2012年至2014年在沙特阿拉伯东部地区肉鸡四传染性支气管炎病毒谱系的Cocirculation

摘要

禽传染性支气管炎病毒(IBV)是一种不断发展的动态病毒，给世界各地的家禽业造成重大经济损失。这种病毒的持续进化和新变种的出现是常规疫苗控制该病的主要挑战。成功的疫苗接种通常需要使用同源疫苗，这反过来又需要对循环毒株进行持续的调查。在此，我们在沙特阿拉伯东部地区的肉鸡群中进行了基于逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的调查。2012年1月至2014年3月，在接受检测的鸡群中，36.5%(115只中42只)发现IBV。对Spike (S)-1基因的高变区3 (high - variable region-3, HVR-3)进行直接测序，然后进行系统发育分析，确定循环IBV基因型。这一地区同时存在四种亚型，包括GI-13或4/91 IBV(31%)、GI-16或CK/CH/LDL/97I IBV(28.6%)、GI-1或Mass IBV(19%)和GI-23或中东IBV(21.4%)。后者包括两个亚群:IS/720/99 IBV(16.7%)和IS/Variant2/98 IBV(4.7%)。在4/91和大众血统中检测到的一些可能属于疫苗株。未使用相应疫苗的菌株(CK/CH/LDL/97I和中东)占本研究中分离株的50%。 Based on identity with the vaccine sequences, field observations, and frequent detection, these two lineages appear to be out of coverage of the IBV vaccines used in Saudi Arabia. This is the first time to identify Middle East lineage (IS/720/99 IBV and IS/Variant2/98 IBV) in the Eastern Region of Saudi Arabia.

1.介绍

传染性支气管炎是一种急性、高度传染性的呼吸道疾病(背带吊裤带家)这几乎存在于所有家禽密集型产业的地区。除了累及呼吸系统外，IB还可能影响泌尿生殖道和/或消化道。因严重影响体重增加、蛋类的质量和数量，以及使禽鸟易受二次感染，引致重大经济损失[1]。

病原体是传染性支气管炎病毒(IBV)，属于第三类冠状病毒家庭冠状。IBV is an enveloped virus with a single-stranded positive-sense RNA genome of approximately 27.6 kb. Four structural proteins (spike (S), envelope (E), membrane (M), and nucleocapsid (N)) were reported to be encoded by the IBV genome [2]。糖基化的S蛋白在翻译后通过细胞蛋白酶裂解成S1，其形成尖峰灯泡，和S2，其锚S1至病毒体膜。S1和S2亚单位已经显示出介导病毒附着和膜融合，分别。病毒中和表位位于S1糖蛋白的第一和第三季度[2,3.]。3个高变区(HVR)-1、2和3分别位于氨基酸38 - 67、91 - 141和274 - 387之间的S1亚基上[4]。这些HVR由于基因突变和/或重组的遗传变异在新的血清型IBV /基因型的不断涌现被牵连[5]。在这方面，在S1亚基10至15个氨基酸（2-3％）的取代已显示导致产生一个新的血清型[6]。

IBV血清型的大批已有报道全球，其中一些仍仅限于特定的地理区域，而另一些在世界上大多数倾向于蔓延[5,7]。接种疫苗是用于控制IBV感染的主要措施，但是在选择与流行的IBV血清型同源的疫苗株时必须谨慎。接种挑战研究表明，根据所使用的标准，异种疫苗的保护作用介于非常差到中等之间。S1氨基酸序列只有5%的差异就可能导致交叉保护不良，而大多数IBV血清型之间的差异可达20-25%至50% [6]。因此，S1核苷酸序列相似性和基因分型的方法已被成功地用于预测的交叉保护和循环血清型，但有一些例外[8,9]。近年来，根据S1序列将IBV分为6个主要基因型(GI - GVI)，共32个系[10]。

在沙特阿拉伯很少有报告评估IBV感染。该地区的IBV感染可追溯至1984年，当时Zwaagstra等人报告了一种IBV分离株，但没有说明其血清型[11]。的4/91血清型IBV（GI-13谱系）在沙特阿拉伯中检测到2000 [12]。属于该血清型和血清型质谱（GI-1谱系），如H120和MA5疫苗株，都在使用中，以控制IB发生;然而，IB仍然发生由于CH / CK / LDL / 97I（GI-16）谱系，中东（GI-23）谱系（IS / 720/99和IS / VARIANT2 / 98），和D274（GI-12）谱系[13,14]。株类似于在埃及，印度，中国，意大利和循环也有报道东部地区沙特阿拉伯[15]。在本研究中，我们报道了IBV谱系在沙特阿拉伯东部地区115种肉鸡鸡群中循环。

2.材料和方法

2.1。伦理审批

在这项研究中所使用的所有实验程序和管理条件是由伦理委员会的费萨尔国王大学，沙特阿拉伯批准。

2.2。取样和核酸提取

这项研究是2012年1月至三月间进行的2014年样品，来自沙特阿拉伯的东部地区（铝Hassa和达曼）115种肉鸡鸡群访问肉鸡养殖场收集，肉鸡屠宰场，并在兽医教学医院家禽诊所费萨尔国王大学。组织样本，如气管，肺，脾，肾，法氏囊，从鸟类显示呼吸系统疾病的迹象收集。虽然并不总是成功的，人们试图收集采样羊群各种器官和完整的历史。对于每一个群，每个器官是从所有抽样鸟类汇集在一起​​。组织样品收集在含庆大霉素和制霉菌素10个体积磷酸盐缓冲盐水（PBS）（50 μ克每/毫升）。将样品储存在-80℃直到被均质化。均化用的是全向国际陶瓷珠试剂盒和BioSpecMini-珠磨器-16仪器上进行。对于每个器官，病毒核酸是根据制造商的说明从与IQEasy加病毒DNA / RNA提取试剂盒（目录号17153，内含子生物技术，韩国）均质化组织中提取。所提取的核酸的保存在-80℃直至通过RT-PCR进行测试。该菌株根据Cavanagh的命名系统命名[16包括国家/样本名称/抽样年份。

