文摘
人工授精已被证明是一种有效的方法提高人口规模和遗传质量的配料有山羊。然而,创新是需要维持的配料有山羊精液质量存储。本研究旨在检查150 kDa蛋白质补充的影响,认为随着IGF-I复杂来源于牛精浆在脱脂milk-egg蛋黄extender配料的质量山羊精子储存在5°C。十二个射精收集从三个配料山羊被分成三组。在对照组(T0),射精和脱脂milk-egg蛋黄只扩展。治疗组(T1和T2),射精的扩展与补充的脱脂milk-egg蛋黄IGF-I复杂的蛋白质在12μg和24μ分别g / 100毫升。扩展的精液储存在5°C,和可行性,能动性,质膜的完整无缺,丙二醛浓度,精子凋亡比例连续5天每天进行评估。结果表明,T1是最有效的治疗保持配料山羊精液质量可接受人工受精超过五天的存储在5°C。然而,T0和T2组保留接受品质仅三天在5°C。可以得出的结论是,补充的12μg 150 kDa的蛋白质来自牛精浆每100毫升extender成功配料山羊精子的寿命延长5天。
1。介绍
配料有山羊是一个小反刍动物饲养的许多人在印尼的农村地区。这个牲畜商品提供了一个额外的收入来源,防止贫困和动物蛋白改善营养。然而,开发和遗传质量的人口是不令人满意。为了解决这些问题,可以获得优越的男性精液配料山羊人工授精。不幸的是,冰冻的配料有山羊精液不可行,但新鲜的精液可以稀释extender和储存在5°C增加存活时间。存活时间被定义为从最初的资格当人工受精的精子的运动性最小前提限制,基于已建立的标准(1]。
在热带室温(∼23°C),配料有山羊新鲜精子存活时间只有15小时(2]。精子代谢氧化导致乳酸的生产废料,随后导致精子的运动性迅速减少。高浓度的乳酸通过脂质过氧化损害质膜(3]。储存精液在5°C有助于维持生存运动性好几天(4),使更长的运输时间(5]。精子代谢减缓冷却温度,减少乳酸的产生和扩展了精子的寿命。然而,配料有山羊精子容易受到寒冷的温度应力。先前的研究表明,稀释新鲜山羊精液导致显著降低在进步的能动性从85%到40%的限制在四天的存储在5°C (6];与此同时,配料有山羊精液能动性限制从最初的90%达到40%仅三天(7]。冷应激在5°C冷却导致恶化的质膜,其次是Ettawa山羊精子能动性和生存能力降低(6]。
山羊精子的易感性冷温度应力是由脂质过氧化(8)高水平的不饱和脂肪酸的精子膜(9]。脂质过氧化反应结果生产活性氧(ROS)和丙二醛(MDA),导致质膜损伤,顶体精子,精子形态(10]。然而,抗氧化剂可以在绑定中发挥作用防止自由基氧化损伤(11,12]。
先前的研究表明,整个西门塔尔牛的牛精浆山羊精子postthaw改善精子质量(13,14]。精浆中包含一个150 kDa组成的三元复杂IGF,胰岛素样生长因子结合蛋白质3 (IGFBP-3)(或更少通常IGFBP-5),和一个叫acid-labile糖蛋白亚基15]。胰岛素样生长因子- 1 (IGF-I)睾丸间质和塞尔托利氏细胞分泌的精浆。据推测,IGF-I的保护功能是由于其抗氧化活动(16]。因此,本研究旨在研究150 kDa蛋白质的影响来自西门塔尔牛牛精浆(以下简称“蛋白质”)生存,生存能力,能动性,等离子体膜,细胞凋亡,丙二醛浓度的山羊精子储存在5°C。
2。材料和方法
2.1。伦理批准
研究基于动物保健和使用委员会批准Airlangga大学,泗水,印度尼西亚,没有。520 / HRECC.FODM /七/ 2019。委员会评估本研究基于动物福利原则的建议,英国动物(科学过程)法案,1986年,和相关的指导方针,欧盟指令2010/63 /欧盟动物实验。牛和山羊精液的集合是根据4.7章的协议进行的(牛的收集和处理,小反刍动物,和猪精液)的陆地动物卫生法典世界动物健康组织。
2.2。实验动物
