文摘
客观的。评估的临床价值和安全的应用同种异体马口腔黏膜间充质基质细胞(OM-MSCs)伤口。动物。8健康的成年马没有前肢体皮肤病变或肌肉骨骼疾病。程序。口腔黏膜干细胞分离的捐赠者的马。马受到创建八全层皮肤的伤口,两个在远端前肢(FL)和两个两岸的胸腔(TH)。每个伤口受到的四种治疗方法:没有药物(T1)、透明质酸- (HA)凝胶含有OM-MSC (T2),包含检查参与组成分泌腺OM-MSC (T3) HA-gel,独自HA-gel (T4)。总宏观评价和激光数码摄影文档定期执行,让伤口评估包括伤口面积。在每个站点全层皮肤穿孔活检进行伤口感应(D0,正常皮肤)和完整的伤口愈合后(D62,修复肌肤)。结果。所有在D62伤口愈合没有不利影响。远端肢体创伤愈合慢比身体的伤口。检查参与组成分泌腺OM-MSC及其对TH伤口收缩有积极的影响。OM-MSC收缩具有积极的影响和上皮形成脂肪肝的伤口。伤口网站治疗前后无显著区别是指出在组织学检查。结论与临床相关性。使用马从口腔黏膜细胞收获是一种可行的技术生产OM-MSC检查参与组成分泌腺或其。这些生物的产生的凝胶组合组件与HA显示了积极的影响,当应用在伤口愈合的早期阶段。
1。介绍
伤口愈合是一个动态的过程,通过精心策划的细胞和分子相互作用事件,开始时在休息组织的完整性。然而,第二,意图在马伤口修复四肢常常对并发症的进展,包括慢性愈合的伤口和发展旺盛的肉芽组织(废气温度)1]。受损的伤口愈合主要发生在远端肢体的一部分,通常与缺乏成为慢性伤口上皮覆盖(2]。当前的知识表明,愈合的伤口或废气温度的发展有很多因素,包括减少血管生成(3,4),持续分泌生长因子导致fibroproliferative响应(5),和一个不平衡在胶原蛋白体内平衡6]。
这样的马,fibroproliferative障碍(7)负责远端肢体愈合不良,限制的运动生涯和昂贵的治疗的起源。
有越来越多的证据表明,干细胞疗法可以促进伤口愈合8- - - - - -10]。间充质基质细胞(msc)具有免疫调节,抗炎,修复和再生性能,这表明他们可能被用于各种发炎或受伤的组织。已经证明,msc可能减少有毒炎症和降低心脏后组织损伤,肾脏和肝脏疾病动物模型(11- - - - - -13),他们有一个有益的影响伤口修复在啮齿动物模型14- - - - - -18)和马(19,20.]。这些细胞可以从各种孤立的组织和调节伤口愈合通过几个旁分泌因子的释放,酶和免疫调节细胞因子(21]。除了这些属性,他们表现出的能力释放到细胞外环境中大量的囊泡含有多种因素与治疗效果很大程度上在不同的动物模型22,23]。这些脂质、核酸和蛋白质(生长因子、趋化因子、细胞因子、粘附分子和蛋白酶)由细胞分泌到细胞外空间检查参与组成分泌腺被称为。
在这项研究中,我们评估的应用马同种异体OM-MSC或检查参与组成分泌腺OM-MSC实验诱导胸和远端肢体伤口在马。我们假设在马这些治疗是安全的,对伤口愈合有积极的影响相比,哈,车辆处理和未经处理的控制。
2。材料和方法
2.1。动物
这项研究是批准和执行根据法国动物伦理委员会的指导方针(APAFIS # 5264 - 2016042716164161)。八个健康的混血成年马(四个阉马和四个母马)不同年龄段的(范围:9 - 15年),免费前肢体残废和任何疤痕或皮肤疾病,包括在这项研究中。手术当天(D0)和(D1-D16)在接下来的16天,马被安置在箱子摊位,然后在户外小牧场,直到研究结束时(D17-D90)。马被喂以每天两次带10公斤的干草和可以免费获得水。
2.2。研究设计
这个unicentric研究是一个双盲,随机试验。为期一周的适应阶段后,所有马站手术(D0)诱导四皮肤伤口在两个不同的身体(TH和FL)的网站。一个四天的治疗期(D1 D4)是紧随其后的是一个评估直到D90时期。被应用于治疗伤口在盲目的情况下,每个马被自己的控制。
2.3。隔离和OM-MSC文化
