文摘gydF4y2Ba

一个有效的公山羊的传染性胸膜肺炎(CCPP)疫苗的增加产量是至关重要的健康的山羊具有成本效益的方式和动物传动物传播的预防对家畜和野生动物。这种疫苗的质量控制保证了可靠的供应纯,安全,有效的批次。作为这种控制的一部分,体外的量化gydF4y2Ba山羊支原体gydF4y2Ba无性系种群。gydF4y2BacapripneumoniaegydF4y2Ba(Mccp)蛋白在最后需要疫苗之前,我国疫苗进行批量发布和认证。当前用于量化方法是基于测量的总蛋白质使用bicinchonic酸(BCA)测试。这种方法量化的蛋白质疫苗包括污染物总量从媒体,从而导致高估Mccp数量的蛋白质,导致降低疫苗的免疫原性。immuno-capture ELISA(冰)是为特定的检测和量化我国Mccp抗原的疫苗。随着冰检测和措施两层之间的抗原抗体的数量,需要捕获和检测抗体。鼠单克隆抗体(mab)检测Mccp抗原产生和特点。其中一个马伯Mccp-25,用于开发冰作为一个未标记的捕获抗体和辣根过氧化物酶结合检测抗体。冰是标准化和评估使用一个内部参考样本,实验CCPP疫苗和商业CCPP疫苗。比较之间的聚合酶链反应(PCR)和冰显示好两者之间的相关性分析。此外,一个gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba冰方法相关在山羊体内sero-conversion与选定的测试疫苗接种。冰的敏感性约为30 ng / ml。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

山羊的传染性胸膜肺炎(CCPP)是一个在山羊传染性疾病所致gydF4y2Ba山羊支原体gydF4y2Ba亚种gydF4y2BacapripneumoniaegydF4y2Ba(Mccp)。最初被称为F38支原体,它第一次被孤立在肯尼亚从山羊的肺与胸膜肺炎gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。随后,Mccp被孤立在其他国家,例如乍得、埃塞俄比亚、印度、阿曼、苏丹、突尼斯、土耳其、和乌干达(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。我国现在也会影响一些物种的有蹄类动物,尤其是野生动物物种,如瞪羚和非洲瞪羚(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。该病传染性极强,是通过密切接触传播通过吸入呼吸道飞沫(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。临床上,性能会影响呼吸道急性形式和特点是发热、厌食,严重的呼吸窘迫,咳嗽,流鼻涕,呼吸困难,呼吸急促,纤维素性胸膜肺炎稻草色的胸膜液(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。我国第一症状类似于其他小反刍动物疾病和诊断必须由一个微分gydF4y2Ba出血性败血病gydF4y2Ba和小反刍动物有害生物(PPR)。山羊生产性能造成重大经济损失受感染的非洲、亚洲和中东国家在那里疟疾是地方流行病[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。发病率和死亡率可达100%,60 - 70%,分别,特别是在天真的羊群(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。我国疾病的分布不是很成熟,但是报告的临床疾病已经在非洲和亚洲30多个国家(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。疾病的控制主要是通过接种疫苗。在山羊可以表明,保护性免疫诱导通过使用用Mccp抗原在弗氏完全或不完全佐剂的免疫持续时间至少6个月后接种疫苗(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。我国疫苗的灭活准备F38支原体含有皂苷作为灭活剂和辅助gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。评价的lyophilised F38支原体抗原+皂素表明,最优配方为0.15毫克的抗原在3毫克/毫升的皂素的解决方案(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。皂素使支原体失去活性,并提供必要的辅助效果来刺激保护性免疫反应。一个免疫保护性免疫反应产生的最佳配方山羊,持续了超过一年(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。的lyophilised F38支原体可以存储在4°C或为14个月22°C不失其大量潜在的(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。目前,两种类型的CCPP疫苗配方由非洲联盟接收锅非洲动物疫苗中心(AU-PANVAC)质量控制:一种冻干之前必须重组注入动物和已经灭活CCPP疫苗含有皂素的液态形式。液体形式使得这个配方比冻干形式更不稳定。两种形式,量化Mccp抗原用于疫苗批效能评估。的最佳剂量抗原建立了0.15毫克的Mccp蛋白质和3毫克的皂素。当前分析用于Mccp我国疫苗抗原量化是bicinchonic酸(BCA)蛋白质分析。这个试验是用于蛋白质样品中总蛋白质的定量测试并不是特定于Mccp抗原。污染物从介质中存在的最终产品的数量可能会影响Mccp抗原疫苗的评估。这就构成了作为评价的一个挑战我国疫苗的效力gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。专门检测和量化Mccp蛋白质抗原的疫苗,另一种试验,如酶联免疫吸附试验(ELISA)是必要的。类似的方法已经发展为人类狂犬病疫苗和乙型肝炎(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。在这项研究中,一个冰试验的发展使用马伯作为捕获和检测抗体的检测和量化Mccp CCPP疫苗的蛋白质是报道。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。的制备gydF4y2Ba山羊支原体gydF4y2Ba亚种gydF4y2BaCapripneumoniaegydF4y2Ba抗原gydF4y2Ba

