用重组外膜蛋白H对沼泽性水牛中的血液腐败性杂草的鼻内接种疫苗GydF4y2Ba

抽象的GydF4y2Ba

出血性败血症(Hemorrhagic septicemia, HS)是牛和水牛的一种重要传染病GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2BaB：2和E：2。基于鼻内重组的OMPH基疫苗已成功地用于保护前一项研究中的HS免受HS的乳制品。因此，本研究旨在探讨水牛之间该疫苗的保护能力。四组泰国沼泽水牛接受了不同的疫苗，被标记为100或200 μ.GydF4y2Bag的rOmpH与CpG-ODN2007、HS商品疫苗和未接种的对照组。采集血清和全血，分别采用间接ELISA法和MTT法检测抗体水平和细胞免疫反应。挑战暴露是有毒的GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba在实验的第72天2：菌株M-1404血清型B中。抗体滴度GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba免疫水牛显着高于对照组（GydF4y2Ba ），GydF4y2Ba特别是200 μ.GydF4y2Bag romph组。鼻内接种疫苗基团的刺激指数（Si）显示出比非累积群体显着更高（GydF4y2Ba ），GydF4y2Ba但与肌内商业HS疫苗不同。在非过型群体中挑战暴露后观察到临床症状和高烧，而200年之间未观察到 μ.GydF4y2BarOmpH的克免疫水牛。其他免疫组显示有短暂发热部分保护。总之，基于rOmpH-疫苗滴鼻可诱发保护能力并且诱发对强毒抗体和细胞介导的免疫反应GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba沼泽水牛中的应变。GydF4y2Ba

1.介绍GydF4y2Ba

出血性败血症(HS)是发生在热带地区的牛和水牛的一种急性和高度致命的全身性疾病，由特定血清型引起GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2BaB：2（亚洲血清型）和E：2（非洲血清型）[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba-GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］.牛和水牛的HS描述了各种临床迹象，主要是呼吸和消化道[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］.此外，还有证据表明在水牛的HS发病机制中涉及神经系统[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］.这种疾病的爆发导致肉类和奶制品相关行业的经济损失。在将经济与泰国在内的农业推动经济的国家，沼泽地是牲畜中的重要动物。提高沼泽水牛的主要原因：农业活动和保护。关于整个国家对水牛的人口统计数据，2018年泰国共有120万水牛[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］.HS是水牛的重要传染病之一，因为水牛对HS的疾病敏感的宿主比母牛更加疾病敏感的宿主[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］.水牛的HS死亡率也高于其他反刍动物。这种疾病的爆发导致肉类和奶制品相关行业的经济损失。因此，本地区需要对水牛进行适当的HS预防。GydF4y2Ba

已经开发了几种策略来控制包括疫苗的HS病。动物流行区域的HS疫苗是预防这种疾病的唯一实用方法[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］.HS疫苗的各种配方可用于治疗动物，包括灭活疫苗，活疫苗，纯化的荚膜提取物疫苗和组合疫苗[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba］.HS的肠外给药是一种油佐剂剂型，但在实际使用中不方便，可能引起动物应激[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.虽然几种常规疫苗配方是可商购的，但是对持久免疫力的适当宽泛保护的HS疫苗的任务是上升的[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］.到目前为止，各种现代化的疫苗，包括重组疫苗，已经发展成为兽用疫苗候选HS预防[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba］.外膜蛋白H (OmpH)是一种表面抗原GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba，被认为是免疫卟啉和潜在的靶标，成为国内动物疫苗候选的疫苗候选者[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba］.至于水牛和牛，每公斤三十七公斤GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2BaB:2血清型已被鉴定并被认为是一种高抗原蛋白[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba］.此外，还有的是，参与重组OmpH（rOmpH）的发展报告GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba菌株M-1404作为替代疫苗，并在接种乳制品犊牛中展示了对HS的足够的保护水平[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