2.3。合成cDNA

第一链cDNA的合成使用逆转录系统(Cat #A3500, Promega, USA)根据制造商的说明进行。反应的最终体积为20μl containing the following ingredients: 5 mM MgCl₂,1x RT buffer, 1 mM of each dNTP, 1 U/μl重组RNasin®核糖核酸酶抑制剂，0.75 U/μAMV逆转录酶l, 25 ng/μl的随机引物，50 ng/μ升的总RNA。将反应混合物在95在42℃下温育45分钟，然后通过酶的热灭活℃下5分钟，4℃5分钟。该cDNA用无核酸酶的水稀释至50的最终体积 μl，并保存在−80℃，直到PCR检测。

2.4。N基因PCR

为了诊断目的，我们进行了以IBV核衣壳(N)基因为靶点的巢式PCR。使用已发表的引物N784、N1145、N791和N1129进行反应[17]，从Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, IA, USA)获得，见表1。巢式PCR反应使用Go Taq®绿色Master Mix (Cat #M7122, Promega)进行，最终体积为25μ含有引物以0.8的终浓度升 μ米2μ模板cDNA的l。使用Bio-Rad T-100热循环器进行扩增反应，94℃5分钟，35个循环，94℃45秒，60℃1分钟，72℃2分钟，最后72℃延长7分钟。第二轮巢式PCR使用了类似的热谱，除了退火步骤在53℃下进行1分钟，延长步骤在循环和最后延长步骤中分别持续了1分钟和10分钟。第二轮PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶在Tris-Borate-EDTA (TBE)缓冲液中分离。使用Red Safe (Cat #21141，内含子生物技术)作为DNA染色剂。对阳性样本进行S1基因PCR检测。

2.5。S1基因PCR

为了测序目的，我们进行了另一种针对IBV-S1基因HVR-3的巢式PCR。我们使用已发表的引物，包括SX1、SX2、SX3和SX4 [18]，它是从集成DNA技术（IDT，Coralville的，IA）获得并在表1。使用i-StarMAX II (Cat #25174，内含子生物技术)进行PCR，最终体积为50μl.一微升(终浓度0.2)μM)每个引物中，2μl为模板cDNA, 21μ不含核酸酶的水升加入到25 μ升的主混合物。此后，将反应以类似的方式被视为第二轮N基因PCR的不同之处在于退火温度为55℃1分钟，进行两轮的巢式PCR的。第二轮PCR产物上分离在TBE缓冲液在1.5％低熔点琼脂糖凝胶上。目标条带切出，并根据制造商的说明书，使用向导SV凝胶和PCR净化系统（目录号A1460，Promega）中从琼脂糖凝胶中纯化扩增子。纯化扩增子被测序Macrogen服务（韩国）测序。

2.6。隔离

通过Gelb与佳木[描述的分离方案19执行]传播病毒在鸡胚无特定病原（SPF）鸡蛋（SPF尼罗河，埃及）。分离从样品尝试（表2），其产生在N基因PCR阳性的结果，但接通负或弱阳性的S1基因的PCR。Before inoculation, homogenized tissue samples were centrifuged at 1000 ×g for 10 minutes. The centrifugation-derived supernatant was passed through a 0.2 μ米无菌尼龙注射过滤器（Thermo Scientific的，Nalgene®，目录号195-2520，美国）。A 200 μl体积滤液接种于10日龄胚胎卵尿囊腔内。接种后48小时，接种后的鸡蛋放置在4℃过夜。收集尿囊液(AFs)作为接种，接种率为100μl/卵细胞，增加两次传代。采用RT-PCR对第三传代的AFs进行重新检测。

2.7。序列分析

利用分子进化遗传分析（MEGA）X版本的软件[进行序列分析20]。使用Clustal W方法对序列进行对齐。对齐后的序列被修剪到327 nt的长度。(根据793/B S1基因序列(GB#Z83979)，从nt. 718 ~ 1044)。采用最大似然法构建系统发育树，bootstrap值为1000次重复。纳入29条IBV参考序列(图)1)。总体平均距离作为沙特分离株序列发散的指标，表示为平均总体序列对中每个序列不同碱基的数量。序列识别使用BioEdit version 7.1.7软件计算[21]。对所有序列进行BLAST搜索，以确定GenBank中最相关的序列。

2.8。疫苗接种史

表中列出了检测到IBV的鸡群的疫苗接种历史2。关于在其中检测4/91 IBV 13个成群，收到四种鸡群只有4/91疫苗，一个群所接收两个质量和4/91疫苗，和四个鸡群只获得质谱疫苗两次。历史是不能用于其他四个鸡群。对于12个成群其中CK / CH / LDL /检测97I IBV，接收8个成群质谱疫苗或者一次（n = 5) or twice (n= 3)，其中一群接种了一次4/91疫苗，另外三群没有历史记录。在大规模IBV呈阳性的8只鸡群中，5只鸡群接种了大规模疫苗，而另外3只鸡群则没有史。在IS/720/99 IBV阳性的7只鸡中，2只接种了H120疫苗，1只接种了4/91疫苗;其他4只鸡群没有历史记录。最后，检测到IS/Variant2/98的两个鸡群已经接种了大规模疫苗。