的Mccp F-38应变作为我国疫苗种子(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba在AU-PANVAC疫苗种子库是用于支原体文化,这是根据我国疫苗生产的协议。简单地说,这种疫苗种子在5毫升的重组Pleuropneumonia-Like生物(PPLO)媒体(美国MD21152 Difco)含20%马血清(美国M063103 Sigma-Aldrich,圣路易斯)和过滤0.45gydF4y2BaµgydF4y2Bam过滤器。重组种子接种在95毫升PPLO媒体,放置在一瓶200毫升和孵化37°C没有搅拌或空气供给平均10 - 15天,直到所需的浊度观测。三个段落意识到扩大10公升的文化所需的规模。每个通道完成接种的比率1:10。每种文化通道传递到下一个阶段如果获得所需的pH值6.65 - -6.95,如前所述[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba),如果文化是不受任何细菌污染。文化的收获是根据先前描述的协议(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]略微修改。简单地说,文化样本无菌分布在50毫升猎鹰管和离心10000×gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟在4°C。上层清液被丢弃,颗粒与无菌0.01洗了三次磷酸盐(PBS) pH值7.2。整除(1毫升)的上层清液洗涤步骤收集,和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)(美国卡尔斯巴德英杰公司)进行清洗的质量进行评估。最后洗后,Mccp颗粒在无菌PBS和重组三个失活的步骤是意识到使用0.1% Triton x - 100(美国M063103 Sigma-Aldrich,圣路易斯),0.1% beta-propiolactone (M063103 Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国),和0.2%甲醛(实验室化学,孟买,印度)。失活的步骤与崔(Mccp-T) beta-propiolactone (Mccp -gydF4y2BaβgydF4y2BaPL)、甲醛(Mccp-F)孵化24小时在4°C和整除培养检测可能的可行的gydF4y2Ba支原体gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

2.2。分子描述的文化gydF4y2Ba山羊支原体gydF4y2Ba无性系种群。gydF4y2BaCapripneumoniaegydF4y2Ba

Mccp DNA提取的文化协议后执行DNeasy工具包(试剂盒,希登,德国)。两个不同的PCR反应进行。第一个PCR反应是用DNA使用gydF4y2Ba支原体gydF4y2Bagenus-specific引物:上游引物GPO-3 5′-gggagcaaacaggattagataccct-3′和下游引物MGSO, 5′-tgcaccatctgtcactctgttaacctc-3′。这些都是用来放大280 bp的片段gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。在第二个PCR反应,Mccp特定引物Mccp MCCPF 5′-atcatttttaatcccttcaag-3′, 5′MCCPR -tactatgagtaattataatatatgcaa-3′用于放大316个基点的片段序列(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。扩增子呈现在1.5% (w / v)琼脂糖凝胶。gydF4y2Ba

