牛的ghrelin IR细胞在胃底区域更为丰富。向犊牛喂食中、高剂量益生元菊糖可改善总体食物消化，从而延长饱腹感，增加冷胴体重量，而无需添加任何添加剂增加食物量。添加合生元0.25 G屎肠球菌(210⁹CFU/g(蛋白，英国))到菊粉(拉脱维亚有限公司生产的“草药”)并不改善这种益生元的结果。

1.导言

对农业和动物养殖方法的探索继续寻找在不使用抗生素的情况下提高农场动物生长、发育和生产力以及疾病预防的方法[1]。这对牛的生长很重要，当小牛从皱胃中的牛奶作为蛋白质消化的主要来源转变为前肠中的粗饲料和浓缩物的消化时。在转变为不同的营养获取模式期间，食物消化和体重增加会显着减少，整体健康状况会恶化.

添加益生元和益生菌或两者的组合，也称为合生元，已被公认为是犊牛最先进的方法之一。益生元含有低聚糖，这些低聚糖不易被酶消化，酶可通过获取能量使消化道细菌发酵，模拟其生长和活动，从而改善胃粘膜呼吸道功能、免疫系统和整体健康[2- - - - - -4］．益生菌是由消化道功能所需的活菌组成，可减少消化道中的病原体，促进体重增加，并通过对整个有机体产生整体积极作用来优化免疫系统功能[5，6].益生元作为合生元与益生菌一起使用，以增加积极作用[1，7］．人们正在寻找一种对动物生长、食物代谢和健康评级有额外优势的合生菌，而不是添加益生菌或益生元。此外，正在制造可以减少温室气体排放和增加食物吸收、消化和其他营养物质，如维生素、微量元素和蛋白质的可用性[5，6］．在营养摄取相同的动物中，随着食物消化和吸收的增加，饥饿感降低，从而降低胃饥饿素免疫反应(IR)细胞活性。

Ghrelin于1999年首次被描述为一种28个氨基酸的肠道肽和生长激素分泌受体1A内源性配体[8］．胃饥饿素是一种潜在的饥饿刺激剂，主要由胃(反刍动物皱胃)的壁细胞以及大肠和小肠的上皮细胞合成[9- - - - - -11]该肽是能量代谢、食物摄取和生长激素分泌控制的一部分，作为骨和软骨内稳态介质以及细胞增殖模型发挥重要作用[8，12- - - - - -14］．

在单胃动物中，它的产量在喂食后迅速下降，只要动物不饿，它的产量就会保持在较低水平。胃排空后，Ghrelin-IR细胞激活，刺激胃运动和盐酸分泌，刺激饥饿和寻找食物。胃ghrelin细胞分泌的细胞质ghrelin促进血浆ghrelin浓度的增加。Ghrelin是来自外周组织的饥饿信号，表明Ghrelin-IR细胞受外周细胞代谢的影响[12，15］．

由于来自前肠的食物持续流动，反刍动物的昼夜节律与单胃动物不同。有必要研究生长激素释放肽在成年牛机体中的作用。在前肠从牛奶完全转变为粗饲料和浓缩物分解之前，皱胃组织中的生长激素释放肽分泌可能会减少依赖于与单胃动物相同的规律。如果犊牛喂含益生元菊糖的耶路撒冷洋蓟粉(∼50%）及其与屎肠球菌然后通过减少皱胃中饥饿激素ghrelin IR细胞的数量来改善食物消化。

