文摘

禽流感地利亚(APMVs)造成经济全球家禽产量大幅下降,因为他们的高发病率和死亡率。多酚是绿茶的主要组件,伟大的抗病毒效果。本研究旨在评估anti-APMV polyphenon-60活动。十二APMV-1株代表三种不同的致病型,两株APMV-2 APMV-3菌株之一,和一株APMV-7传播在鸡胚。确定细胞毒性效应,鸡胚胎成纤维细胞治疗与测试化合物在各浓度。评估抗病毒性质、时间、剂量依赖性,virulence-dependent实验在细胞和鸡胚模型。减少病毒滴度测定的红细胞凝集试验。病毒吸附的抑制作用鸡红细胞(RBC)表面被红细胞凝集抑制试验检查。结果表明,lentogenic和大分子APMV-1菌株,APMV-3应变和APMV-7应变明显抑制( )通过polyphenon-60 50μ克/毫升,而345细胞毒性化合物浓度的50%μ克/毫升。Polyphenon-60 NDV也表现出了对红细胞凝集抑制活动。总的来说,结果表明polyphenon-60的抗病毒剂,对APMVs宽安全利润率,和挑战的研究来评估其疗效在鸡是必要的。

1。介绍

禽流感地利亚(APMVs)已发现各种各样的鸟类物种全球变的临床结果和经济影响1]。鸡新城疫病毒(NDV),正式称为禽副粘病毒serotype-1 (APMV-1),是一个已经正式承认[21种血清型2]。NDV菌株可以根据他们的致病性分化鸡接种。高毒性(velogenic)菌株可引起急性感染,死亡率高,双边结膜炎,之前的呼吸道和神经系统的迹象,或出血性病变肠道3]。颅内致病性指数velogenic菌株(ICPI)值都大于1.5。中等毒性(大分子)菌株ICPI值从0.7到1.5会有轻微的抑郁症,降低死亡率,减少产蛋在铺设的羊群。低毒性或不致病的(lentogenic)菌株可能产生轻微呼吸道症状与死亡率很低,年轻的鸡产蛋减少低,ICPI值小于0.7的4]。

APMVs包膜有单链,nonsegmented消极意义上讲RNA基因组从14.9 - 17.4 kb和编码至少六个蛋白质:核衣壳(N)、磷(P),矩阵(M),融合(F), hemagglutinin-neuraminidase (HN)和大型聚合酶(L) (5]。NDV感染是由宿主细胞表面受体识别和绑定,这是紧随其后的是融合的联合行动的HN蛋白和F蛋白(6,7]。尽管疫苗接种程序提供重要的防止ND爆发,病毒仍然是一个潜在的威胁商业家禽业务以及后院生产商由于病毒的突变导致减少疫苗效力(8]。因此,天然药用产品被认为是一个互补的根除这种疾病在发展中国家。

多酚是绿茶的主要组件,吸引了大量的注意力在科学和消费社会的健康益处。儿茶素(C), epigallocatechin-3-gallate (EGCG),表儿茶素没食子酸盐(心电图),儿茶素(EGC)和表儿茶素(EC)的活性成分茶多酚(9]。各种生物和药理活动使用了绿茶多酚包括抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和物质活动(9- - - - - -16]。许多先前的研究报道,绿茶多酚的抗病毒活性的机制,特别是EGCG,涉及病毒附件和基因组合成的阶段9]。然而,绿茶多酚的抑制效应NDV的增长以及其他APMV血清型尚未被证实。

因此,本研究旨在评估anti-APMV绿茶多酚(polyphenon-60)活动。

2。材料和方法

2.1。细胞培养、病毒和化合物

鸡胚成纤维细胞(CEF)细胞培养在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM) (Gibco,英杰公司)补充10%胎牛血清(FCS), 100国际单位/毫升青霉素、链霉素100毫克/毫升、谷酰胺和2毫米在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司₂。表列出APMV血清型1;所有之前被报道(17),是传播10天大的鸡胚尿囊腔的制作病毒的股票。尿囊液提取,检测红细胞凝集(HA)活动,然后一直冻结在−80°C,直到使用。Polyphenon-60从绿茶中提取(σ化学,圣路易斯,密苏里州)是用于实验。1毫克/毫升的原液是准备在去离子水和被通过一个0.22消毒μm-pore-size注射器过滤器。然后解决方案是随着组织培养基的体外实验或蒸馏水的体内研究。