口服mucosa-derived间充质基质细胞分离得到2平方厘米的口腔黏膜组织活检获得捐赠的马。小伤口的活检被消化解决方案包含15毫升dispase II 240 ui(罗氏),300年μL临床级MTF胶原酶II(英杰公司)与两性霉素(2.5补充μg / ml),青霉素(100国际单位/毫升),和庆大霉素(50μg / ml)。样品在37°C 2 h30消化。消化后,暂停渗滤液是离心机在室温下10分钟的400克。结果细胞颗粒被在一个αMEM培养基(Gibco) 2000细胞/厘米2。这种媒介改变了48 h后的低浓度两性霉素(1μg / ml),然后改变每48 h,直到80%的融合。从第一段获得msc被用于体内实验。Trilineage分化OM-MSC验证了根据研发系统工具包(研发系统)的建议。
2.3.1。马OM-MSC流式细胞术
整除的200000细胞/ 96孔板的准备在血细胞计数缓冲区。细胞培养20分钟在4°C在黑暗中与不同的抗体流式细胞术之前洗两次与PBS的400 g 2分钟。进一步的流式细胞术分析细胞悬浮在PBS(图1)。马msc标记的抗体使用特定:CD90、CD29、CD44, CD45和MHC II。分析了用贝克曼流式细胞分析仪和数据处理。(Kaluza贝克曼软件)。
2.3.2。制备HA-Gel
细胞与胰蛋白酶收获,用PBS, resuspended HA-gel 24小时内进行管理。公顷(HTL生物技术、Mw = 240 kDa)溶解在水中(2%最终浓度)和搅拌在250 rpm, 60°C, 12小时,然后与msc混合。总共500.103细胞获得并用于HA-gel准备浓度为50.103细胞/厘米3的凝胶。
2.4。伤口创造
D0,马镇静detomidine(0.01毫克/公斤(四)和酒石酸布托啡诺(0.04毫克/公斤(四)局部麻醉。获得了近端外侧掌骨半环块前肢和一条线块胸用2%盐酸利多卡因的解决方案。外科网站剪和无菌准备。总共8 2.5×2.5厘米全层皮肤伤口:创建两个背外侧方面第三掌骨FL和两个在TH间隔4厘米面积位于30厘米背后的肘击一个平衡的马(图2)。模板用于标准化的创建伤口区域。手术后伤口没有覆盖模拟自发的创伤。
2.5。伤口治疗
一切创伤的胸腔和前四肢被提交给应用程序的四个治疗方案(T1 T4)。对于每一个身体的两个地区,胸腔或肢体,伤口是未经处理的(T1)作为控制,一个伤口处理OM-MSC嵌入HA-gel (T2)、一个伤口处理检查参与组成分泌腺OM-MSC嵌入HA-gel (T3) (StemCream®, StemT,法国),和一个伤口处理HA-gel (T4)。每个临床记录包括伤口地图不同颜色(白色、红色、绿色和蓝色)归因于每个治疗失明的临床医生负责这项研究。治疗被安装在一个温度控制冷却器直接从制造商到里昂在无菌注射器贴上马研究中心的四个颜色。通过这种方式,该模型是保证双盲试验。马被随机分为两组(G1和G2)。第一组收到所有四个治疗两次间隔48小时(D1和D3)和G2接受治疗期间四次连续四天(D1、D2、D3、D4)。
2.6。伤口敷料
D1,胸伤口都穿着一种不依从透水敷料固定粘性绷带。敷料在改变D2、D3、D4和删除D6, 48 h后治疗(D5 G1和G2 D6)。
D1治疗后应用程序,所有肢体伤口都穿着有不依从透水敷料获得符合的无菌纱布和粘性绷带在地方举行。调料改变在D2、D3、D4,每4天直到D16。马被放置在一个小户外围场,没有任何绷带。
2.7。临床评价
发现任何不适,每天个人一般临床检查框休息期间执行(16天)和围场时期(74天)。最后在D90进行临床检查。马没有收到任何其他药物在研究过程中。
2.8。伤口的无创性评估
第一次治疗前应用手术后24小时(D1), D3, D5, D7,这里,D15, D19, c15, D28,一周一次,直到D90,总值视觉评价和数码摄影是一切伤痛。
总值视觉伤口评估包括评估伤口炎症,肉芽组织,上皮形成,收缩,检测任何异常演化等感染。得分从0到4创建用于描述伤口在每个评估阶段:得分0:原来伤口大小2.5×2.5厘米得分1:增加伤口的大小与所有四个伤口边缘可见得分2:增加伤口的大小和至少一个伤口边缘覆盖肉芽组织没有外皮形成得分3:减少伤口的大小得分4:减少伤口大小用最少的上皮形成可见的边界之一