本研究旨在确定4个月大的小牛皱胃的ghrelin免疫反应细胞活性，以及益生元（菊糖）和合生元（菊糖和屎肠球菌)对皱胃IR细胞活性的影响与冷胴体重有关。

2.材料和方法

2.1.实验设计、饮食治疗和动物管理

这项研究是在LLU兽医部临床前研究所进行的。这项研究是以49头荷斯坦公犊牛为基础的，在研究开始时，这些公犊牛只有23头 ± 5. 天大，平均体重50 ± 5. kg.小牛被分为7个不同的组，每组7只动物的食物摄取量不同。所有小牛每天喂食两次，每次4只 1升牛奶，含或不含食品添加剂。所有动物都有随意获取干草和水。对照组（CoG）只喂食全脂牛奶。益生元组犊牛喂食含有菊粉浓度为50%的耶路撒冷洋蓟（由“有限公司Herbe”生产）添加剂的牛奶，因为通常，耶路撒冷洋蓟本身含有15–20%的菊粉浓度[5，6，16].益生元组犊牛在牛奶中添加以下菊芋添加剂：6 g菊芋粉（3 菊糖；表示为PreG₆); 12 g菊芋粉（6 菊糖；表示为PreG₁₂)；及 g菊芋粉（12 菊糖；表示为PreG₂₄)合生元组犊牛饲喂含耶路撒冷洋蓟粉和益生菌的牛奶：6 g菊芋粉（3 菊粉 + 0.25 G屎肠球菌(210⁹CFU / g), SynG表示₆); 12 g菊芋粉（6 菊粉 + 0.25 G屎肠球菌(210⁹CFU / g), SynG表示₁₂）;菊芋粉24克(菊粉12克+ 0.25克)屎肠球菌(210⁹CFU / g), SynG表示₂₄）.试验第2周后，犊牛在喂奶后饲喂浓缩饲料。浓缩物是现场制作的，不含任何生长促进剂或抗生素。

2.2.样品采集和称重

56天后，屠宰动物（平均12只）屠宰后，取每头小牛的组织学样本(n = 49）皱胃的两部分帕尔斯pylorica和眼底皱胃用0.9% NaCl溶液冲洗，置于100 mL 10%福尔马林中。组织培养在10%福尔马林溶液中固定至少48小时。尸体被冷却，官方记录的重量被固定在经过验证的屠宰场秤上。

2.3. 免疫组织化学分析

采用免疫组化染色法检测Ghrelin免疫反应(IR)细胞。用链霉亲和素-生物素复合物(Dako REAL™EnVision™检测系统，过氧化物酶/DAB+， Rabbit/Mouse)进行IR细胞染色。组织样本放置在涂有硅烷涂层(Histo Bond®)的显微镜载玻片上，并在37°C恒温器中干燥12小时。组织样品在木糖醇中脱链，用乙醇浓度降低柱脱水;样品置于pH 9的65°C缓冲溶液中(目标检索溶液，pH 9, Dako)。加热后，冷却样品并应用内源性过氧化物酶阻断试剂(Dako Endogenus酶阻断剂)5分钟。大鼠-小鼠多克隆抗体(凤凰制药。(Inc.H- 031-31)作为稀释1:500的一抗。为了确定免疫反应细胞和一抗反应，用DAB +复合物(Dako REAL™EnVision™检测系统)对样品进行染色。为了避免伪影和增加对比，用苏木精对组织进行染色。 There was a negative control added without primary antibodies. Immunoreactive cell quantitative compositions were evaluated in every sample in 10 fields of vision to determine the immunoreactive cell number in 1 mm²．使用徕卡DM 500B光学显微镜，使用Image Pro Plus 6.1在40倍放大倍数下检测样品。程序。共检测和评价98个样本。

2.4.统计分析

描述结果并确定两组之间是否存在统计差异，函数平均值（average）和标准偏差（STDEV），以及t-test (T.TEST)，比较两组间差异。所有的统计分析被报告为显著的测试．对所有参数进行分析，并使用Excel 2013和SPSS Statistics-22版本进行统计分析。

3.结果

在幽门部皱胃压盖部分（图1)怀孕的₂₄组犊牛无饥饿激素IR细胞。在齿轮,眼底部(图2)观察到IR细胞，箭头指向腺体组织细胞质中棕色颗粒的反应。

Ghrelin免疫反应（IR）细胞定位于皱胃肌腺细胞胞浆幽门和眼底部分。在眼底腺细胞顶端多见，但在幽门区，多见于腺细胞核及核周。Ghrelin IR细胞染色为棕色，大多数为圆形、椭圆形，在某些情况下为方形，用DAB + Ghrelin颗粒染色为棕色(图)2）.阴性对照未见阳性染色结果。

通过检测所有实验组中的ghrelin-IR细胞数量，发现它们显著不同( ）丰富的皱胃眼底的地区比幽门区域（表1）1）.