2.9。场和疫苗病毒之间的差异

在这项研究中不能明确确定贡献的疫苗病毒的部分所使用的方法;然而，去除用100％核苷酸同一性的参照疫苗序列的序列的使用仅作为指导，如先前所报道的[14,18,22]。与两种大规模疫苗(H120和Ma5)和4/91疫苗进行比较。

2.10。GenBank登录号

42 IBV的序列分离株从本研究中已经沉积在GenBank数据库以登录号MH648687到MH648727和MH449644，如图1和表2。

3.结果

3.1。检测率和基因分型

在研究期间，组织样品，来自沙特阿拉伯的东部地区115个肉鸡群收集。从42鸡群（36.52％）的样品呈阳性IBV在N和S1基因的RT-PCR中（表2)直接或在SPF卵中隔离后。分离SA/IH1/12、SA/IH5/12、SA/IH11/13、SA/IH19/13、SA/IH21/13、SA/IC8/13、SA/IC15/13 7份样品。通过对42个沙特分离株的S1部分基因序列和29个参考序列进行系统发育分析，将这些分离株分离为4个世系(图)1和补充表1)，包括GI-13(4/91)、GI-16 (CK/CH/LDL/97I)、GI-1 (Mass)和GI-23(中东)，包括两个细分:IS/720/99和IS/Variant2/98 IBVs。

3.2。GI-13或4/91谱系

第一簇包括该用4/91分组13组的序列，IS / VARIANT1，IS / 1366，和其它参考序列。的BLAST搜索91分之4样序列表明，4/91应变（GB＃AF093794）是最相似的序列，与身份96.9％，并通过S1基因的测序区100％之间的范围内。Sequences of this lineage showed an overall mean distance of 3.000 ± 0.720 nucleotides and an average nucleotide identity of 99.5% with the 4/91 vaccine (Table3.)。

3.3。GI-16或CK / CH / LDL / 97I谱系

第二谱系包括12个序列，其周围的CK / CH / LDL / 97I，CK / CH / SCYA / 101，Q1，和J2参考序列聚类。的BLAST搜索CK / CH / LDL / 97I状显示，中国Q1是最相似的序列，与核苷酸同一性为99.0％，并通过S1基因的测序部分100％之间的测距序列。The overall mean distance was 0.667 ± 0.316 nucleotides. The average nucleotide identity of these sequences with the IBV vaccines was 79.5% with the H120 and Ma5 vaccines and 81.7% with the 4/91 vaccine (Table3.)。

3.4。GI-1或大众血统

八个沙特序列包含在与质谱血清型菌株，包括H120，MA5，M41，Beaudette的和康涅狄格参考序列该谱系在一起。BLAST检索用于质谱样序列揭示H120为最相似的序列，与身份97.8和100％之间不等％在S1基因的测序一部分。The overall mean distance of this group was 2.000 ± 0.674 nucleotides. The presented sequences showed a 99.7% average nucleotide identity with the H120 and Ma5 vaccines (Table3.)。

3.5。GI-23或中东血统

第四谱系包括9个沙特分离和进一步细分为两个子组：IS / 720/00和IBV IS / VARIANT2 / 98 IBV。IS /九十九分之七百二十零IBV包括该组装围绕中东Sul的7株沙特阿拉伯/ 01/09，IR / 59/2010年，IS / 885/00，和IS /九十九分之七百二十零参考序列。BLAST检索用于IS / 720/99样序列表明，IR / IS720 / H140 / 11是最相关的序列，与身份97.8％，并通过S1基因的测序区99.3％之间的范围内。The overall mean distance for these sequences was 4.952 ± 1.463 nucleotides, and their nucleotide identities were on average 81.9% with both the Mass vaccines and the 4/91 vaccine (Table3.)。在另一个亚组IS/Variant2/98 IBV中，参考序列IS/Variant2/98和IS/1494/06只有两个沙特阿拉伯的序列。对IS/ variant2 /98相似序列的BLAST搜索显示，IS/1494/06是最相似的序列，在S1基因测序部分的识别率在97.8%到100%之间。总平均距离为7.000±2.552个核苷酸。大规模疫苗和4/91疫苗的平均核苷酸同一性分别为82.2%和83.0%(见表)3.)。

3.6。野战病毒和疫苗病毒

沙特阿拉伯至少使用了两种IBV疫苗(Mass和4/91)。因此，这两个谱系中的分离株可能属于疫苗病毒。我们将这些分离株的部分s1基因序列与相关疫苗进行了比较。在4/91谱系的13个序列中有9个序列和在8个序列中有6个序列在S1基因的测序部分上与相应的疫苗序列完全一致(见表)2)。

4.讨论

本调查文件IBV谱系期间在沙特阿拉伯东部地区的肉鸡鸡群中循环，从2012年1月至2014年3月获IBV的检测，我们使用了验证和高度敏感的巢式PCR有针对性的N个的保守部分基因在其他研究经常使用13,17,23,24]。