数字图像,使用激光数字伤口文档装置(美国WI 54481伤口变焦公司)的每一个伤口,得到精确的伤口面积测量。这个设备是提供四个激光束投射和轻微伤口以外的边界(图保持一致3)。的正确对齐激光束允许跟踪伤口周边(图4)。相机连接到电脑后,图像被特定的软件,让伤口周长与面积的精确计算。在每个数字文档之前,伤口边缘轻轻清洁无菌生理盐水更好地可视化伤口边缘。
2.9。伤口入侵Assessment-Histology
组织学评价,全层活检样本获得伤口创建期间(中性皮肤),两个月后(D62,修复伤口)。一个8毫米直径活检穿孔是用于获得这些样本。对于每一个伤口,一个中心和一个收集伤口边缘活检。样本固定在中性缓冲福尔马林的10%。后准备组织学检查,部分是得分0 - 4的四类:程度的上皮形成肉芽组织,炎症细胞浸润,和新生血管形成。所有分数,0被分配到部分缺乏组织学特性,和4时由于特性是很有意义的。
2.10。统计分析
用统计软件进行统计分析(R软件环境版本3.4.1“蜡烛”)。伤口分数统计分别治疗伤口的类型:FL和TH。实验的伤口评估地图是由双向方差分析与分解时间因素(9点从D0 D28)和治疗的因素有四个条件:控制(T1 T4)。没有评价因素间的相互作用在此分析验证了。估计每个治疗的影响,伤口分数分析了线性模型的调整。最后,频率表的分数由皮尔逊卡方检验。散点图和酒吧与ggplot2情节进行图形化定义(24]。对所有生物假说,拒绝零假设的统计测试是考虑一个错误α小于0.05。
3所示。结果
3.1。马OM-MSC流式细胞术
纯MSC在文化的存在证明了表型特征,成骨的chondrogenic分化,CFU-F形成。
3.2。临床评价
马都没有表现出不适或残废后伤口创造。所有伤口完全愈合的研究(D90)没有不利影响。
3.3。伤口的无创性评估
毛后第一个月内观察伤口愈合变化创造,这段时间后收集和无显著差异。后第三天伤口创造(D3),基于数码摄影的结果,大部分伤口(53/64)的整体围小而对D0的原始大小。D5与D7,大小的增加是注意到在43个伤口(43/64)。
TH,最大限度的减少伤口面积被观察到这里(30/32),c15,所有TH达到完全治愈或伤口面积小于0.4毫米2。
对于FL的伤口,逐步增加周长,面积还观察到这里,直到D19 (26/32)。D19之后,减少被观察到在所有FL的伤口,在D60记录和全部愈合。
3.3.1。伤口收缩
十一天后伤口创造(这里),没有注意到任何上皮形成边界TH伤口,但他们的总体面积小得多的马的G1治疗两次检查参与组成分泌腺与OM-MSC OM-MSC凝胶(T2)或凝胶(T3)与T1 -和T4-treated伤口。这个观察不是记录在G2连续四次四天治疗。对于TH的伤口,一个双向方差分析不能发现任何显著差异在进化,表面积之间的治疗。总值伤口评估分数评估了费舍尔双向方差分析(因素时间9点从第0天、28天与四个条件因子治疗T1、T2、T3、T4)。这个分析显示了显著增加分数随时间(图5(一个),方差分析 ),表明这些分数都是适应评估胸伤口恶化随着时间的前28天伤口愈合。治疗的一个重要影响伤口存在(图5(一个)方差分析, )。线性模型分析显示控制(T1)和HA-gel之间无显著差异(T4) ( )但确定T2统计上显著的影响( )和T3 ( )相对于T1。T2和T3分数高于控制分数(T1)前28天伤口愈合。TH伤口的水平之间的交叉频率和不同治疗方法对酒吧的情节和皮尔逊卡方测试,证实了显著影响的治疗在得分(图5 (b),X平方测试, )。T2和T3治疗应用TH伤口显示3级分数的增加相应增加伤口收缩。
(一)
(b)
3.3.2。伤口上皮形成
所有FL伤口最初规模扩大表面积减少之前,从c15开始。费舍尔双向方差分析(因素从D0 D28时间9点,和四个条件因子治疗T1 T4)评估得分FL和伤口。这一点分析显示治疗的一个重要影响FL伤口(图6(一)、方差分析 )。线性模型分析显示T1和T4之间无显著差异( ),也不之间的T1和T3 ( )。然而,T2 (OM-MSC)和T1之间的显著差异(控制)观察( )。这对FL T2影响伤口D10前更明显,相继从D15直到研究结束的。理解分数是参与这个OM-MSC效应,会生成一个频率表在酒吧的阴谋皮尔逊卡方测试证实了治疗的显著影响分数(图6 (b),X平方 )。T2 FL伤口上显示的频率的增加分数3和4。这些分数,分别与增加收缩和收缩上皮形成的伤口。