2.3。一代和马伯的描述gydF4y2Ba

八周大BALB / c小鼠(Origin-Charles河,法国)平均体重20 g是由腹腔内注射接种200gydF4y2BaµgydF4y2Bal Mccp蛋白浓度为0.3毫克/毫升乳液混合1:1用弗氏完全佐剂。三个辅助注射有每隔三周:前两个提高不完全弗氏佐剂和最后提升没有任何辅助。四天后过去的提振,脾脏细胞被收集并与Ag8骨髓瘤细胞融合(来自粮农组织/国际原子能机构实验室、奥地利)。杂种细胞细胞的克隆选择和执行在一个步骤中,协议后ClonaCell™衔接工具包(干细胞技术、加拿大)。杂种细胞细胞收集殖民地后14天,在适当的培养基培养。间接ELISA (iELISA)测试进行筛选阳性克隆生产马伯使用Mccp蛋白质抗原。简而言之,ELISA板(NUNC-MaxiSorp、丹麦)被涂上一层(100抗原的解决方案gydF4y2BaµgydF4y2Ba信用证在4°C)和孵化过夜。盘子被洗了三次洗涤缓冲(WB)为0.002 M PBS含有0.05%渐变20 (PBS-T)去除游离抗原。剩余的免费绑定网站使用200板井被封锁gydF4y2BaµgydF4y2Bal (PBS-T含有5%脱脂奶(PBS-T-Milk)和孵化30分钟37°C。阻塞的解决方案是,和100年gydF4y2BaµgydF4y2Bal从杂种细胞细胞培养介质是添加到每个。盘子在孵化37°C 30分钟再洗,如上所述。然后,100年gydF4y2BaµgydF4y2Bal (antimouse免疫球蛋白peroxidase-labelled共轭(DAKO公司、丹麦)稀释1:1000年PBS-T-Milk被分发到每个。板块进一步孵化在37°C 30分钟。与PBS-T板块再次清洗,50gydF4y2BaµgydF4y2Ba显色底物lgydF4y2Ba3、3′,5、5′-gydF4y2Batetramethylbenzidine(三甲)(美国IL61101热科学、罗克福德)被添加到每个好,孵化10分钟37°C。颜色开发了50gydF4y2BaµgydF4y2Bal(硫酸(1米)的光学密度(OD)每个读者读了一个分光光度计与滤波器的波长450 nm。gydF4y2Ba

鼠标马伯同形像的描述(免疫球蛋白类、子类和轻链)都使用了快速ELISA鼠标马伯同形像工具包(美国IL61101热科学、罗克福德)。gydF4y2Ba

2.4。降水和辣根过氧化物酶(合)接合Mccp马伯gydF4y2Ba

积极的杂种细胞细胞在无血清培养基生产Mccp马伯是传播EX-CELL®610 - hsf杂种瘤细胞(M063103 Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国),和用于饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白(Igs) 50% (SAS)(美国IL61101热科学、罗克福德)+ 4°C的过夜孵化。免疫球蛋白是颗粒状的离心速度10000转30分钟和溶解在PBS缓冲透析使用Slide-A-Lyzer™透析磁带(美国IL61101热科学、罗克福德)与膜的排阻极限20 kDa。每个马伯量化了的搞笑BCA(美国IL61101热科学、罗克福德)蛋白质定量方法,然后用辣根过氧化物酶结合后合EZ-Link +激活过氧化物酶包协议(美国IL61101热科学、罗克福德)。gydF4y2Ba

2.5。发展的冰gydF4y2Ba

2.5.1。选择捕获和检测抗体gydF4y2Ba

马伯首先选择基于Mccp抗原的反应性取决于光密度(OD)。简而言之,ELISA板(NUNC-MaxiSorp、丹麦)被涂上一层Mccp抗原(1gydF4y2BaµgydF4y2Bag /隔夜孵化在4°C)。盘子洗,阻止了30分钟37°C。100年之后,gydF4y2BaµgydF4y2Bal每个HRP-conjugated马伯1:1000稀释了的井45分钟孵化37°C。洗盘子,50gydF4y2BaµgydF4y2Bal三甲被分发给所有井。颜色开发孵化15分钟后停止在一个黑暗的房间50gydF4y2BaµgydF4y2Bal(硫酸(1米)和ODs读如上表示。马伯呈现高OD被选为进一步评估捕获和检测抗体。gydF4y2Ba