在目前的工作中，在IBV被测鸡群的36.5％进行检测。稍微较高的检测率（42.7％）被报道在利雅得2009年10月和2010年5月之间。25]。在解释这些结果时应谨慎，因为样本仅采集自有呼吸道疾病症状的禽群。类似的调查显示，伊拉克南部的破案率高达74% [26，埃及有64% [27，约旦60% [28，西欧59% [18，伊朗52% [29，伊朗东部占37.5% [三十， 34%在俄罗斯[22]，并在中南部伊拉克[32％31]。无论其临床表现的测试成群有望揭示低检测率先前由陈某等人报道[32]。此外，疫苗分离株只占这个百分比的一小部分。

将目前沙特分离株的序列与IBV疫苗的序列进行比较，发现Mass和4/91系分别有6株和9株分离株具有与疫苗相同的序列(表)2)。在其他以rt - pcr为基础的调查中也报告了类似的疫苗检出率，其中疫苗约占疫苗系总检出率的一半或更多[14,18,22]。如果疫苗相同的序列被拆除，CK / CH / LDL / 97I谱系将成为沙特阿拉伯东部地区占主导地位的血统。

在沙特阿拉伯，CK / CH / LDL / 97I（GI-16）谱系最早在利雅得报道2009-2010 [25]。然后，这株被Ababneh和他的同事报道2011年在沙特阿拉伯，约旦和伊拉克13]。在本研究中，2012年1月至2014年3月，在沙特阿拉伯东部地区，CK/CH/LDL/97I谱系的检测率为28.6%(12/42)。在2009年至2014年的交叠期间，沙特阿拉伯的这一谱系的检出率为17% [14]。相反，这种菌株不存在或因为它不是在埃及，黎巴嫩，约旦，科威特，阿联酋（UAE）和阿曼[研究检测了周边国家的低患病率14,33)、伊拉克(26,31，以及伊朗[29,三十]。

我们的数据显示，在检测到CK/CH/LDL/97I谱系的12只鸡中，有8只接种了大规模疫苗，而其中一只只接种了4/91疫苗;其余三群的历史是不可用的。这一发现并不令人惊讶，因为最初的CK/CH/LDL/97I菌株是从接种了h120疫苗的群体中分离出来的。同样，疫苗攻毒实验表明，异种疫苗对CK/CH/LDL/97I IBV也没有提供足够的保护。与此相反，由同一类型衍生的疫苗可提供完全保护，并在鸡胚蛋中传代减毒。[34]。在沙特阿拉伯，这一谱系在肉鸡中的高流行似乎是由于仅使用异种疫苗造成的免疫缺口造成的。IT-02 IBV株在西班牙4/91接种过疫苗的鸡群中传播的情况也类似[9]。

在4/91（G1-13）血统最早是在沙特阿拉伯报告于2000年[12]。在目前的调查中，2012年至2014年间，在沙特阿拉伯东部地区发现的4/91血统的比率为31%。同样，在2009年至2014年期间，它是沙特阿拉伯最流行的血统，检出率为43% [14]，并报告的40％的检测率和伊拉克[50％26,31，阿曼为64%和81%，阿联酋为85%[。14,33]。4/91家族在伊朗(19%和27%)、埃及(17%)和黎巴嫩(13%)也是第二流行的家族，但在约旦和科威特没有发现[14,29,三十]。

在目前的研究中，大约三分之二的4/91分离株(13个中的9个)显示出100%的序列与4/91疫苗病毒一致。这些分离株很可能属于疫苗病毒。这一猜测得到了最近在9只鸡群中4只使用4/91疫苗的历史的支持。相反，在这9只鸡群中，有4只只接种了大规模疫苗，而第9只鸡群没有接种史。请记住，大约70%的4/91样序列是与疫苗相同的，该谱系包含了一些显示相对高序列差异的分离株(见表)3.)。正如Lee和Jackwood先前提出的那样，大量使用疫苗可能导致这种分歧[35]。与此相反，CK / CH / LDL / 97I谱系表现出最低的发散，这可能进一步支持我们通过对CK / CH / LDL / 97I谱系病毒的使用的疫苗所施加的低免疫压力的理由。

在本研究中，检测到肿块(GI-1)的比率为19%。Ganapathy和他的同事(2015)在2009-2014年沙特阿拉伯的调查中也发现了类似的比例(17%)。在埃及(8%)、黎巴嫩(4%)、阿联酋(4%)、伊拉克(6%)、阿曼(6%和3%)和伊朗(3%)等周边国家报告的患病率相对较低，在约旦和科威特检测不到[14,26,29,33]。

在为大规模谱系恢复的8株分离株中，有6株显示了与疫苗相同的序列，可能属于大规模疫苗株。赞成这一观点的是，这6个与疫苗相同的分离株中有4个是从接受大规模疫苗的鸡群中获得的;其余两个羊的历史是不可用的。相反，8个批量分离株中有2个与批量疫苗不完全一致(SA/IH20/13和SA/IC79/13)。SA/IH20/13与大规模疫苗序列具有99.6%的核苷酸一致性，并从大规模接种的鸡群中恢复(表)2)。同样，SA/IH3/12(4/91样分离物)与4/91疫苗序列具有99.6%的核苷酸一致性，并从接种4/91疫苗的群体中获得。这些分离株是属于田间病毒还是属于突变疫苗病毒尚不清楚。核苷酸突变和随后的氨基酸替换可能影响疫苗的保护作用，甚至导致疫苗逆转。据报道，大量M41菌株的逸出突变发生在134位的单核苷酸突变，导致S1基因HVR-1的45位氨基酸发生变化[36]。