组	反应强度		冷胴体重量（kg） ± （SD）
组	幽门部	眼底皱襞	冷胴体重量（kg） ± （SD）

齿轮	5. ± 4.22	13 ± 8.01	42.6 ± 6.88
怀孕6	0 ± 0.07^一个	15 ± 5.86	44.8±0.99^c
怀孕12	0 ± 0.05^一个	6±4.50^一个	51.4 ± 2.76^一个
怀孕24	0 ± 0.04^一个	4±3.99^一个	54 ± 2.89^一个
SynG6	0 ± 0.89^一个	10 ± 3.27^b	49.7±2.41^b
SynG12	0 ± 0.11^一个	5. ± 2.93^一个	52.3±1.61^一个
SynG24	0 ± 0.03^一个	2±0.79^一个	49.6 ± 1.85^b

数据以平均值±标准差表示a-与CoG相比显著( ）;b-与CoG相比，差异显著( ）;c-与CoG相比不显著( ）.

对照组动物与所有益生元和合生元组动物相比，观察到有显著差异( ）更多红外电池皱胃部地区(见表1）;怀孕的₆研究还发现，实验组动物的细胞数量也很高，而且它们的细胞数量显著增加( ）怀孕的多₁₂和PreG₂₄.SynG₆组的ghrelin-IR细胞数量显著增加( ）高于SynG₁₂和SynG₂₄组。由此可见，饲粮中添加6 g和12 g菊粉显著降低肠促生长素IR细胞数量皱胃是幽门部地区。

分析皱胃眼底的区域（见图2)结果：可见CoG中的ghrelin和IR细胞显著增加( ）比PreG还多₁₂，PreG₂₄, SynG₆, SynG₁₂, SynG₂₄组动物。在SynG₆组，他们显著( ）超过SynG₁₂同步₂₄. 群同步₁₂ghrelin IR细胞数量显著升高( ）比PreG₂₄组(5±3.45、2±0.97)。

CoG动物的冷胴体重量最低，显著降低(p < 0.01）低于PreG_12;24和SynG₁₂，以及(p < 0.05）低于SynG_6;24CoG和PreG之间的组₆组间冷胴体重无显著差异。据报道，饲喂中剂量和高剂量菊粉的犊牛冷胴体重最高。

4.讨论

在本研究中，我们可以在12周龄犊牛皱胃中发现胃饥饿素免疫反应细胞。这支持了其他作者的发现，这些细胞可以在2周大的小牛以及5岁或更大的母牛皱胃中发现[9，10].他们的数量在两个皱胃区域之间存在显著差异，皱胃眼底和帕尔斯pylorica．本研究对照组和试验组犊牛，不考虑食品添加剂对乳量的影响，均有显著性( ）大鼠ghrelin免疫反应细胞数皱胃眼底比帕尔斯pylorica地区(见表2).其他作者的研究支持这些发现，即更多的IR细胞皱胃眼底的比幽门部区域[8，14]出生后的前5周，它们在胃中的数量显著增加。对于12周龄的小牛，它们的皱胃腺细胞已经发育到足以对饥饿感作出反应，分泌ghrelin[13］．


面粉的名字	成分（g·kg）⁻¹干物质基础）						成分（g·mg）⁻¹干物质基础）
面粉的名字	干物质，克公斤⁻¹	CP	NDF	ADF	淀粉	菊粉	游离葡萄糖	免费的果糖	蔗糖	核酸

浓缩饲料	882	142	481	34	655	- - - - - -	- - - - - -	- - - - - -	- - -	- - - - - -
菊芋	948 - 956	171	- - - - - -	- - - - - -	628–645	485–501	8	26	106	21

CP-粗蛋白；NDF-中性洗涤纤维；ADF-酸性洗涤纤维。

Ghrelin在饥饿动物的胃和其他消化道区域粘液中产生。对大鼠和人类的研究表明，胃切除术后大鼠外周血循环中Ghrelin的存在减少了80%，人类减少了65%[17，18]，表明外周血循环中存在ghrelin，胃中的ghrelin分泌细胞直接影响饥饿感。确定不同剂量的益生元（菊糖）和合生元（菊糖和0.25 G屎肠球菌(210⁹ CFU/g）关于小牛的饱腹感，我们关注皱胃中的ghrelin免疫反应细胞变化。这使我们能够理解和确定添加剂对食物分解的影响，因为空腹会发出ghrelin生成的信号，ghrelin生成的信号将进入外周血循环。ghrelin水平的升高会发出从外周神经到中枢神经的信号感觉饥饿的系统和信号。寻找食物、增加胃酸分泌和胃运动也受到刺激n、迷走神经生长激素释放肽在垂体释放生长激素中的作用是刺激对食物的寻找，如果有足够的营养物质存在，也会导致体重增加[8，19- - - - - -21］．