两个精英西门塔尔牛公牛和三个男性配料山羊饲养在兽医学院的教学农场,Airlangga大学,泗水。从这些西门塔尔牛公牛精液是定期收集(年龄:5 - 6年;体重:400 - 900公斤)冷冻精液生产意大利Airlangga地区人工授精中心的。健康男性配料山羊3 - 5岁,25 - 35公斤,有很高的性欲。
2.3。精液收集
西门塔尔牛公牛和山羊配料收集每周两次使用人造阴道。新鲜的精液检查宏观上(体积,气味,pH值、一致性和颜色)和显微镜下(运动性、可行性和浓度)。精子用于研究至少有70%的能动性和生存能力1]。
2.4。牛精浆蛋白质的纯化
四个西门塔尔牛牛射精被用于这项研究。每个射精结合磷酸缓冲盐(PBS)和在1800转离心10分钟在5°C,然后是浮在表面的精液(等离子体)使用微量吸液管收集。净化精浆蛋白质、PBS和phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF)补充道,和混合物是5分钟的漩涡,在4°C用近10分钟,然后再次涡,在6000转离心10分钟。浮在表面的结合是绝对乙醇比例为1:1和允许沉淀过夜。乙醇被删除,由此产生的颗粒结合Tris-HCl在颗粒体积的1 - 2倍17]。
2.5。识别IGF-I复杂
识别IGF-I复杂用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和12.5%的分离胶,叠加凝胶3%,广泛(10 - 200 kDa)蛋白质分子量标记(Bio_Rad实验室、Ivry-sur-Seine、法国),并与考马斯亮蓝染色(17]。IGF-I复杂分数的百分比在西门塔尔牛牛精浆测定用凝胶定量表达4.1应用程序分析一维凝胶(微软™Windows™)。
免疫印迹蛋白质分子量标记(范围-200 - 4.4 kDa, Bio_Rad)是用于检测的特异性IGF-I复杂来自西门塔尔牛牛精浆。SDS - page的精浆样本稀释样品缓冲(50 mM Tris-HCl, pH值6.8,2% SDS、10%甘油、5% b-mercaptoethanol,和0.1%溴酚蓝),加热7分钟95°C,解决7.5% SDS聚丙烯酰胺凝胶(18]。被转移到一个0.2毫米的蛋白质硝化纤维膜,然后洗用0.1%磷酸缓冲saline-tween (PBST) 5分钟三次19]。膜阻塞过程在室温下使用0.2% BSA 60分钟,其次是洗涤与0.1% PBST 5分钟三次。主要的抗体溶液(igf - 1单克隆抗体,Sigma-Aldrich) 1μg / mL被加入到膜,然后一夜之间在4°C的环境。之后,膜清洗使用0.1% PBST 5分钟三次。下一步是添加一个中等抗igf1抗体溶液(山羊anti-Bovine胰岛素样生长因子I, Bio_Rad) 1: 10000年,然后在室温下孵化(1.5小时20.]。膜使用0.1% PBST 5分钟再洗3次,和化学发光底物添加到膜,孵化5分钟,然后检测igf - 1复杂蛋白质使用C-Digit LICOR [21]。
2.6。隔离igf - 1复杂的蛋白质
隔离IGF-I复杂的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶使用透析膜蛋白质的保留。sds - page的蛋白带150 kDa大小没有染色切除成小碎片。这种凝胶产物片段被两次0.125 Tris-HCl缓冲(pH值6.8)和2.0%的2-mercaptoethanol 15分钟。最后一个平衡稳定的凝胶碎片是在0.125进行Tris-HCl缓冲区(pH值6.8)1.0% (w / v) SDS。平衡凝胶片段被放置在一个透析管的最少tris-glycine缓冲区包含SDS(25毫米三、192毫米甘氨酸和0.1% SDS)。包含0.1%的电洗脱是在tris-glycine缓冲区进行SDS (pH值8.3)在50 V 12 h在4°C。电极的极性改变最后一分钟的电泳洗脱,以避免透析管上的吸收的蛋白质(22]。