在目前的研究中，IS /九十九分之七百二十零IBV中东期间在沙特阿拉伯东部地区7种鸡群（16.7％）中检测到从2012年至2014年这种细分是第一（GI-23）谱系的由Ganapathy等人及以上2014年报道沙特阿拉伯在2010年IBV阳性样品的11％检测[14]。在本研究中，所有7个菌株在2013年被回收（表2)。同样，大多数由Ganapathy和他的同事在检测的2013年进行了改造，而这种病毒在2011年和2012年[是几乎检测不到14]。在检出率的差异可能反映了介绍，这基因型在国内的持续蔓延的时间。在IS /99分之720IBV显示出具有在阿曼（3％）的低发病率和在约旦，黎巴嫩，科威特，UAE，伊拉克，伊朗等中没有检测到。与此相反，IS /九十九分之七百二十零IBV在埃及最普遍的（71％）[14,26,29- - - - - -31,33]。

在检测到IS/720/99 IBV的7只鸡群中，有3只鸡的疫苗接种史可供查询。两群羊接种了疫苗，一群羊接种了4/91疫苗。接种攻毒实验表明，H120疫苗对IS/720/99的保护作用不大[37]。在本研究的测序区域，IS/720/99样分离株与Ma5或4/91疫苗的遗传亲缘性并不优于H120。因此，我们可以合理地预期这些异种疫苗的交叉保护效果很差。

中东（GI-23）谱系的其他细分在该研究中检测到的是IS / VARIANT2 / 98 IBV。我们的数据表明，IS / VARIANT2 / 98 IBV曾在沙特阿拉伯东部地区患病率最低（4.7％）。从2009年到2014年，11％的发病率据报道，沙特阿拉伯和埃及4％，并在阿联酋[未检测到应变14]。类似地，21％和3％的可变患病率在重叠周期2009至2014年和2012年分别在报告了阿曼[14,33]。相反，据报告，这一毒株在邻近的北方国家最为流行，包括约旦和科威特的患病率为100%;在黎巴嫩82%;伊朗有67%，70%和75%;伊拉克的支持率为47% [14,29- - - - - -31,38]。

在本研究中报道的IS/Variant2/98细分中的两个分离株是从两个大规模接种的肉鸡群中回收的。根据h1n1 - 20接种疫苗的鸡群的实地观察报告[39]和可用疫苗分离株(Mass和4/91)的序列相似性，序列一致性≤83%(表)3.），这些疫苗似乎不太能够提供保护，防止IS / VARIANT2样病毒株。

如上所述，来自不同国家，甚至来自同一国家报告的检出率之间存在着相当大的差异，例如，在沙特阿拉伯4/91血统的检出率的差异报道这项研究和Ganapathy等人（2015）和在IS / VARIANT2 / 98 IBV阿曼的检出率的上述差异。同样，其他谱系的报道在周边国家，但不是在沙特阿拉伯，反之亦然;例如，QX（或GI-19）在谱系在伊拉克[7％和8伊朗％和9％率检测29- - - - - -31]。同样，Ganapathy和他的同事（2015年）检测到的D274（或GI-12）的血统，在一次出的236个样本期间2009年至2014年期间的频率，而我们在没有检测到该谱系在沙特阿拉伯东部地区从2012年至2014年期间同样，CK / CH / LDL / 97I血统在沙特阿拉伯而不是在周边国家十分普遍。几个因素可能会导致这种不一致性，包括但不限于以下：（1）在采样人口的差异，如那些从采样不同鸟类（肉鸡，层，育种者等）出现;（2）血清型的使用的疫苗的（一个或多个），它们的应用的频率，并且它们提供对循环基因型的保护;（3）取样鸡群候鸟和本地化的迁移路线上的效果[40,41]。（4）施加的生物安全措施;（五）国家和地区[之间家禽产品交换13]。此外，测试不同的组织也将有助于变化的检出率。IBV疫苗和场病毒，或它们的基因组/抗原，在各种组织[中检测到42- - - - - -44，并有报告说在某些脏器，特别是盲肠扁桃体中存在[18,45- - - - - -48]。因此，检测后一种组织一方面会提高检出率，另一方面也会增加疫苗病毒贡献的比例，正如Callison等人之前推测的那样[49]。

在本研究中，基因分型IBV通过巢式RT-PCR扩增子产生的直接测序执行的目标的S1基因的HVR-3 [18]。自引入以来，该方法已被频繁用于IBV基因分型[14,29,50- - - - - -52]。IBV-S1基因全测序和部分测序的优缺点已有报道[53]。根据由Valastro等发表的部分（HVR-3）S1基因序列的系统发育分析。(10，本研究涉及的所有谱系(G1-1、-13、-16和-23)形成了不同且支撑良好的簇(shimodaira - hasegawa样试验支撑值≥0.93)。事实上，Valastro等人在使用部分342 nt时指出了8个谱系(GI-5， -7， -10， -18， -22， -24， -25，和-27)在系统发育中失去了统一。编码HVR3 [10]。然而，目前工作的主要局限性是用于系统发育分析的S1基因的部分序列。完整的S1基因序列将提供更准确的分析，特别是区分田病毒和疫苗病毒。