通过鼻线疫苗接种疫苗接种被认为是一种非侵入性的管理方法，并且具有与传统方法相比的几个优势[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］.由于路线GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba感染水牛和黄牛主要是在上呼吸道，鼻腔内接种是对抗入侵的病原体适合防御机制[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］.本研究的目的是制备适当浓度的基于romph的鼻内疫苗，并确定对抗的保护能力GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba挑战水牛之间的曝光。此外，还通过间接的ELISA，淋巴细胞增殖和MTT测定研究了对基于romph的鼻内疫苗的抗体反应和淋巴细胞活化。GydF4y2Ba

2。材料和方法GydF4y2Ba

2.1。GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba应变和文化GydF4y2Ba

多杀性巴氏杆菌GydF4y2Bastrain M-1404 serotype B:2 was grown in the brain heart infusion broth (BHI broth; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) at 37°C for 6 h and was then cultured on brain heart infusion agar (BHA; Difco) at 37°C for 18 h. One single colony was selected for the preparation of bacterial suspension for challenge exposure [10.GydF4y2Ba］.根据先前用于ELISA检测的方法制备热提取物抗原[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

２.２.重组唔生产GydF4y2Ba

表达载体pQE-30包含GydF4y2BaOMPH.GydF4y2Ba基因的GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba菌株M-1404（Serovar B：2）（PQE-30 /GydF4y2BaOMPH.GydF4y2Ba） 在GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba应变M15构建并从先前的研究中获得[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]制备重组OMPH（romph）。GydF4y2Ba大肠杆菌GydF4y2Ba菌株M15含有pQE-30/GydF4y2BaOMPH.GydF4y2Ba载体在含100的选择性LB肉汤中培养 μ.GydF4y2BaG /ml氨苄青霉素和25GydF4y2Baμ.GydF4y2Bag / ml kanamycin（Sigma Aldrich，圣路易斯，Mo，USA）直到ODGydF4y2Ba_600GydF4y2Ba达到0.5，然后用于诱导重组蛋白生产用IPTG（异丙基GydF4y2BaβGydF4y2Ba-D-硫代半乳糖苷;Takara, Otsu, Japan) at a final concentration of 1 mM. The recombinant protein was purified by an electroelution method that was described previously [10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba］.使用BCA蛋白质测定套件（Pierce®，Rockford，IL，USA）在制造商的说明之后测量romph浓度。GydF4y2Ba

将洗脱的rOmpH调节到100 μ.GydF4y2Bag或200. μ.GydF4y2Bag蛋白/0.5 ml滴鼻rOmpH疫苗，按10GydF4y2Baμ.GydF4y2BaG胞嘧啶 - 磷酸喹啉寡核苷酸2007（CPG-ODN 2007; Invivogen，San Diego，CA，USA）（参见下一节）。GydF4y2Ba

２.３.实验动物GydF4y2Ba

在这项研究中，根据他们分配的四种类型的疫苗制剂分为4组，将二十四个中排名第4至6个月的沼泽水牛分为4组（GydF4y2BaN.GydF4y2Ba = 6 buffaloes in each group). The groups were labeled as 100 μ.GydF4y2Bag每个romph + cpg odn（第1组），200 μ.GydF4y2BaGeach rOmpH + CpG ODN (group 2), commercial HS vaccine (group 3), and nonvaccinated controls (group 4). The rOmpH vaccine in groups 1 and 2 were administered via intranasal route with 10 μ.GydF4y2Bag CpG ODN，第3组肌肉注射HS商品疫苗(见表1)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．最初的水牛在一支笔中被居住在一支笔中，每个兽医生物制剂局，畜牧业部，农业和合作社，泰国牧师，纳克·罗哈西米亚，泰国养殖部门的每组分隔的房间。水牛被筛选用于反GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba如前所述，间接ELISA检测血清B:2抗体[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba］.事先和确定挑战曝光以后，水牛在动物生物安全等级2隔离谷仓被安置在室内。该机构动物护理和使用委员会批准了这项研究（批准文号R19 / 2560）中所采用的所有做法。GydF4y2Ba