选定的每个未标记的Ig马伯用于外套ELISA板(Nunc-Maxisorp、丹麦)一夜之间在4°C孵化。第二天洗了盘子PBS-T一分为二。在1一百毫升Mccp蛋白质的解决方案gydF4y2BaµgydF4y2Bag / ml准备在稀释缓冲(DB: PBS-T牛奶含有2%)添加到上半年的井,而100gydF4y2BaµgydF4y2Bal (DB(代表消极的抗原)添加到下半年的井。盘子在37°C孵化一小时允许相应的Mccp蛋白质被马伯。洗盘子,100gydF4y2BaµgydF4y2Bal的HRP-conjugated马伯1:500稀释准备在DB和添加到每个盘子的井45分钟的孵化37°C。洗盘子,50gydF4y2BaµgydF4y2Bal三甲的底物被添加到所有井15分钟和孵化37°C。通过添加50颜色开发停止了gydF4y2BaµgydF4y2Bal 1 M硫酸(M063103 Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国),入井,ODs读如上表示。绑定每个HRP-conjugated马伯的比例确定。gydF4y2Ba

2.5.2。内部参考标准和疫苗样本gydF4y2Ba

的内部参考标准(IRS) Mccp抗原和疫苗样本准备或选择评估冰。美国国税局准备如上所述使用0.1% Triton X作为灭活剂。美国国税局的纯度评估和量化也进行描述。美国国税局免费污染物随后被用作参考的具体量化的标准在冰上Mccp蛋白质。gydF4y2Ba

三个内部实验CCPP疫苗准备使用皂苷作为灭活剂和辅助。十三商业CCPP疫苗批次从四个制造商(A, B, C, D)测试发展的新冰。gydF4y2Ba

2.5.3。设计的冰gydF4y2Ba

马伯(Mccp25)之一的列表生成Mccp马伯被选为捕获和检测抗体的检测和量化Mccp抗原。滴定的Mccp25 /未标记的和Mccp25 / HRP-labelled进行确定每个抗体的最佳稀释的冰。连续稀释的抗体马伯准备和使用绑定Mccp蛋白质(1gydF4y2BaµgydF4y2Bag /)之前涂在微型板块。antimouse免疫球蛋白peroxidase-labelled共轭(DAKO公司、丹麦)被用来揭示Mccp25的绑定/未标记的。绑定Mccp25 / HRP-labelled直接显示了三甲。gydF4y2Ba

Mccp抗原是量化使用冰与未标记的设计和HRP-labelled马伯Mccp25。对于每个抗体,最佳稀释测定。ELISA板(Maxisorp Nunc)井被涂上一层100gydF4y2BaµgydF4y2Bal Mccp25 /未标记的的饱和稀释1:100。板块在一夜之间被孵化在4°C。第二天,洗涤步骤去除游离抗体。串行的国税局进行双倍稀释PBS-T含有2%牛奶,和100年gydF4y2BaµgydF4y2Ba每个稀释的l是分布式的盘子一小时孵化在37°C。稀释缓冲PBS-T包含2%的牛奶(M063103 Sigma-Aldrich,圣路易斯,美国),包括在板作为一个消极的控制。洗后一步去除游离Mccp抗原,100gydF4y2BaµgydF4y2Bal (Mccp25 / HRP-labelled稀释1:100添加到所有井的孵化一小时37°C。最后一次清洗步骤后,50gydF4y2BaµgydF4y2Bal(三甲衬底被添加到每个好,孵化10分钟37°C。色彩发展了50gydF4y2BaµgydF4y2Bal硫酸(1米),每个的光学密度(OD)和分光光度计读者阅读与滤波器的波长450纳米。gydF4y2Ba