总之，我们的数据表明，IB是在沙特阿拉伯东部地区的肉鸡鸡群中普遍存在的一种疾病。发现四IBV系在这一地区cocirculate。检测出的菌株中有一半属于两个这些谱系（CK / CH / LDL / 97I和中东）针对其没有同系物的疫苗可用，这些谱系预计仍将导致IBV的爆发和经济损失在没有这种疫苗。进一步的研究，以阐明血清型，致病型和地方性类型的protectotypic属性是必需的。在IBV类型沙特阿拉伯循环以及疫苗接种策略的不断更新的连续监测似乎是要控制IBV感染。

数据可用性

用于支持本文的结论流行病学数据包括在项目之内。用于本文的支持发现的序列数据，根据本文中示出登录号保藏在GenBank中。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

作者要感谢沙特阿拉伯费萨尔国王大学科学研究主任对这项工作的道义和财政支持(拨款号:130026)。提交人还感谢Mustafa Ababneh博士和Mohamed Saleem先生。

补充材料

补充表1:基于17株IBV分离株的部分S1基因序列和最相关的参考序列的核苷酸标识矩阵。参考序列以粗体显示。如SA/IH9/13、SA/IH11/13、SA/IH12/13、SA/IH15/13、SA/IH16/13、SA/IC10/13、SA/IC71/13、SA/IC78/13、SA/IC80/13;类似SA/IH8/12的SA/IH19/13、SA/IH25/13、SA/IH26/13、SA/IH27/13、SA/IH28/13、SA/IH29/13、SA/IC7/13和SA/IC16/13;与SA/IH6/12相似的SA/H21/13、SA/IH22/13、SA/IC3/13、SA/IC24/13和SA/IC72/13;SA / SA / H10/13 H14/13类似;SA/C8/13和SA/IC9/13与SA/IC6/13相似。(补充材料)