(一)
(b)
3.4。伤口入侵Assessment-Histology
与控制(T1)相比,平均组织学得分TH和FL伤口是更高的网站仅接受HA-gel治疗(T4)。网站收到T3(检查参与组成分泌腺OM-MSC)有较低的平均评分和接收的T2 (OM-MSC)意味着得分最低。平均分数高TH网站相比,FL网站和颅TH网站相比有小幅增加分数尾网站。
4所示。讨论
伤口比较网站显示,表面积减少伤口的过程花费的时间相比,FL TH。23天之后,所有TH伤口几乎实现了他们的治疗过程,而FL伤口才开始减少表面积大小。这对TH更快愈合过程相比,伤口在FL(23天与60天)在协议与以前的结果显示慢收缩的速度远比近端肢体的一部分(肩膀)25,26]。宏观创伤评分显示更高程度的伤口收缩TH网站(3分),解释了为什么疤痕通常较小的身体相比,四肢一匹马。
考虑到困难治疗马肢体伤口,使用再生疗法已经被认为是一个新的有前途的治疗方法。目前,治疗中使用msc马实践是主要致力于治疗肌肉骨骼障碍包括肌腱、韧带和关节疾病(27- - - - - -29日]。本研究评估的临床价值和安全的应用同种异体OM-MSC检查参与组成分泌腺或其伤口愈合的马。
十一天后伤口创造,明显降低描述的周长,面积仅为TH伤口处理HA-gel包含OM-MSC检查参与组成分泌腺或其。我们可以从这些观察得出有益的影响可以获得与这些再生医学治疗使用时在伤口愈合过程的早期阶段。这些结果也表明存在一个可能的药物治疗窗口应用程序。我们假设,在第一阶段的治疗,检查参与组成分泌腺OM-MSC或其的存在导致伤口愈合过程的放大。这个假说是一致的假设的文本(20.观察一个显著增加cox - 2的表达在msc在创造马伤口一周后注射。这些结果也符合先前的数据报告,启动msc的炎症信号需要有一个治疗效果(28]。
分化转移和旁分泌作用可以解释msc在伤口愈合的作用机制。这些细胞可以作为构建块通过特征发育可塑性,使从一个细胞类型分化,也称为分化转移(14]。脂肪形成的,沿着成骨分化能力chondrogenic, myocytic血统在很大程度上证明(30.,31日]。最近的报告在人类、老鼠和马也表明,成功地诱导多能干细胞可以分化成的角化细胞谱系32)和内皮细胞(33]。尽管移植的功能和分化成不同的细胞类型,主要的工具来检查参与组成分泌腺调节伤口愈合过程似乎是(23]。这paracrine-mediated效应是有可能的,因为msc显示丰富的分泌,增强的炎症信号。它包含因素能够调节活化、迁移,增殖的几个细胞参与了组织的休息后的愈合过程完整性(29日,34]。通过这些旁分泌作用,msc可以调节胶原蛋白生产、促进皮肤再生,促进血管生成,增加伤口闭合率(35,36]。在这项研究中,治疗伤口上描述的积极影响可能无法发现任何临床检查参与组成分泌腺OM-MSC及其之间的差异。在体外,检查参与组成分泌腺已经证明了提高愈合过程的激活炎症级联的刺激成纤维细胞,角质细胞,血管上皮细胞增殖(37]。据我们所知,在马,没有检查参与组成分泌腺的研究评估伤口的修复过程,和msc和旁分泌因子之间的比较研究。
组织学评分在这项研究显示组织学得分均值TH伤口接收HA-gel OM-MSC和HA-gel仅是相同的。这表明HA-gel是一个很好的候选人被检查参与组成分泌腺OM-MSCs或它的载体。组织学告诉我们皮肤的状态在一个特定的时刻。在这项研究中,它代表了愈合过程结束。这就解释了为什么我们不能突出的令人鼓舞的结果应用OM-MSC检查参与组成分泌腺或其愈合过程的开始。
尽管OM-MSC应用的有益影响伤口愈合两次在G1,这种效应治疗时没有被观察到在G2重复了四次。它表明一个潜在的治疗或累积剂量效应干扰绷带伤口愈合的早期阶段的变化(4绷带四天而不是两个的变化)。我们假定累计治疗有助于延迟愈合。进一步研究炎症蛋白表达OM-MSCs或旁分泌目标在伤口修复需要进行澄清的作用机制。