2.6。BCA,支原体特异PCR和冰我国疫苗的质量评估方法gydF4y2Ba

18个样品的总数(13商业CCPP疫苗批次,三个在AU-PANVAC房子实验CCC疫苗批次生产,PBS和IRS)都是用BCA质量评估和新开发的冰蛋白量化。支原体特异PCR用于检测DNA。gydF4y2Ba

2.7。量化Mccp蛋白质的冰和体内血清转化gydF4y2Ba

15当地山羊用于关联的估计数量Mccp蛋白质用冰这些动物的抗体生产的水平。这些山羊被放置在五组有三个山羊。商业疫苗测试冰量化Mccp蛋白质的数量;疫苗P019守则和P137和疫苗P135 P206,显示良好,再多的特定Mccp蛋白质,分别被用来接种四组山羊。一个未接种疫苗组作为消极的控制。收集血液样本血清的准备在0天(疫苗接种前)。然后,在天5、7、14、21、28日31日和38 postvaccination收集血液样本用于测试商业CCPP competition-ELISA,如前所述[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。文化和分子描述gydF4y2Ba山羊支原体gydF4y2Ba亚种gydF4y2BaCapripneumoniaegydF4y2Ba

的增长Mccp观察的细丝和媒体的浊度。Mccp培养基的pH值的监测显示轻微的酸度的pH值相比正常的媒体(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。的noninoculated PPLO肉汤保持碱性,表明没有增长的生物污染。的分子描述Mccp文化使用PCR引物GPO3 / MGSO和MCCPF / MCCPR显示碎片在280和316个基点,分别代表普遍gydF4y2Ba支原体gydF4y2Ba属和gydF4y2BaMccpgydF4y2Ba分别genus-specific引物(数据没有提交)。gydF4y2Ba

3.2。的制备gydF4y2Ba山羊支原体gydF4y2Ba亚种gydF4y2BaCapripneumoniaegydF4y2Ba抗原和内部参考标准gydF4y2Ba

的洗gydF4y2Ba山羊支原体gydF4y2Ba亚种gydF4y2BacapripneumoniaegydF4y2Ba文化和失活过程进行评估。缓冲收集三洗后,和灭活球(Mccp-T Mccp -gydF4y2BaβgydF4y2BaPL和Mccp-F)被监控评估使用的蛋白sds - page(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。凝胶电泳显示的洗涤过程颗粒移除大部分的可溶性蛋白质来源于文化媒体,没有检测到蛋白在洗涤缓冲2和3。凝胶电泳数据还显示,triton-X和beta-propiolactone失活过程保持着良好的蛋白质含量,而用甲醛,大多数蛋白质出现退化。gydF4y2Ba

3.3。马伯的筛选和选择捕获抗体的冰gydF4y2Ba

八个杂种瘤细胞殖民地显示稳定生产马伯与Mccp抗原反应的间接ELISA (iELISA)被确定(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。三组马伯的确定取决于光密度的水平,表明蛋白质的表达水平或抗原决定基:gydF4y2Ba(我)gydF4y2Ba组1:Mccp16、Mccp21 Mccp25检测蛋白质或抗原决定基的高表达水平。gydF4y2Ba(2)gydF4y2Ba组2:Mccp10 Mccp17检测的介质中,蛋白质或抗原决定基的表达水平。gydF4y2Ba(3)gydF4y2Ba组3:Mccp2、Mccp19 Mccp5检测蛋白的表达水平较低或抗原决定基。gydF4y2Ba

同形像生成的马伯提出了表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

3.4。选择捕获和检测抗体设计冰gydF4y2Ba

马伯Mccp16、Mccp21 Mccp25呈现高OD Mccp蛋白质的检测iELISA选择传播的无血清培养基(SFM)。每个马伯沉淀和评估作为捕获或检测马伯的设计冰。同源马伯的交叉反应的数据捕获每个马伯表明的结合蛋白的无标号的Mccp25捕获抗体和HRP-labelled Mccp25作为检测抗体礼物Mccp绑定比率检测高蛋白质(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