参考

1. D. Cavanagh和J. Gelb，《传染性支气管炎家禽的疾病M. SAIF、A. M. Fadly、J. R. Glisson、L. R. Mcdougald、L. K. Nolan和D. E. Swayne等。，第117-135页，布莱克威尔出版，艾姆斯，美国，爱荷华，第12版，2008年。查看在：谷歌学术
2. 冠状病毒禽传染性支气管炎病毒，"兽医研究卷。38，没有。2，第281-297，2007。查看在：出版商的网站|谷歌学术
3. M. W.佳木，D. A.希尔特，S. A.凯里森，C.-W.李，H.广场和E.韦德，“传染性支气管炎病毒的刺突蛋白切割识别位点分析，”禽类疾病第45卷，no。2，第366-372页，2001。查看在：出版商的网站|谷歌学术
4. A. Rimondi, M. I. Craig, A. Vagnozzi, G. Konig, M. Delamer，和A. Pereda，“阿根廷禽流感暴发(2001-2008)禽流感传染性支气管炎病毒株的分子特性研究”，禽流感病理卷。38，没有。2期，第149-153，2009。查看在：出版商的网站|谷歌学术
5. 蔡永平，“传染性支气管炎病毒变异:历史、现状和控制措施回顾”，《传染病病毒变异:历史、现状和控制措施》，禽流感病理卷。40，没有。3，第223-235，2011。查看在：出版商的网站|谷歌学术
6. D. Cavanagh， "严重急性呼吸综合征疫苗研制:鸟类传染性支气管炎冠状病毒疫苗接种的经验"，禽流感病理卷。32，没有。6，第567-582，2003。查看在：出版商的网站|谷歌学术
7. 《禽传染性支气管炎病毒》，J. Ignjatovic和S. Sapats，歌剧团科学研究等技术DE L'OIE卷。19，没有。2，第493-508，2000。查看在：出版商的网站|谷歌学术
8. 传染性支气管炎病毒S1基因序列比较是一个更好的预测挑战的免疫鸡比病毒中和血清型，禽流感病理第35卷，no。2, 127-133页，2006。查看在：出版商的网站|谷歌学术
9. R. Dolz, J. Pujols, G. Ordonez, R. Porta, and N. Majo，“西班牙禽流感传染性支气管炎病毒的分子流行病学和演化”，病毒学卷。374，没有。1，第50-59，2008年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
10. V. Valastro, E. C. Holmes, P. Britton等，“传染性支气管炎病毒的S1基因系统发育:协调病毒分类的尝试”，感染，遗传学和进化，第39卷，第349-364页，2016。查看在：出版商的网站|谷歌学术
11. 王建民，“鸡传染性支气管炎病毒的快速检测与鉴定”，国立中山大学医学研究所硕士论文。临床微生物学杂志第30卷，no。1, 1992年79-84页。查看在：出版商的网站|谷歌学术
12. d . Cavanagh j。“793/B型传染性支气管炎病毒的刺突蛋白变异，在田间及鸡和胚胎蛋交替传代期间，”禽流感病理第34卷，no。1, 2005年第20-25页。查看在：出版商的网站|谷歌学术
13. M. Ababneh，A. E. Dalab，S. Alsaad，和M.铝Zghoul，“传染性支气管炎病毒株CK的存在/ CH / LDL / 97I在中东，”ISRN兽医学卷。2012年，文章编号201721，6页，2012。查看在：出版商的网站|谷歌学术
14. K. Ganapathy，C.球，和A. Forrester公司“的传染性支气管炎病毒，2009年和2014年之间在中东流传基因型，”病毒研究，第210卷，第198-204页，2015。查看在：出版商的网站|谷歌学术
15. M. G. Hemida, M. A. Al-Hammadi, A. H. S. Daleb, C. R. Gonsalves，“从沙特阿拉伯东部鸡中分离出的病毒性传染性支气管炎病毒的分子特性和系统发育分析”，VirusDisease第28卷第2期2，第189-199页，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术
16. D.卡瓦纳，“A禽冠状病毒分离株的命名和物种地位问题，”禽流感病理第30卷，no。2，第109-115页，2001。查看在：出版商的网站|谷歌学术
17. a . Farsang, C. Ros, L. H. M. Renstrom, C. Baule, T. Soos，和S. Belak，“瑞典传染性支气管炎病毒的分子流行病研究表明疫苗株的参与，”禽流感病理卷。31，没有。3，第229-236，2002。查看在：出版商的网站|谷歌学术
18. 《2002年至2006年西欧传染性支气管炎病毒基因型的逆转录-聚合酶链反应调查》。禽流感病理卷。37，没有。3，第247-257，2008。查看在：出版商的网站|谷歌学术
19. J. J. Gelb与M. W.佳木，“传染病broncitis，”在实验室手册禽类病原体的分离和鉴定，D. E. Swayne，J. R.格利森，M. W.佳木，J. E.皮尔逊和W. R.里德，编辑，第169-174，禽病理学家协会，宾夕法尼亚大学，肯尼特广场，PA，USA，第4版，1998年。查看在：谷歌学术
20. S. Kumar, G. Stecher, M. Li, C. Knyaz，和K. Tamura，“Mega X:跨计算平台的分子进化遗传学分析”，分子生物学与进化第35卷，no。2018年，第1547-1549页。查看在：出版商的网站|谷歌学术
21. 生物编辑:一个用户友好的生物序列比对编辑器和分析程序的Windows 95/98/NT， "核酸研讨会系列卷。41，第95-98，1999年。查看在：谷歌学术
22. 李志强，“从俄罗斯及其邻国分离出的传染性支气管炎病毒的分子特性:S1基因型间重组的鉴定”。禽流感病理卷。40，没有。5，第507-514，2011。查看在：出版商的网站|谷歌学术
23. z.h Mahmood, r.r. Sleman，和a . U. Uthman，“禽流感传染性支气管炎病毒的分离和分子特性，表明中东出现了一个新的基因型，”兽医微生物学卷。150，没有。1-2，第21-27，2011。查看在：出版商的网站|谷歌学术
24. V. Sumi, S. D. Singh, K. Dhama, V. Gowthaman, R. Barathidasan和K. Sukumar， "从最近爆发的肉鸡群中分离出的传染性支气管炎病毒和分子特性揭示了印度出现了新毒株，"热带动物保健和生产卷。44，没有。7，第1791至1795年，2012。查看在：出版商的网站|谷歌学术
25. 胡志明，“在沙特阿拉伯利雅得省鸡群中传播的传染性支气管炎病毒(IBV)的分子调查和系统发育分析，”湖北畜牧兽医的进展，第13卷，第1002-1008页，2014。查看在：谷歌学术
26. W.塞格，A Ghalyanchi Langeroudi，五卡里米，O. Madadgar，M. Vasfi马兰迪和M. Hashemzadeh，“鸡传染性支气管炎病毒的流行在伊拉克，2014年南肉鸡养鸡场 - 2015年，”兽医RES论坛第7卷，no。4，第317-321页，2016a。查看在：谷歌学术
27. K. Selim, A. S. Arafa, H. A. Hussein, A. A. El-Sanousi，“2012年埃及肉鸡和分层养鸡场分离的传染性支气管炎病毒的分子特性”，国际兽医科学与医学的，第1卷，no。2，第102-108页，2013年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
28. D. A. Roussan，W. S. Totanji和G Y. Khawaldeh，“在约旦肉鸡群鸡传染性支气管炎病毒分子亚型，”家禽科学卷。87，没有。4，第661-664，2008。查看在：出版商的网站|谷歌学术