2.4。免疫和挑战暴露GydF4y2Ba

基于上述疫苗制剂分为四组水牛（GydF4y2BaN.GydF4y2Ba=每组6人)。分别于0、21、42天(组1、2)经鼻接种3次，间隔3周;或于0、30天(组3)经肌肉注射2次，间隔1个月(组3)。然后观察所有水牛在接种前和接种后阶段的临床体征和行为变化。分别在第0、7、28、35、49和63天获得所有水牛的血清。GydF4y2Ba

试验第72天，免疫和非免疫动物分别用10GydF4y2Ba^3.GydF4y2BaCFU /毫升GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba菌株M-1404通过鼻内路线[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.在挑战暴露后，所有的水流兽都被参加兽医观察到10天。通过使用常用的临床评估体系的主观和客观标准来进行兽医观察，使用常用的临床评估系统进行生命体征，抑郁症，食欲，呼吸志和直肠温度，如前所述[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba］.在实验结束时，或者如果实验终止，则用注射综合征™即用型注射（8.75mg / kg; Zoetis，Florham Park，NJ，USA）用可注射的Synulox™进行处理5天，并返回外部钢笔对于观察为10天。如果在实验组中似乎在实验组中发育的临床迹象，则终止实验。GydF4y2Ba

2.5。ELISA测试评估血清抗体GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba

热提取物抗原GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba使用先前描述的盐水提取方法制备菌株M-1404 [GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba］.血清测定抗GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba如下文所描述的，使用ELISA检测使用ELISA检测的菌株M-1404抗体。微量滴定板（Nunc-Immuno Plate Maxisorp，Moder，Roskildes，丹麦）涂有160个 μ.GydF4y2Ba在涂布缓冲液中稀释的G / ml热提取物抗原。在PBS + 1％脱脂乳中的热提取物抗原在1：100中制备各种测定的血清稀释液，其在已建立的稀释曲线的线性范围内。在1：2000稀释的辣根过氧化物酶 - 共轭山羊抗牛IgG（KPL，Gaithersburg，MD，USA）用作二抗，并使用四甲基苯胺（TMB; KPL）作为基质。通过加入50次停止颜色反应 μ.GydF4y2Bal of 3 M H_2GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba。使用自动板读取器（精度，Metertech，台北，台湾，ROC）在450nm的波长下读取每个孔的吸光度，结果表示为光密度（OD）。该间接ELISA的截止点设定为0.128 [GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba］.GydF4y2Ba

2.6。淋巴细胞增殖和MTT测定GydF4y2Ba

外周血单个核细胞(PBMCs)的制备方法如前所述略有修改[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba］.简而言之，从颈静脉中收集在肝素化管中的血液（10mL）。将血液样品用无菌PBS（pH7.2）稀释至最终体积为15ml，然后用10ml淋巴普肌（Stemcell）置出。将外周血单核细胞（PBMC）通过400×以400×离心以淋巴高层分离为薄层。 对于在25℃下30分钟。收集PBMC级分和红血细胞用在37℃的1×RBC裂解缓冲液5分钟。They were washed twice with RPMI-1640 medium by centrifugation at 700 × 在25°C下7分钟。然后将细胞粒料重悬于补充有抗生素 - 抗菌学（Invitrogen）和10％胎牛血清（FCS）（Invitrogen）的2ml RPMI-1640培养基，然后枚举细胞数。GydF4y2Ba

pbmc在2 × 10GydF4y2Ba^5.GydF4y2Ba细胞/孔转移到96孔微量滴定板上，重复三次，用5.0刺激GydF4y2Baμ.GydF4y2Ba克/毫升抗原M-1404的热提取物的最终浓度。培养基和10 μ.GydF4y2Bag/ml ConA (ConcanavalinA, C-2010, Sigma)作为对照。细胞在37°C含5% CO的环境中培养48小时GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba。使用3-（4,5-二甲基噻唑基-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）测定，这是基于四唑盐由活细胞的线粒体脱氢酶[裂解测定淋巴细胞增殖GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba］.孵化48小时后，10 μ.GydF4y2Ba每孔加入12 mM MTT溶液(Sigma-Aldrich)，在37℃下孵育3小时。孵育3小时后，100GydF4y2Baμ.GydF4y2Ba加入10% SDS，含0.01 M HCl, 37℃孵育3小时。用自动测板仪(AccuReader)在540 nm处读取吸光度，测量光密度(OD)。采用等效的增产井平均吸光度/介质井平均吸光度计算增产指数(SI)值。GydF4y2Ba