2.2。血凝素(HA)和血凝抑制(HI)试验

HA试验进行了测量减少病毒滴度。每一个在v形底96孔板与25分发μPBS的l。随后,25μl的上层清液感染细胞或感染胚胎液体被添加到每个盘子里的第一行。双重的连续稀释进行直到去年在第二盘。最后被用作控制很好,充满了PBS。然后,25μl 0.5%的鸡红细胞(RBC)暂停添加到每个好,和板被允许在室温下保持45分钟。负面结果显示为红点底部的中心,和一个积极的结果是形成漫射垫在井底。病毒滴度被显示为HA单位和确定病毒的逆最后稀释显示完整的凝集。

HI试验进行检查的抑制作用polyphenon-60病毒吸附到鸡红细胞表面和所述执行NDV [18]。总之,25μl (4 HAU) NDV是混合了25μ在不同浓度l (polyphenon-60尖底96孔板在室温下30分钟。这种混合与50随后孵化μl 0.5%的鸡红细胞表面在室温下了45分钟。的抑制红细胞凝集polyphenon-60潜伏期后观察。病毒没有polyphenon-60作为消极的控制,和PBS是作为积极的控制。

2.3。50%的组织培养感染剂量和50%的胚胎感染剂量

PBS是用来准备八系列稀释10倍的病毒。的TCID₅₀试验进行了使用汇合的欧共体语言教学大纲的单层膜。每个好乘96孔板接种20μl稀释。病毒感染后1小时,上层清液于100年取代μl的DMEM包含5%的边后卫。监控细胞病变效应(CPE),板培养5天在37°C。的开斋节₅₀使用名9天大的SPF鸡胚试验进行。五胚胎蛋接种0.1毫升每个稀释和孵化为四天。潜伏期后,鸡蛋都是测试HA活动的存在。的TCID₅₀和开斋节₅₀滴定计算使用Reed-Muench方法(19]。

2.4。细胞毒性试验

polyphenon-60的细胞毒性浓度(CC)是使用alamarBlue试验评估。的每个好subconfluent单层CEF细胞在乘96孔板被PBS和接受100年的三倍μl与不同浓度的无血清培养基polyphenon-60或不及时治疗控制。每个浓度进行了三次。细胞被孵化的37°C 48小时允许扩散,然后被沾10% alamarBlue (Serotec,奥克,英国)4小时37°C在黑暗中。减少alamarBlue测量波长562 nm和595 nm的标mtp - 650 fa(电晕电气、日立、日本)。减少百分比(PR)计算使用制造商的公式:[一个_LW−(_HW×R₀为测试/一个)_LW−(_HW×R₀控制好]×100)。校正系数(R₀)是用以下公式计算:R₀= AO_LW/ AO_HW。CC₅₀价值决定使用线性回归分析。

2.5。剂量和Virulence-Dependent化验

汇合的欧共体语言教学大纲的单层膜在乘48-well板在100 TCID感染菌株₅₀和孵化了1小时37°C。这些细胞被洗了三次与PBS移除nonabsorbed病毒和治疗polyphenon-60中包含所需的浓度。每个浓度进行了一式三份。CPE的诱导宿主细胞中观察到。孵化后48小时,alamarBlue试验进行如上所述。也没有病毒作为一个积极的控制指示CPE抑制100%。与病毒感染作为负控制指示抑制0%。CPE的抑制百分比计算使用以下公式:(PR值_药物治疗−公关价值_{消极的控制})/ (PR值_{积极的控制}−公关价值_{消极的控制})×100 (20.]。

2.6。体外抗病毒活性

十二APMV-1株代表三种不同的致病型,两株APMV-2 APMV-3菌株之一,和一株APMV-7传播在鸡胚。汇合的欧共体语言教学大纲的单层膜在乘96孔板接种病毒株在4公顷单位(HAU) / 25μl在37°C,孵化1 h。与PBS洗涤三次后,这些细胞被覆盖中含有不同浓度的polyphenon-60和孵化48小时。浮在表面的收获,和病毒滴度测定HA试验。