尽管有大量证据表明，胃饥饿素IR细胞存在于反刍动物的胃中[9- - - - - -11]，未发现关于食品中的合生元和益生元添加剂对小牛皱胃IR细胞活性的影响的研究。本研究提供了关于菊糖（益生元）及其与0.25的组合的独特发现 g of屎肠球菌(210⁹(CFU/g)(共生物)对犊牛皱胃IR细胞的摄取量、胃饥饿素颗粒分布及量。

对于喂食最低剂量益生元的犊牛，观察到相对较高剂量的IR细胞。在[20]，观察到足够剂量的益生元可减少胃饥饿素的分泌，这反过来有助于调节小牛的体重，我们的研究也观察到了这一点。中剂量和高剂量益生元组与对照组摄入相同食物的小牛的皱胃中IR细胞的胃饥饿素数量低于对照组和低剂量组-益生元剂量小牛组。这表明菊粉的含量足够（至少6 12周龄犊牛的食物摄入和分解显著增加，因此减少饥饿感益生元g屎肠球菌(210⁹ CFU/g）添加到介质和最高剂量（6和12 g）与益生元组和合生元组的结果相比，生长素、IR细胞数量和冷胴体重量的结果没有显示支持性结果。

根据ghrelin-IR细胞数量结果，可以得出结论，12周龄犊牛的ghrelin-IR细胞数量显著增加皱胃眼底的地区。在食物摄取中量(6克/日)和最高量(12克/日)的益生元(菊粉)增加了食物的分解，通过延长饱腹感和增加犊牛体重而不增加食物摄取量。Synbiotic屎肠球菌(210⁹ CFU/g）与益生元菊粉一起添加到食品中不会显著改善这些结果。

数据可用性

Dornonville de la Cour C，Björkqvist M，Sandvik AK.2001.大鼠胃中的A样细胞含有促生长素，在胃泌素控制下不起作用。Regul Pept.99 : 141–150.2.Hamasalim HJ.2016.合生元作为与动物健康和性能相关的饲料添加剂。Adv Microbiol.6 : 288–302.3.Hayashida T，Murakami K，Mogi K，Nishihara M，Nakazato M，Mondal MS，Murakami N.2001.家畜生长激素释放肽：胃中的分布及其可能的作用.家畜.动物.内分泌.21 : 17–24.4.Hayashi H，Yamaguchi M，Kozakai T.2020，瘦素和生长激素释放肽在小牛和奶牛胃肠道中的表达。兽医医学杂志，82 : 475–478.5.Özfili N，TüTüncüŞ，Cetin M，Udum D.2011b.不同喂养方案和ghrelin注射对阿瓦西公羊皱胃内血浆ghrelin浓度和ghrelin阳性细胞分布的影响。医学兽医杂志，162 : 65–71.

道德认同

拉脱维亚生命科学技术大学LL动物福利和保护伦理委员会对这项研究、动物保护和福利的伦理问题进行了审查。本研究获得许可(Nr. DZLAEP-2017/2)。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