2.7。数据分析GydF4y2Ba

使用重复措施Anova试验进行疫苗基团与非过滤对照组之间的抗体滴度和Si值的统计分析。记录了重要性程度GydF4y2Ba 。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

3.1。免疫和GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba挑战曝光GydF4y2Ba

在挑战GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba菌株M-1404，所有实验动物已被观察到临床症状并在24小时内测量直肠温度。第4组中的所有水牛都显示出高直肠温度（104.0-105.0°F），临床符号包括暗示，在鼻内途径挑战后4至6小时在4至6小时内移动抑郁症。第4组发病率的百分之百挑战GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Bastrain M-1404 was reported within 24 h. Subsequently, the experiment in group 4 was terminated due to continually rectal temperature. On the other hand, the protective levels of 66.67%, 100%, and 83.33% were provided by 100 μ.GydF4y2Ba克rOmpH，200 μ.GydF4y2Bag rOmpH组和HS商品疫苗组均显示正常体温范围(99.0-102.0°F)，无HS临床症状(见表)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．然而，在这些组中，一些水牛表现出短暂的发烧(103-103.5°F)，但在挑战暴露后的第2天恢复到正常温度。GydF4y2Ba

3.2。针对HS疫苗抗体滴度测定GydF4y2Ba

泰国沼泽水牛中抗体滴度的水平显示在图中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba。在第0天在热提取物抗原对热提取物抗原的抗体滴度的水平表明低截止值为0.128。如图所示，在给予疫苗接种后第7天，在第1天，第2组和3组中的水平抗体水平在第7天凭经质升高。然而，发现第4组的非免疫水牛是对HS的疫苗，因为整个实验期间的平均抗体水平低于截止值。在1,2和3组中的平均抗体滴度水平持续升高，显着高于第4组的平均抗体水平（GydF4y2Ba )．GydF4y2BaOverview, a peak of antibody titer in all groups was found 2 weeks after initial and booster immunization. With regard to the route of vaccine administration, the average antibody titer levels of group 2 (200 μ.GydF4y2Ba在整个实验过程中，3组(HS商品疫苗，肌肉注射)水牛血清中rOmpH的水平无显著差异。GydF4y2Ba

3.3。使用MTT测定的细胞免疫应答GydF4y2Ba

在水牛细胞免疫应答显示于图GydF4y2Ba2GydF4y2Ba。刺激指数的截止值被指定为5个单位，并且对抗原的细胞免疫应答GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba第0天比在所有组的截止值。组1,2和3的响应增加，且刺激指数值比上天35与实验63的截止值。在组1,2老牛的刺激指数值，以及3均较组4中的水牛针对抗原显著更高（GydF4y2Ba )．GydF4y2Ba

4。讨论GydF4y2Ba

多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba是一种革兰氏阴性细菌，可在多重疾病中发挥作用[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba］.它引起出血性败血症，这种疾病通常在亚洲、非洲和欧洲的牛、水牛和野牛中发现[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba］.发生在水牛和牛的HS是由两种特定血清型之一引起的GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2BaB：2和E：2GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］.HS的牛和水牛的临床症状和病变主要描述的呼吸道和消化道由于细菌繁殖，发生在呼吸系统[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］.该疾病的爆发提供了严重的经济损失。因此，采用了几种策略来控制和保护这些动物，包括疫苗接种[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］.目前，使用的HS疫苗涉及灭活细菌或活病毒[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］.菌苗疫苗生产成本低廉，但往往容易引起副作用，并提供对异源血清型感染非常有限的保护。值得注意的是，高体温报道在肌内接种后常规途径[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］.该粘膜疫苗可以作为针对HS接种牛替代路线由于抵御感染的第一线GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba在粘膜表面[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.本研究提供了来自来自重组OMPH蛋白的鼻内疫苗接种的可能性GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba针对HS中具有较强的抗体反应和临床保护级别沼泽水牛。GydF4y2Ba