马伯Mccp25未标记的和HRP-conjugated用作捕获和检测抗体,分别设计冰。稀释的捕获抗体被发现1:50稀释,而检测抗体可以从1:500 - 1:1000稀释(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.5。设计Mccp冰gydF4y2Ba

3.5.1。内部参考标准和实验性疫苗批次gydF4y2Ba

Mccp颗粒清洗和处理Triton x - 100年被选为美国国税局准备用作参考在冰上的具体量化Mccp抗原。gydF4y2Ba

三个实验疫苗批次准备。两个批次,EXPV1和EXPV2制定使用皂苷(3毫克/毫升)佐剂和失活剂Mccp颗粒。EXPV3,另一批是制定甲醛0.2%佐剂灭活Mccp颗粒,然后与皂素3毫克/毫升。三个批次由BCA量化与463年,327年和290年gydF4y2BaµgydF4y2Ba分别g / ml蛋白质。所需的最低剂量的CCPP疫苗是固定在0.15毫克/毫升的世界动物卫生组织手册标准诊断测试和疫苗。gydF4y2Ba

3.5.2。用冰Mccp估计蛋白质gydF4y2Ba

一个国税局浓度从5.08到0.64不等gydF4y2BaµgydF4y2Ba在冰和g / ml测试用于生成内部的标准曲线gydF4y2Ba(图0.9838的价值gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。这表明一个好的关系获得的OD量和蛋白质。冰限制Mccp蛋白质的检测确定为30 ng / ml。标准曲线的回归公式来源于被用来估计样品的蛋白浓度。gydF4y2Ba

3.6。比较的BCA,支原体特异PCR和冰疫苗质量评估的方法gydF4y2Ba

18份样品中使用三种测试方法测试,17个样品含有可检测水平的蛋白质,以BCA法来衡量,而只有12和10个样本包含特定疫苗的蛋白质,如所示gydF4y2Ba支原体gydF4y2Ba您分别PCR和冰。因此,BCA法倾向于高估的蛋白质含量比衡量冰。最消极的样品gydF4y2Ba支原体gydF4y2Ba同时被发现的还有特殊PCR -使用冰。然而,由甲醛灭活的疫苗(EXPV3)被发现积极的使用gydF4y2Ba支原体gydF4y2Ba特殊技能PCR但是负面的冰。Mccp标准疫苗作为一种积极的控制,而PBS是用作负控制(表gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.7。Mccp蛋白质性能量化疫苗由冰和体内血清转化gydF4y2Ba

Mccp蛋白质疫苗的数量,由冰,被用来评估接种动物的血清转化。体内血清转化使用选定的商业疫苗接种动物比较;疫苗编码P019和P137超过0.15毫克/毫升的特定Mccp蛋白质,而疫苗编码P135 P206显示缺乏Mccp蛋白质和冰。每组的血清样本收集动物疫苗接种前后(在不同天)在CCPP cELISA,测试和数据结果呈现在图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

灭活CCPP疫苗的质量控制是基于总蛋白质量化使用BCA量化方法,这并不是特定于感兴趣的蛋白质。因此,任何非特异性蛋白质从培养基中最终产品可以测量并给予准确的Mccp蛋白质水平。gydF4y2Ba

这种疫苗的质量评估是至关重要的批量发布并确保其有效性和批量一致性。改善我国疫苗的质量控制,冰是发现和开发的具体量化Mccp蛋白质性能疫苗。这冰是基于对Mccp使用马伯抗原产生的Mccp F-38疫苗株。之前的研究(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)使用相同的方法,开发了一个量化的冰乙型肝炎表面抗原(HBsAg)在乙型肝炎疫苗。冰是一个简化的过程,两层之间的抗原抗体的量(即。、捕获和检测抗体)。因此,抗原来衡量网站必须包含至少两个抗原与抗体结合的能力,至少从两个抗体的三明治。gydF4y2Ba