2.7。在蛋抗病毒活性

每个浓度(20μ50 g / mlμ/毫升)的polyphenon-60与同等体积的混合是NDV 100宰牲节₅₀。然后每个virus-compound混合物接种到五10天大的鸡胚。消极的胚胎孵化与病毒和PBS。积极的胚胎孵化了PBS。胚胎生存能力是每天检查。胚胎死亡记录的崩溃的迹象,可见血管的凸轮,血漏到蛋黄或尿囊液领域,传播凝固的样子,和胚胎运动的缺乏,鸡蛋是冷藏过夜。24小时,任何死亡的胚胎被丢弃。每个尿囊液是收获,NDV在尿囊液的存在被HA试验测试。胚胎的存活率是记录在接种后第五天(120小时)。

2.8。Time-of-Addition化验

一个time-of-addition试验进行调查的抗病毒效应polyphenon-60在不同阶段的病毒感染。汇合的欧共体语言教学大纲的单层膜在乘96孔板被感染100 TCID NDV B1应变₅₀。Polyphenon-60 50岁μg / ml被加入到细胞在不同时间间隔:1小时前感染(preinfection),在感染(感染),1小时、6小时、12小时后病毒感染(postinfection)。virus-compound混合物是孵化48小时37°C。polyphenon-60的抑制效应是评估使用alamarBlue化验如前所述。

2.9。统计分析

数据的平均数±标准差表示为三个独立的实验。之间的差异意味着利用学生的进行了分析t以及。被认为是统计意义值< 0.05。

3所示。结果

3.1。细胞毒性的Polyphenon-60

使用subconfluent polyphenon-60的细胞毒性进行了单层CEF细胞和使用alamarBlue试验测定。在低浓度,10μ克/毫升到100μg / ml显示细胞生存能力的比例超过90%,而浓度高于400μg / ml导致削减超过50%的细胞生存能力(图1)。CC₅₀值使用回归分析估计是345μ克/毫升。

3.2。抗病毒活性

NDV菌株与三种不同致病型包括velogenic应变(NDV / Miyadera / 51),大分子病毒(NDV /科马罗夫/ 40),和lentogenic应变(NDV / Ishii / 62) 100 TCID₅₀在不同浓度(0,polyphenon-60μ20 g / ml,μ50 g / ml,μg / ml, 100μ克/毫升和200μg / ml)。抗病毒活性的评估使用剂量和virulence-dependent化验和使用alamarBlue试验测定。CEF细胞感染的存在与否NDV polyphenon-60显示差减少病毒诱导CPE(图2(一个))。大分子和velogenic感染病毒的细胞治疗复合在50岁μg / ml少显示广泛的CPE比未经处理的细胞。lentogenic病毒感染细胞治疗与相同浓度显示细胞形态相似的控制细胞(细胞无毒性)。比例最高的被lentogenic应变为79%浓度的50μ克/毫升。20的最低浓度μg / ml,抑制率不到50%。显著抑制感染细胞中发现的比率也接受polyphenon-60 100的浓度μ克/毫升和200年μ克/毫升。然而,在相同的浓度,大分子的最大抑制率和velogenic菌株只有≈32%和20%,分别为(图2 (b))。

进一步调查polyphenon-60是否可以防止其他APMV复制,CEF细胞接种APMV 1型代表三个病变型(velogenic、大分子和lentogenic), 2, 3, 7 8公顷单位(HAU) / 50μ与不同浓度l和治疗0毫克/毫升,20毫克/毫升,50毫克/毫升,100毫克/毫升。高剂量的polyphenon-60表现出显著减少病毒HA滴度(日志₂HAU)细胞感染两lentogenic菌株(NDV /搭车人B1/48和NDV / Ishii / 62),三个大分子病毒(NDV /科马罗夫/ 40,NDV /枥木/ 95,和NDV /熊本/ 2000),和APMV-3 APMV-7菌株。同一剂量显示光减少细胞感染病毒HA滴度的velogenic佐藤(NDV / / 30和NDV /魏/ 73)和两个APMV-2菌株。然而,感染细胞的病毒HA滴度velogenic NDV菌株(NDV /新泻/ 85,NDV /东京/ 96,NDV / Ibaraki-2/99和NDV /千叶/ 2001)在未经处理的细胞(表类似1)。