外膜蛋白H（OMPH）是一种主体膜蛋白在封套中GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba。的OmpHGydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Baserovar B:2 was identified as 37 kDa and acknowledged as an appropriate candidate for use as a vaccine against HS [2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba］.先前的一项研究报告了基于romph的鼻内疫苗，并显示了对奶牛场犊牛的保护能力[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.鼻内疫苗诱导明显高于肠胃外疫苗和减少临床症状的血清IgG和分泌IgA水平GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba挑战曝光[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.然而，目前还没有任何关于从rOmpH蛋白疫苗中分离出的疫苗获得保护的报道GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba在水牛，HS的疾病敏感宿主。因此，在该研究中开发并应用鼻内romph蛋白疫苗并应用于水牛。这可以允许研究人员和兽医替代传统疫苗，并将其用作目前正在使用的替代疫苗。GydF4y2Ba

IgG同型抗体在对抗病原微生物和揭示体液免疫反应方面起着重要作用[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba］.关于我们的结果，本研究中的抗体滴度谱与使用基于romph的鼻内疫苗的先前研究中的抗体曲线相似GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba奶牛场犊牛的挑战暴露[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.The antibody titer level was rapidly increasing within 2 weeks after booster. Regarding the formulation of the vaccine, the concentration of 100 μ.GydF4y2Ba在鼻内疫苗中的G romph提供比含有200的疫苗的较低的平均抗体水平 μ.GydF4y2BaG romph，表明本研究中配制的基于romph的鼻内疫苗是剂量依赖性。与先前的研究相比，发现乳制品小牛罗夫夫夫利人的有效浓度为50或100 μ.GydF4y2Bag每疫苗剂量[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba］.这可以通过观察宿主物种在接种疫苗后阶段的免疫反应来解释。在本研究中，CpG ODN被纳入鼻内疫苗，因为CpG被认为是鼻内蛋白质抗原的合适佐剂[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］.已发现CpG ODN佐剂可诱导Th1体液反应，并增加抗原特异性IgG (IFN-)的产生GydF4y2Baγ.GydF4y2Ba，和IL-2经由TLR9 [GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］.以前的研究证明了重组蛋白OmpH的发展GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba株A：3的CpG ODN疫苗制剂可强烈诱导IgG和血清IFN-GydF4y2Baγ.GydF4y2Ba在小鼠[GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba］.这可能解释了200诱导的IgG水平高而抗体效价无显著差异的原因GydF4y2Baμ.GydF4y2Ba与肌内细菌疫苗相比，G.MOP鼻内疫苗。比较地，这是GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba从先前的研究减毒活疫苗IgG抗体浓度显示显著上升肌内第二次疫苗接种后，而不是在鼻内接种小牛[GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba］.因此，该研究的结果支持OMPH作为潜在的免疫原性，CpG ODN发育鼻内接种疫苗以产生血清IgGGydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba在水牛。GydF4y2Ba

以临床体征和直肠温度监测为参数观察HS的发展。值得注意的是，本研究未免疫和免疫水牛的临床保护水平与抗体IgG水平相关。结果表明，第2组和第3组水牛免疫保护水平较高，抗体水平显著升高，分别达到100%(6/6)和83.33%(5/6)。然而，未接种的水牛在接种后发病率为100%GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba菌株M-1404具有不断高烧，抑郁症，厌食和食欲丧失，与非进入抗体相关，以及Si指数。兽医决定终止这种非免疫组的实验。从体渗出物样品中获得细菌培养物，以确保在实验终止后使用适当的处理策略。由于抗体在中和病毒和细菌毒素中起主要作用[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]，本研究结果支持在接种后阶段记录的抗体水平升高可能是宿主防御机制的优势，减少了挑战暴露后的临床体征表达。GydF4y2Ba