发展的冰,mba是为特定的相互作用对生成Mccp抗原的抗原表位。八马伯生成和评估设计冰。马伯的数量获得略高于那些报道(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。这些选择马伯基于光学密度在iELISA获得的抗原。三个马伯被选中作进一步评估。他们的选择标准是基于蛋白质的表达水平或在抗原表位和高免疫反应性示iELISA [gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

绑定比率代表了检测的抗原被捕获抗体水平。本研究表明,利用未标记的捕获抗体和HRP-labelled(检测抗体)马伯Mccp25提供了一个绑定),“碳足迹”(11倍比率高于所有其他马伯的组合。因此,检测蛋白似乎重复马伯Mccp25抗原表位,第一反应的无标号的马伯Mccp25目标蛋白质并不影响次级反应相同的HRP-labelled马伯Mccp25。gydF4y2Ba

未标记的和HRP-labelled马伯Mccp25;Ig G1类型被用来捕获和检测抗体,分别设计冰如前所报道(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。最少的目标蛋白检测的冰测试被设定为0.30gydF4y2BaµgydF4y2Ba克/毫升。与美国国税局内部标准曲线生成显示良好的蛋白质的量之间的相关性和OD的获得gydF4y2Ba值为0.9838。Mccp冰是由估计的可重复性的变异系数(CV)的测试执行内部测试(AU-PANVAC实验室)。数据显示6%的CV值表明良好的重复性之前报道的测定(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。的gydF4y2Ba相关性,测量蛋白质之间线性关系的强度测试和OD量产生的冰,也决定。七个重复量化进行了测试,gydF4y2Ba值在0.95和0.98之间,表明之间的良好关系的蛋白质在获得的冰和OD值进行测试。这类似于相关(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba报告(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba在基于蛋白ELISA)狂犬病疫苗效力试验。gydF4y2Ba

Mccp冰测试然后BCA法相比,目前我国疫苗用于质量评估。BCA的16个样品测试方法显示蛋白质浓度大于0.15毫克/毫升。这表明我国商业银行和实验性疫苗含有所需数量的蛋白质(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。然而,通过测试这些样品与新冰测试中,只有6个商业和两个实验疫苗显示浓度高于所需的蛋白质(0.150毫克/毫升)gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。这两个分析结果显示的差异蛋白质性能量化疫苗,它可以用这一事实来解释BCA法测量样品中总蛋白,而冰目标Mccp的特异性抗原。gydF4y2Ba

也发现冰测试无法检测和量化蛋白质与甲醛灭活Mccp。这表明靶蛋白可能是退化或构象的改变,可能影响抗原决定基受马伯可能发生(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

血清转化研究蛋白质之间的关系量化评估结果与冰和抗体生产。抗体检测是由商业c-ELISA (IDEEX),使用一个马伯Mccp-25马伯的不同。结果接种山羊的血清转化与冰的结果选择CCPP疫苗包含等于或大于0.15毫克/毫升的蛋白质数量。因此,本研究的结果表明,新开发的冰是特定于Mccp蛋白质和可以作为替代测试Mccp蛋白质性能量化疫苗。然而,使用这个冰应该进行进一步的研究来确定最少的Mccp抗原诱导产生抗体和相关程度的保护通过接种疫苗和挑战。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。gydF4y2Ba

伦理批准gydF4y2Ba

所有适用的国际、国家和机构的护理和使用指南动物被严格遵守。AU-PANVAC是非洲联盟委员会的专业技术机构与东道国协议与埃塞俄比亚联邦民主共和国政府。因此,所有实验室活动依法进行法律法规的埃塞俄比亚。动物操作下进行AU-PANVAC质量管理体系。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称他们没有利益冲突有关的出版。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项工作得到了潘非洲大学科学和技术研究所(PAUSTI)和非洲Union-Pan非洲动物疫苗中心(AU-PANVAC)。gydF4y2Ba