2.7。测量IGF-I复杂的浓度
光谱分析是用来衡量igf - 1的浓度复杂隔离(IMV光度计)。0.02毫升样品的电泳洗脱结果是稀释在生理溶液(0.9%氯化钠)1:200和放置在一个小池。分析的结果是一个印出蛋白质的数量(17,23]。
2.8。Extender准备和冷冻储存
脱脂milk-egg蛋黄(SM-EY) extender准备在一项研究中描述的方法(24]。总之,10 g的脱脂奶粉(115338年默克公司)在100毫升蒸馏水溶解,加热到92°C - 95°C 10分钟,然后冷却到37°C。的解决方案是添加到5毫升的均质蛋黄(来自实验室鸡蛋)的总量100毫升。青霉素和链霉素的浓度1.0中加入了国际单位/毫升和0.1毫克/毫升,分别为(7]。SM-EY extender同样分为三组:对照组(T0),在没有增加;T1, 12μg 150 kDa的蛋白质/ 100毫升extender添加;T2, 24μg 150 kDa蛋白质/ 100毫升extender补充道。150 kDa蛋白质添加的剂量是根据我们之前研究[25]。六个复制准备每个治疗。配料有山羊精液稀释浓度的3亿年活精子/毫升之前添加填充剂。能整除的是储存在5°C,连续5天每天评估质量。
2.9。精液质量评估
精子生存能力,进步的能动性,质膜完整性、MDA水平,精子细胞凋亡(%)评估根据前面描述的6]。
2.10。生存能力
与eosin-nigrosin dry-smeared样本染色,在400×100精子检查放大光学显微镜下(奥林巴斯BX-53)。活精子被确定明亮透明的头;死精子被确定红色(6]。
2.11。能动性
精液样本的均质混合物和生理盐溶液覆盖在一个玻璃对象。进步的能动性在400×100精子评估放大光学显微镜下(奥林巴斯BX-53)加热表在37°C-38°C (6]。
2.12。完整的质膜
精液样本(0.1毫升)稀释1毫升低渗的解决方案和孵化在37°C为30分钟。每样100个精子质膜的光学显微镜下评估(奥林巴斯BX-53) 400×放大。低渗的解决方案是一个果糖1.352克和0.735克柠檬酸钠的混合物2 H2O在100毫升蒸馏水溶解。完整的等离子体膜被圆形的反面;受损的等离子体膜的特点是直尾巴(6]。
2.13。MDA浓度
MDA浓度测定采用硫代巴比土酸(稍后通知)方法。MDA工具包(包含稍后通知浓度为0,1,2,3,4,5,6,7,8μ)和100 g / ml,分别地μl精液样本溶解在蒸馏水至550年μl 100年之前μl 20%的三氯乙酸添加和均质30年代。接下来,250年μl 1 n HCl被添加到混合和均质,然后100年μl 1%的钠添加和均质在500 rpm离心法之前10分钟。上层清液是在100°C水浴孵化了30分钟,然后允许在室温下冷却。吸收使用分光光度计测量在533海里。MDA浓度(ng / mL)被推断样品吸光度值计算MDA标准曲线(6]。
2.14。细胞凋亡
Dry-smeared精液样本固定使用无水甲醇和冰川酸15分钟,然后用吖啶橙染色检查精子凋亡的比例。对于每一个样本,100精子在荧光显微镜下检查100×放大。精子凋亡的特点是一个黄色的红色的外表;正常的精子出现绿色(6]。
2.15。数据分析
方差分析是用来探测的影响治疗运动性的百分比,生存能力,完整的质膜(IPM),细胞凋亡,和MDA浓度,其次是图基的诚实的显著差异测试 统计产品和服务解决方案,在SPSS(23)版本。
3所示。结果
六个蛋白质乐队的西门塔尔牛牛精浆(图中被发现1;表1)。150.29±0.83 kDa假定IGF-I复杂验证了使用igf - 1单克隆抗体在免疫印迹(图2)。IGF-I复杂(以下简称“蛋白质”)获得4.58±0.16%的总蛋白的西门塔尔牛牛精浆为1.18±0.04μ克/毫升浓度(表1),65.12μg总蛋白质的。