3.3。在蛋抗病毒活性

扩大在发现,鸡蛋模型被用来评估polyphenon-60的抗病毒活性。结果表明,polyphenon-60延长时间和增加胚胎生存。未经处理的胚胎都感染了velogenic (NDV / Miyadera / 51)菌株在48小时内死亡。生存60和72小时后治疗百分比仅为20%。胚胎感染大分子(NDV /科马罗夫/ 40)应变不超过72和84小时治疗后生存。相比之下,所有胚胎感染lentogenic (NDV / Ishii / 62)应变和处理50μ克/毫升polyphenon-60接种后活了下来,直到第五天(120小时)(表2)。

3.4。时间依赖的抑制效应

为了确定NDV生命周期的阶段被polyphenon-60, time-of-addition试验进行。如图3,化合物的抑制率最高为80% (0 h p。抑制率减少到少于50%时polyphenon-60添加6 h p。我和12 h p。在进行预处理细胞,这种化合物的抑制率仅为17%。这些结果表明,polyphenon-60影响病毒生命周期的早期阶段。

3.5。红细胞凝集抑制Polyphenon-60

确定polyphenon-60的抑制作用在病毒吸附到鸡红细胞表面,嗨测试执行。浓度测试,polyphenon-60完全抑制NDV的HA活动/ Ishii / 62 (lentogenic)压力。术后无一例出现红细胞凝集polyphenon-60最高浓度(50μg / ml)混合NDV /科马罗夫/ 40(大分子)和NDV Miyadera / 51 (velogenic)株(图4)。这些结果表明polyphenon-60可能附着在病毒和防止virus-RBC绑定抑制红细胞凝集。

4所示。讨论

APMV感染疾病威胁继续成为一个火鸡和鸡(21]。预防AMPV传播的选项包括应用足够的生物安全措施,限制迁徙的候鸟,隔离疑似羊群,扑杀受感染的鸟类,和使用疫苗。然而,后院家禽生产系统较低的生物安全措施,缺乏疫苗抗原变异,短期的免疫反应和免疫抑制导致毒性的持久性NDV在群和环境22]。因此,开发有效的抗病毒化合物结合疫苗接种计划有积极影响APMV的预防和控制。

许多先前的研究使用epigallocatechin-3-gallate (EGCG),这是一个主要的绿茶多酚,对各种人类和动物病原病毒。在一个集中的50μM, EGCG有效抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制通过诱导一个完整的自噬过程(23]。在同一浓度,EGCG抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染90%以上在病毒生命周期的早期阶段20.]。EGCG在更高浓度(≥100μM)减少≥1000倍单纯疱疹病毒2型- 2)滴度在10到20分钟,减少相同数量的HSV 1型(1型单纯疱疹病毒)滴度在30到40分钟(24]。儿茶素(195μg / ml)能够完全抑制冠状的合成抗原(25]。10克/公斤饲料的浓度的绿茶,副产物表现出显著的抑制活性( )对H9N2禽流感病毒(AIV)在鸡26]。EGCG (50μ米)硫酸锌和银纳米粒子表现出很强的抗病毒活性( )针对H5N1 AIV,减少日志中病毒的效价的7.6倍(27]。EGCG(25的结合μM)和硫酸锌表现出强大的抗病毒活性( )小反刍动物对有害生物病毒(PPRV) (28]。王等人。29日]发现茶多酚(tpp)抑制PRRSV加载阶段的病毒附件,内化,复制和发布。然而,这些研究茶多酚对APMV抗病毒活性。