除了体液免疫应答外，还研究了细胞免疫应答。MTT测定用于测量细胞的活力，增殖和激活[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba］.有研究涉及到对OmpH的细胞免疫反应GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba在乳品牛犊和小鼠，表现出对免疫原的强的细胞反应[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba］.从MTT测定的结果表明，淋巴细胞活化参与针对HS接种，在以下组1,2接种水牛，和3（均鼻内rOmpH和肌内菌苗HS疫苗）比对照组更高显著显示。这种现象表明，细胞免疫响应的免疫原的疫苗中的存在和不断发展为一组存储器单元。然而，实验无法预测在体内条件的保护能力的程度。剂量的差异或疫苗给药途径没有表现出使用MTT测定细胞免疫应答显著差异。GydF4y2Ba

集体，200 μ.GydF4y2Ba本研究中rOmpH + CpG ODN制剂的抗体效价、SI指数和临床保护水平均较高。这一证据支持含200毫克的鼻内疫苗的保护能力GydF4y2Baμ.GydF4y2BaG romph，可以是兽医领域的水牛中的合适替代疫苗而不是传统的疫苗。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

本研究提供了初步实验和对随着基于romph的鼻内疫苗免疫的水牛免疫应答的初步实验和理解GydF4y2Ba多杀性巴氏杆菌GydF4y2Ba菌株血清型B：2感染。按照我们的研究，基于romph的鼻内疫苗能够诱导抗体反应和细胞反应，特别是200的浓度 μ.GydF4y2Ba克rOmpH。此外，接种了该菌株的水牛在接触该菌株后，其临床症状有所减少。数据显示，基于romph的鼻内疫苗可能是一种有趣的替代疫苗，以提高目前正在使用的疫苗的有效性和安全性，保护水牛免受HS疾病。为了充分研究基于romph的鼻内疫苗的能力，需要进一步研究配方、剂量、佐剂和疫苗频率的多样性。GydF4y2Ba

数据可用性GydF4y2Ba

用于支持发现的数据可以在合理的请求时从相应的作者获得。GydF4y2Ba

利益冲突GydF4y2Ba

作者声明他们没有利益冲突。GydF4y2Ba

致谢GydF4y2Ba

作者谨向泰国农业和合作部家畜发展司兽医生物制品局表示感谢。本研究由CMU中期职业研究奖学金计划资助(批准号:)。r0011399)及清迈大学兽医生物科学卓越中心(批准号:012/2562)。GydF4y2Ba