西门塔尔牛牛的宏观特征和配料山羊射精共享相似之处。射精都厚一致性,黄白色的颜色,不同的味道,pH值在7。然而,一些不同的两个物种之间的显微特征观察。实质性的差异量和精子浓度记录,可行性,运动性和IPM百分比相似(表2)。
3.1。蛋白剂量的影响
24小时后,精子活力急剧下降,进步的能动性,和IPM在新鲜的精液样本SM-EY extender (T0)在5°C,这减少了40.50±0.36%,37.50±0.83%,分别和35.70±0.21%。的12μg 150 kDa蛋白质/ 100毫升SM-EY extender (T1)减毒精子活力下降,进步的能动性,和IPM在5°C, 24小时后下降了11.85±0.71%,9.95±0.28%,分别为6.85±0.36%(表3)。
的12μg蛋白显著增加( )精子质量与控制(T0 T1);然而,在高剂量(24μg)的蛋白质(T1到T2)导致显著降低精子质量( )。精液在T1治疗可行性最高,能动性,IPM水平和MDA水平最低。
3.2。存储长度的影响
总的来说,从第一天(D1)第五天(D5)储存在5°C,精子的生存在可行性方面,进步的能动性,IPM比例持续下降,MDA浓度和精子细胞凋亡比例增加。精液的质量显著降低( )这是时间越长(行存储在表中4)。
6000万每剂活动精子宫颈内的使用人工智能产生满意的怀孕率在配料山羊(14]。基于表中提供的数据1和2,它可以确定每射精,精子平均总剂量和体积(mL)成功进行宫颈内AI(表5)。精子的数量每天进步的能动性的存储可以用以下公式计算:精液体积(mL)×精子浓度(万/毫升)×百分比每天进步精子的运动性的存储(表4)。通过计算得到的平均剂量的精子数量每天进步的能动性的存储除以60(精子百万)。同时,宫颈内受精所需的体积(mL)决定延长精液的体积(mL)除以数量的剂量每射精。
4所示。讨论
新鲜Simental公牛精液收集,生育是证实基于精子活力和运动性(≥70%)和浓度(≥6亿/毫升精液中的精子)1]。牛精浆中含有一些有机化合物,包括IGF-I在内的分子量为7649道尔顿(26]。IGF-I,一个有效的促有丝分裂的和代谢物质,是一种重要的生殖功能的监管机构27]。IGF-I在精浆主要是由睾丸和附睾的器官28]。然而,大多数当地组织中IGF不存在自由分子(29日),但形成三元复杂,由IGF-I、IGFBP-3, acid-labile亚基分子量150 kDa [30.]。三元复杂的分子质量较高的半衰期延长IGF-I从不到5分钟16 h (15]。
生理上,精子必须保持低ROS水平保持正常的功能(31日hyperactivation],比如成熟,顶体反应,sperm-oocyte融合(32]。在分子水平上,ROS在酪氨酸磷酸化发挥决定性作用,氧化固醇,和胆固醇流出精子精子获能和受精过程(33]。在精浆中,活性氧平衡是由线粒体介导的代谢和内源性抗氧化剂34]。ROS增加生产扰乱oxidant-antioxidant平衡,最终导致氧化应激和损伤精子(35]。因此,可以添加外源性抗氧化平衡系统在精液储存在5°C。
配料有山羊的平均进步的能动性射精(表89±2.80%2),高于75.2%的以前的报告(2),低于94.8%的报道Setiawan et al。36]。射精是胜任AI百分比(70%以上)的基础上进步精子的运动性。
在这项研究中,配料有山羊精液生存延长使用SM-EY extender (14]。脱脂牛奶含有巯基,β乳球蛋白、phosphocaseinate和酪蛋白胶束,防止等离子体膜脂质过氧化作用[37]。蛋黄富含胆固醇(38),使存储精液通过减少线粒体的质量恶化和抑制活性氧的生产39]。