这项研究得到了国家研究项目“拉脱维亚优质和健康食品可持续生产农业资源”(AgroBioRes)(2014-2017)的支持。

工具书类

8 . W. Samolińska, E. Kowalczuk-Vasilev, R. Grela，“饲粮中不同菊粉来源和益生菌对生长肥育猪生长性能和血液特性的影响比较”，动物营养档案，第72卷，第379-3952018页。浏览：谷歌学者
J. Castro, A. Gomez, B. A. White, H. J. Mangian, J. R. Loften, J. K. Drackley，“断奶前荷斯坦犊牛肠道菌群、短链脂肪酸谱和肠道发育的变化”。1.益生元补充的影响取决于部位和年龄，”乳品科学杂志，第99卷，第9682-97022016页。浏览：出版商网站|谷歌学者
H. J. Hamasalim， "与动物健康和性能有关的合成生物饲料添加剂"，微生物学进展， 2016年，第6卷，第288-302页。浏览：出版商网站|谷歌学者
B.Kiczorowska、W.Samolińska、A.Y.Arm、P.Kiczorowski和A.Winiarska Mieczan，“单胃动物营养中作为免疫刺激剂的天然饲料添加剂——综述，”动物科学年鉴，第17卷，第605-625页，2017年。浏览：出版商网站|谷歌学者
A.J.Heinrichs、C.M.Jones、J.A.Elizondo Salazar和S.J.Terrill，“益生元补充剂对新生乳牛健康的影响，”畜牧学，第125卷，第149-154页，2009年。浏览：出版商网站|谷歌学者
S.Jonova、A.Ilgaza、M.Zolovs和A.Balins，“菊粉和含有合生元的酵母对犊牛生产力和温室气体产生的影响，”兽医界，第13卷，第1017-1024页，2020年。浏览：出版商网站|谷歌学者
S. Jonova, a . il加萨，M. Zolovs，“菊粉和一种新型共生物(酵母)的影响酿酒酵母菌株1026和菊粉)对犊牛胃肠道发育和功能状态的影响兽医国际，第1卷，第1-9页，2021年。浏览：出版商网站|谷歌学者
M. Kojima和K. Kangawa，《饥饿激素:结构和功能》，生理学评论，第85卷，第495-5222005页。浏览：出版商网站|谷歌学者
H. Hayashi, M. Yamaguchi和T. Kozakai，“犊牛和奶牛胃肠道中瘦素和胃饥饿素的表达”，兽医学杂志，第82卷，第475-4781020页。浏览：出版商网站|谷歌学者
N. Murakami, T. Hayashida, T. Kuroiwa等，“中枢胃饥饿素在食物摄入和大鼠胃饥饿素分泌中的作用”，内分泌学杂志》，第174卷，第283-288页，2002年。浏览：出版商网站|谷歌学者
N. Özfili, S. Tütüncü，和H. Erdost，“胃饥饿素阳性细胞在绵羊皱胃中的免疫组化分布”，安卡拉退伍军人大学，第58卷，第61-64页，2011年。浏览：谷歌学者
J.Laermans，L.Vancleef，J.Tack和I.Deportere，“时钟基因Bmal1和胃促生长素分泌细胞在促生长素-山羊系统昼夜节律调节中的作用，”科学报告，第5卷，文章编号16748，2015年。浏览：出版商网站|谷歌学者
N.Özfili，ŞTüTüncü，M.Cetin和D.Udum，“不同喂养方案和ghrelin注射对阿瓦西公羊皱胃内血浆ghrelin浓度和ghrelin阳性细胞分布的影响，”退伍军人医学杂志，第162卷，第65-71页，2011年。浏览：谷歌学者
A.D.斯特拉德和S.C.伍兹，“胃肠激素和食物摄入，”胃肠病学，第128卷，第175-191页，2005。浏览：出版商网站|谷歌学者
I.Sakata和T.Sakai，“胃肠道中的Ghrelin细胞，”国际肽杂志，第20卷，第8页，2010年。浏览：出版商网站|谷歌学者
S.M.Abed、A.H.Ali、A.Noman、S.Niazi、A.F.Ammar和A.M.Bakry，“菊糖作为益生元及其在食品工业和人类健康中的应用；综述，”国际农业创新与研究杂志，第5卷，第88-97页，2016。浏览：谷歌学者
H. Ariyasu, K. Takaya, T. Tagami等，“胃是循环胃饥饿素的主要来源，喂养状态决定人类血浆胃饥饿素样免疫反应水平，”临床内分泌与代谢杂志，第86卷，第4753-4758页，2001年。浏览：出版商网站|谷歌学者
C.Dornonville de la Cour、M.Björkqvist和A.K.Sandvik，“大鼠胃中的A样细胞含有ghrelin，在胃泌素控制下不起作用。”调节肽，第99卷，141-150页，2001。浏览：出版商网站|谷歌学者
Y.Date，“Ghrelin和迷走神经”方法酶学，第154卷，第261-269页，2012。浏览：出版商网站|谷歌学者
L.Samal和N.C.Behura，“益生元：改善畜禽肠道健康的新兴营养方法，”亚洲动物和兽医进展杂志，第10卷，第724-7392015页。浏览：出版商网站|谷歌学者
T. Hayashida, K. Murakami, K. Mogi et al， " Ghrelin在家畜胃中的分布及其可能的作用，"国内动物内分泌学，第21卷，第17-24页，2001年。浏览：出版商网站|谷歌学者

兽医国际