在这项研究中,茶多酚抑制活动示威,抗议NDV感染CEF细胞和鸡胚。致命的毒株,浓度和药物除了乘以影响化合物抑制的程度。当polyphenon-60处理细胞感染lentogenic应变50克/毫升的浓度在0 h,显著抑制polyphenon-60观察( )。Polyphenon-60也显著降低( )HA滴定两种lentogenic和三个大分子NDV菌株,APMV-3, APMV-7。在蛋中蛋实验,polyphenon-60 50μg / ml延长了生存期胚胎感染大分子和velogenic菌株。在同一浓度,它完全保护胚胎感染死亡的lentogenic应变。然而,polyphenon-60没有抑制作用在四个velogenic NDV菌株(NDV /新泻/ 85,NDV /东京/ 96,NDV / Ibaraki-2/99和NDV /千叶/ 2001)当杀病毒的活动没有观察到任何浓度的化合物。

尽管HA试验用于病毒性传染病的量化单位在许多研究[30.- - - - - -32),其敏感度严重限制比较实时PCR试验(33]。本研究的局限性是使用HA试验量化减少病毒滴度。然而,APMV与四个不同的血清型菌株(APMV-1, APMV-2、APMV-3 APMV-7)和三种不同致病型(velogenic、大分子和lentogenic)进行了测试;HA试验是一个更简单和低成本的分析比实时PCR试验产生的结果。HA量化测试的结果10株NDV可以用来比较的类内和组间。实时定量PCR测试的结果为单个应变是仅用于团体之间的比较。这些是HA试验使用的原因,而不是使用实时PCR试验在本研究中。

通过调节膜融合,融合(F)的蛋白质NDV可能影响病毒感染和致病性6]。polyphenon-60抗病毒活性的广泛不同的NDV三致病型。化合物表现出强烈抑制活动lentogenic病毒的复制。它表现出对中度到非常弱的抑制活性大分子和velogenic病毒的复制。这些结果表明polyphenon-60抑制virus-cell由与F0交互融合蛋白(无毒株),但不是用F蛋白(强毒株)。类似的结果在维洛细胞感染了无毒NDV (LaSota)应变和处理摘要研究[34]。轻微抑制观察当CEF细胞进行预处理(−1 h)与复合前NDV的感染。这种化合物在单层细胞的沉积可能阻止病毒吸附。NDV绑定到鸡红血球通过HN结合位点35]。红细胞凝集抑制试验的结果表明,polyphenon-60可能NDV结合,从而抑制病毒的HA活动。

几千年来,喝茶表明风险较低毒性的茶和茶多酚(36]。在这项研究中,polyphenon-60没有造成大的破坏CEF细胞在任何浓度小于350μg / ml,化合物的抗病毒有效剂量范围从50μ克/毫升到200μ克/毫升。Polyphenon-60被发现广泛的安全边际。

鸟类的蛋中蛋应用各种材料包括疫苗、药物、激素、益生菌和益生元,肽,碳水化合物,维生素,和植物提取物37]。补充传统的路线,如饲料和水中不太经济路线比蛋的生物活性物质(38]。此外,许多研究已经在蛋模型用于评价抗病毒功效的草药提取物,而不是使用鸡模型(27,39,40]。鸡胚胎是一个廉价的药物发现和高效筛选模型41)和一个well-available体内动物模型领域的科学实验和应用程序(42]。然而,差异在蛋和鸡模型的结果有时可能会发生如dsRNA蛋和体外抗病毒活性,但没有在小鸡孵化后40]。行政管理路线的差异和年龄的动物可能会导致这种差异。这项研究的结果显示,在蛋polyphenon-60的抗病毒作用和体外模型。未来与鸡的临床试验是必要的支持的有效使用polyphenon-60作为家禽的药剂之一。

5。结论

考虑新兴NDV和其他APMVs使用绿茶polyphenon-60将有助于抑制病毒感染。提出了研究结果表明polyphenon-60抑制作用在体外对APMV和蛋模型可能作为一种潜在的抗病毒因子,开发具有广阔的安全边际。在未来,挑战研究来评估其疗效在鸡将探索。

数据可用性

所有的研究数据用于支持本研究包括在手稿中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者高度承认传染病实验室、疾病控制、兽药、研究生院北海道大学提供的设施。这项工作是支持的科研补助金从日本促进社会科学(jsp) (ID。P06224)。