4.1。影响蛋白质的补充
没有补充蛋白质,精子活力,迅速进步的能动性,IPM百分比下降后的第一个24小时收集(T0、表4)。观察到的精子质量可以归因于恶化导致的氧化应激过度线粒体ROS生成的氧化还原反应产生三磷酸腺苷(ATP)。质膜内多不饱和脂肪酸容易接受ROS的未配对电子(31日),导致脂质过氧化反应和随后的MDA生产。因此,MDA浓度反映了质膜的氧化损伤程度(10]。高活性氧水平不能抵消内源性抗氧化剂(谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶),导致降低了膜的完整性,膜透性增加,精子的生存能力和活性的降低(34),最后精子细胞凋亡(40]。IGF-I增强内皮细胞抗氧化活性,主要通过谷胱甘肽的upregulation peroxidase-1 (GPX1)表达和活动(41]。补充的SM-EY extender IGF-I复杂蛋白质导致更高的生存能力,能动性,IPM和降低MDA浓度和精子凋亡相比那些没有蛋白质补充。然而,在高剂量的蛋白质(24μg)是有效地维持精子质量小于12μ克剂量(列在表4)。这可能是因为更高的抗氧化剂接触导致了一个悖论的抗氧化剂降低男性生育能力(42,43]。
相比精液与SM-EY extender (T0),补充的12μg蛋白/ 100毫升SM-EY extender (T1)减少了减少精子的生存和进步的能动性24 h后储存在5°C约¼,而减少在IPM是只有1/6的精子没有补充蛋白质(表3)。IGF-I蛋白质复杂有望作为一种抗氧化剂SM-EY extender。补充抗氧化剂可以防止细胞损伤或死亡(44),影响酪氨酸磷酸化和胆固醇流出来改善精子的运动性(45]。受精的卵子,精子需要线粒体产生的能量来驱动鞭毛(精子的运动性机制)。两个中心单线态的振动微管被九外偶极微管是由Ca2 +和环磷酸腺苷(营)产生鞭毛运动(34]。
补充的IGF-I已经证明保护精子冷冻保存过程中,但不影响结果从直接的抗氧化活性46]。IGF-I复杂与精子质膜上的受体结合(47),被认为行为间接地通过增加Ca是一种抗氧化剂2 +在细胞,减少营地,随后减少ATP生产(30.]。ATP生产产生活性氧,破坏精子质膜通过脂质过氧化(10]。膜结构损伤破坏膜功能,导致异常增加Ca的涌入2 +进入细胞。Ca的增加2 +精子浓度在细胞内将激活酶,产生过多的脂肪酸和阴离子超氧化物自由基。高钙也会增加膜透性和激活核酸内切酶,这将摧毁转谷氨酰胺酶共价结合膜蛋白通过isopeptides的形成48]。之间有一个积极的协会循环IGF-I、IGFBP3,血清钙(49]。
4.2。存储长度的影响
在对照组,精子只存储在SM-EY extender,为生命提供能量和能动性。ROS生成ATP能源生产的副产品(31日];ROS的渐进积累增加存储时间减少精子膜完整性、可行性和能动性32]。精子存活率下降超过5天的存储在5°C。生存、进步的能动性和IPM下降,MDA浓度和细胞凋亡增加。存活时间被定义为持续时间从最初的精液收集到所需的最低质量AI。精子的生存能力随贮存时间增加由于活性氧积累50,51]。存储温度也会影响精子的生存能力。山羊精子存活时间是五天在室温和只有17 h在5°C (52]。然而,羊精子储存在4°C存活超过23°C (9]。存储的精液SM-EY extender在低温下是为了延长精子的寿命。然而,储存时间的程度直接影响ROS水平。ROS的条件下生产过剩和冷冻储存,精浆抗氧化系统不足以平衡长期ROS水平(10]。活性氧积累一段时间后,减少了IPM,可行性,能动性和MDA水平和细胞凋亡增加(表中的行4)。此外,当精液储存extender,精子代谢过程增加,形成乳酸,减少介质的pH值。pH值的减少会影响代谢过程,限制ATP生产,随后减少精子的运动性(53]。