绷带肯定从所有FL D16,但是所有的伤口继续显示逐步增加表面积,直到D19之前的大小减少90%的c15的伤口。包扎可以是一个元素的损害正常伤口愈合过程。在伤口愈合实验诱导的研究中,绷带是故意用来创建伤口愈合缓慢和废气温度远端肢体的马(38]。包扎降低表面氧张力和创造缺氧,从而驱动进一步血管生成和纤维素增生并创建废气温度。在另一项研究[20.),伤口四肢unbandaged避免干扰愈合过程。
口腔黏膜间充质基质细胞和检查参与组成分泌腺OM-MSC用于这项研究被应用在一个HA-gel减少MSc的低功效的导航和迁移到目标病变系统交付期间报告(39]。组织学结果显示在D62 FL伤口处理HA-gel是最快速的愈合。这些结果显示一个潜在的积极影响伤口愈合的哈。透明质酸是一种天然高分子设计生物材料主要用于干细胞交付。它显示了多个属性包括增强血管生成、维持细胞生存,reepithelialization在小鼠模型(21,40]。收缩和上皮形成后HA-gel应用皮肤伤口之前证明(41- - - - - -43),这就是为什么这一媒介选择检查参与组成分泌腺OM-MSC及其管理。这积极的影响运输中没有观察到在另一项研究中使用纤维蛋白凝胶介质(20.]。
所有伤口愈合没有废气温度或过度疤痕形成。相比之下,一些远端肢体伤口轻微的废气温度开发,独立于治疗应用。这是一个很好的描述现象在马科动物1]。16天的连续包扎postwound创造可能是废气温度的发展的主要因素。TH绷带只是伤口上申请6天开始第一次治疗的应用程序。找到一个特定的生物标志物对于伤口愈合状态可能会帮助治疗受损等马废气温度的发展过程。几个细胞与伤口愈合相关事件和介质可以作为生物标志物如il - 1、il - 6,基质金属蛋白酶(44]。然而,目前,还没有开发的有效因素马科动物;因此,他们没有被用于这项研究。
细胞很容易来源于各种自体或同种异体组织。在马、脐带和胎盘组织起源显示一些功效在各种应用程序中,与传统的来源如骨髓msc隔绝或脂肪组织(20.,45- - - - - -47]。在这项研究中,同种异体OM-MSC检查参与组成分泌腺或其在马第一次使用。在人类医学研究口腔黏膜和齿龈(48)执行,因为口腔伤口愈合更快和更好的疤痕质量相比,皮肤伤口(49,50]。口腔伤口通常无疤,类似于胎儿的伤口愈合。在人类患者,伤口愈合和最后的疤痕质量的差异可能与MSC的差异和他们的反应能力内在(自分泌)和外在的信号,如人类唾液histatin [51,52)、表皮生长因子、转化生长因子β1,主要是参与细胞外基质的沉积53]。几项研究MSC,源自人类的口腔黏膜和齿龈,应用在人类患者和动物,显示更好的伤口愈合(54)具有免疫调节和抗炎效应(55]。相关研究在这一领域需要更好地了解正常的急性伤口修复、细胞信号的高度动态级联,和行为事件涉及多个炎症介质(56,57]。这个系统任何扰动导致畸变等过度愈合疤痕或失败。
5。结论
在马药,观察马的高度再生能力口腔黏膜显示一个健壮的干细胞群的存在,组织(48]。在这项研究中证实了这一假设,OM-MSC检查参与组成分泌腺及其显示积极影响伤口愈合。更多的工作需要直接在理解最好的治疗窗和最好的绷带协议优化这些创新的治疗方法。然而,这些研究结果已经表明,早期的治疗期间,一个包含OM-MSC HA-gel检查参与组成分泌腺或其诱发更快速收缩概要文件在伤口,OM-MSC凝胶FL伤口收缩的刺激效应和上皮形成的过程。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
信息披露
治疗提供了优雅StemT(干细胞产品)GenBiotech,昂蒂布、法国(HA)。执行这项工作的资深作者就业Groupe de矫揉造作的en然后再教育des马科动物兽医学院的体育里昂VetAgro一口。这手稿曾作为海报ecv年度科学会议按照以下链接:https://www.ecvs.org/members/downloads/2021_LA_Proceedings.pdf。
的利益冲突
波林狭谷和特菲克Kadri StemT的员工;他们生产的干细胞产品但没有参与临床研究。其他作者宣称他们没有利益冲突。