29. A. Hamadana, A. Ghalyanchilangerodui, M. Hashemzadeh，“伊朗禽类传染性支气管炎病毒的基因分型(2015-2017年)显示IS-1494类病毒占主导地位，”病毒研究，第240卷，第101-106页，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术
30. A. Ghalyanchi-Langeroudi，五卡里米，A Jannat等人，“在伊朗，2015年东传染性支气管炎病毒基因分型，”伊朗病毒学杂志卷。9，没有。2，第31-35，2015年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
31. W. Seger, A. Ghalyanchilangeroudi, V. Karimi, O. Madadgar, M. V. Marandi, M. Hashemzadeh，“2014-2015年伊拉克肉鸡养殖场传染性支气管炎病毒的基因分型”，档案病毒学卷。161，没有。5，第1229至1237年，2016B。查看在：出版商的网站|谷歌学术
32. 陈宏伟，黄友平，王志华，“鸡屠宰后传染性支气管炎病毒的重组鉴定”，家禽科学，第89卷，no。3，第439-446页，2010。查看在：出版商的网站|谷歌学术
33. T.铝Shekaili，M.的Baylis和K. Ganapathy，“传染性支气管炎和阿曼后院家禽禽偏肺病毒的分子检测，”兽医科学研究卷。99，第46-52，2015年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
34. Liu S.， Zhang X.， Wang Y.等，“中国商业疫苗和减毒异源菌对传染性支气管炎冠状病毒CK/CH/LDL/97I株的保护作用评估”兽医杂志》，第179卷，no。1，第130-136页，2009。查看在：出版商的网站|谷歌学术
35. C.-W.Lee和M. W.佳木，“原产地和格鲁吉亚98（GA98），鸡传染性支气管炎病毒的血清型新进化”病毒研究第80卷，no。1-2，第33-39页，2001。查看在：出版商的网站|谷歌学术
36. D. Cavanagh, P. J. Davis, A. P. A. MOCKETT，“禽冠状病毒IBV(马萨诸塞血清型)刺突糖蛋白高变区1中的氨基酸与中和表位相关”病毒研究卷。11，没有。2，第141-150，1988。查看在：出版商的网站|谷歌学术
37. J.盖尔布JR，Y.韦斯曼，B. S. Ladman和R.梅厄，“S1基因特性和（1996〜2000年）对来自美国和以色列传染性支气管炎病毒野外分离接种的功效，”禽流感病理第34卷，no。3，第194-203，2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术
38. Y. Saadat, M. H. Bozorgmehri Fard, S. Charkhkar, H. Hosseini, N. Shaikhi，和B. Akbarpour，“从伊朗布什尔省肉鸡群分离的传染性支气管炎病毒的分子特性:2014 - 2015，”兽医研究论坛卷。8，第195-201，2017。查看在：谷歌学术
39. S. Kahya, F. Coven, S. Temelli, A. Eyigor和K. T. Carli，“IS/1494/06基因型相关传染性支气管炎病毒在土耳其种猪和肉鸡群中的存在，”安卡拉ÜniversitesiVeterinerFakültesiDergisi第60卷，no。1, 27-31页，2013。查看在：出版商的网站|谷歌学术
40. L.太阳，G.-H.张，J.-W.Jiang等人，“A马萨诸塞原型等从野生孔雀分离冠状病毒是致病的鸡，”病毒研究卷。130，没有。1-2，第121-128，2007。查看在：出版商的网站|谷歌学术
41. L. A.休斯C.野人C.奈勒M.班尼特，J.的Chantrey和R.琼斯，“在英格兰北部的野生鸟类种群遗传多样性的冠状病毒，”新发传染病卷。15，没有。7，第一零九一年至1094年，2009年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
42. A. G. Ambali和R. C. Jones，“传染性支气管炎病毒的肠变毒株感染雏鸡的早期发病机理”，禽类疾病第34卷，no。4, 1990年809-817页。查看在：出版商的网站|谷歌学术
43. A.阿卜杜勒穆奈姆，H.M。Madbouly和M. F.埃尔 - 凯德（Kady），“在埃及/贝尼-Suef的体外表征和发病/ 01;鸡传染性支气管炎病毒的基因型小说”贝尼苏弗兽医医学杂志卷。15，没有。2，2005年。查看在：谷歌学术
44. 范文伟，王宏华，张玉英，“鸡传染性支气管炎病毒M41、H120和SAIBK株在SPF鸡中的动态定量RT-PCR研究”，生物科学，生物技术，生化卷。76，没有。12，第2255至2260年，2012。查看在：谷歌学术
45. 《传染性支气管炎病毒的检测》，禽流感病理第29卷，no。2，第71-93页，2000。查看在：出版商的网站|谷歌学术
46. 刘建民，“鸡传染性支气管炎病毒在无抗体和抗体阳性鸡体内的持久性研究”，禽类疾病第47卷第2期3，第594-601页，2003。查看在：出版商的网站|谷歌学术
47. I. R.阿尔瓦拉多，P.维勒加斯，J.埃尔 - Attrache和M. W.佳木，“肉鸡传染性支气管炎病毒的马萨诸塞州和阿肯色州血清型检测，”禽类疾病卷。50，没有。2，第292-297，2006年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
48. F. Amjad, N. Hassan, H. Arsalan，“通过逆转录-聚合酶链反应在实验感染的公鸡睾丸组织中检测感染性支气管炎病毒4/91株，”非洲农业研究杂志，第四卷，第1093-1096页，2009年。查看在：谷歌学术
49. S. a . Callison, D. a . Hilt, T. O. Boynton等，“用于检测感染鸡传染性支气管炎病毒的实时Taqman RT-PCR试验的开发和评估，”病毒学方法杂志第138卷，no。1-2，第60-65页，2006年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
50. b . Vidovićm .Šekler d·罗根et al .,“传染性支气管炎病毒株的分子表征与接种疫苗的羊群在塞尔维亚及其与周边国家的分离菌株,”卡夫卡大学的老练学生，Fakultesi Dergisi， 2018年第24卷。查看在：谷歌学术
51. N.萨德里，A. Ghalyanchilangeroudi，M. H.法拉赫Mehrabadi等人，“禽流的基因分型传染性支气管炎病毒阿富汗（2016- 2017年）：第一个报告，”伊朗兽医研究第20卷，no。1，第60-63页，2019年。查看在：谷歌学术
52. M. H. Wibowo，T. E.金廷，和W.阿斯马拉，“致病91分之4样和QX-像传染性支气管炎病毒在印尼感染的商业家禽养殖场，分子鉴定”兽医世界卷。12，没有。2，第277-287，2019。查看在：出版商的网站|谷歌学术
53. 王建民，“鸡传染性支气管炎病毒的全基因序列与部分基因序列分析”，中华人民大学学报第9届鸟类冠状病毒和肺炎病毒国际研讨会论文集， 156-161页，乌得勒支，荷兰，2016年6月。查看在：谷歌学术

版权

版权所有©2020 Abdullah i.a. Al-Mubarak和Anwar a.g. Al-Kubati。这是一篇开放获取下发布的文章知识共享署名许可，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。