山羊AI,进步的能动性的延长精液必须保持在40%以上(1]。当与SM-EY extender储存在5°C时,精子逐步运动性保持≥40%为T1和三天五天T0(控制)和T2。对照组优于refrigerator-preserved土著ram精液,保持最低运动性只有48 h的脱脂牛奶extender (54]。然而,在这项研究中对照组不如Ettawa山羊精液在脱脂牛奶extender,保持进步的能动性的阈值为4天在5°C (6]。
在先前的研究中,剂量为6000万精子宫颈内AI会导致怀孕率94.73%的配料有山羊(14]。基于授精剂量,单一配料山羊精液可分为57剂量体积(0.38毫升)12μg IGF-I复杂蛋白质/毫升SM-EY extender (T1)。Bubenickova et al。55]报道之间的正相关IGF-I复杂的蛋白质在马精浆的浓度和浓度,形态学,精子的运动性。此外,IGF-I维护ram精子功能后冷冻存储(56)通过为精子代谢提供一个稳定的能源供应(16]。较低的精浆IGF-I浓度也显著相关的比例不正常精子形态(57]。拟议中的igf - 1活性维护机制通过增加葡萄糖吸收,能量代谢丙酮酸脱氢酶活性和抗氧化作用以及存储(58]。
5。结论
的12μg蛋白/毫升脱脂milk-egg蛋黄extender山羊精液储存在低温是有效维持最好的精子质量在运动性方面,可行性和质膜完整,抑制MDA生产和细胞凋亡。
数据可用性
本研究的数据可从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突与此相关出版物,也没有财政支持,可能影响其结果。
作者的贡献
Suherni Susilowati编译思想和设计本文的主要框架的一部分Suherni Susilowati研究在伊玛目Mustofa的监督下工作。Suherni Susilowati Indah诺玛特里亚纳加工和稀释5°C的山羊精液质量评估(可行性、能动性、IPM)。与此同时,Indah诺玛特里亚纳和Budi Utomo MDA水平和染色加工的测量和评估精子细胞凋亡。Suzanita Utama, Budi Utomo,伊玛目Mustofa进行了统计分析和构思的手稿。伊玛目Mustofa和Wurlina Wurlina批判性阅读和知识内容的修订后的手稿。所有作者阅读和批准最后的手稿。
确认
作者感谢博士Trilas Sardjito, DMV。,M. Kes, the Chairman of Regional Insemination Center, Faculty of Veterinary Medicine Universitas Airlangga, and Subchan Aziz and Agus Purwanto for technical support. The authors also acknowledge the Center for Journal Development and Scientific Publication of Universitas Airlangga and Enago English Editing for proofreading the manuscript. This work was supported by the Directorate General of Higher Education, Ministry of Research, Technology, and Higher Education (RISTEK-DIKTI), Republic of Indonesia (Grants nos. 4/AMD/E1/KP.PTNBH/2020 and 765/UN3.14/PT2020).