参考GydF4y2Ba

1. T. G. Wijewardana, C. F. Wilson, N. J. L. Gilmour, and I. R. Poxton， "小鼠单克隆抗体的生产GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2BaA型和保护性抗脂多糖抗体的免疫特性，“GydF4y2Ba医学微生物学杂志GydF4y2Ba，卷。33，不。4，第217-222，1990。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
2. R.Verma和T. N.Jaiswal，“出血性败血症疫苗”，GydF4y2Ba疫苗GydF4y2Ba，卷。16，不。11-12，第1184至1192年，1998年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
3. S. M. Dabo，J. D. Taylor，A.W.授予W.授予“巴斯特氏菌多达克牛呼吸道疾病”GydF4y2Ba动物健康研究评论GydF4y2Ba，卷。8，不。2，pp。129-150,2007。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
4. S. B. Shivachandra，K. N. Viswas和A. A.库马尔，“在黄牛和水牛出血性败血症的回顾，”GydF4y2Ba动物健康研究评论GydF4y2Ba，第12卷，第2期1，页67-82,2011。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
5. G. R. Carter和M. C. L. De Alwis，《出血性败血症》，刊于GydF4y2Ba巴氏菌和巴斯特脲症GydF4y2Ba，C. Adlam和J. M. Rutter，EDS。，PP。131-160，学术出版社，伦敦，英国，1989年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
6. A. D.Marza，F. F.F.A.Jesse，I. Ahmed等，“，神经系统遵循实验感染GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba布法罗有两家。GydF4y2Ba水牛GydF4y2Ba）：临床病理研究”GydF4y2Ba微生物发病机制GydF4y2Ba，卷。93，pp。111-119，2016。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
7. 办公室农业经济，GydF4y2Ba农业部和合作社GydF4y2Ba，泰国曼谷，2018。GydF4y2Ba
8. 国际兽疫局，“手册的的诊断试验和动物陆栖疫苗，”在GydF4y2Ba出血性败血病GydF4y2Ba， V. P. Singh, Ed.， 1125-1138页，OIE标准委员会出版物，巴黎，法国，2012。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
9. A. Benkirane和M. C. L.德Alwis，“出血性败血病，它的意义，预防和控制亚洲，”GydF4y2Baveterinarni medicinaGydF4y2Ba，第47卷，第47期。8，第234-240，2012。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
10. K. Muangthai，P. Tankaew，T. Varinrak等人，“鼻内免疫用重组外膜蛋白H基于出血性败血病疫苗在犊牛，”GydF4y2Ba兽医医学科学GydF4y2Ba，卷。80，不。1，pp。68-76,2018。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
11. H. Shams，“兽医疫苗学的最新发展”GydF4y2Ba兽医杂志GydF4y2Ba第170卷3，页289-299,2005。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
12. N. Sthitmatee，S. Numee，E.川本等人，“通过用重组黏着蛋白免疫接种保护从禽霍乱鸡GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba”,GydF4y2Ba疫苗GydF4y2Ba，卷。26，不。19，页。2398年至2407年，2008年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
13. A. Thanasarasakulpong，P.Poilperm，P. Tankaew，T. Sawada和N.Sthitmatee，通过免疫鼻内重组外膜蛋白H免疫，“GydF4y2Ba兽医医学科学GydF4y2Ba，卷。77，没有。3，pp。321-326,2015。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
14. T. Varinrak，P. Poolperm，T泽田和N. Sthitmatee，“通过免疫与基于rOmpH，滴鼻禽霍乱疫苗提供交叉保护，”GydF4y2Ba禽道疾GydF4y2Ba，卷。46，没有。5，第515-525，2017。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
15. P.POLPERM，N. Apinda，Y.KataOka等，“保护GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba通过卡其坎贝尔鸭的鼻内禽类霍乱疫苗GydF4y2Ba日本兽医研究GydF4y2Ba，卷。66，没有。4，pp。239-250,2018。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
16. J.C.Hodgson，A.Fiucane，M.P.Dagleish，S.Ataei，R. Parton和J.G.Coote，“犊牛接种患者对出血性败血症的疗效”GydF4y2BaaroAGydF4y2Ba衍生物GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2BaB：2由两种不同的行政路线，“GydF4y2Ba感染和免疫GydF4y2Ba，卷。73，没有。3，第1475-1481，2005年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
17. J. Lee，Y. B. Kim和M. Kwon，“外膜蛋白H.保护豁免GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba”,GydF4y2Ba微生物学杂志GydF4y2Ba第45卷第5期2，页179-184,2007。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
18. T. Hatfaludi，K.Al-Hasani，J. D. Boyce和B.Adler，“外膜蛋白GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba”,GydF4y2Ba兽医微生物学GydF4y2Ba，卷。144，没有。1-2，第1-17页，2010。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
19. H. Y. Tan，N.H.Nagoor，以及S. D.Sekaran，“37kDa外膜蛋白基因（OMPH）的克隆，表达和保护能力”GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba血清型B：2“，GydF4y2Ba热带生物医学GydF4y2Ba，卷。27，不。3，第430-441，2010。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
20. S. Kharb和S.查兰，“粘膜免疫提供了比对皮下免疫更好的保护GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba（B：2）用外膜蛋白预先用的小鼠，“GydF4y2Ba兽医研究通讯GydF4y2Ba，卷。35，不。7，pp。457-461，2011。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
21. P. Tankaew，W. Srisawat，T. Singhla等人，“两个间接ELISA包被抗原的用于检测奶牛的抗体针对比较GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba”,GydF4y2Ba微生物方法杂志GydF4y2Ba，卷。145，pp。20-27,2018。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
22. A. Thanasarasakulpong, P. Poolperm, W. Tangjitjaroen et al.，“比较两种纯化方法对重组外膜蛋白H免疫原性的影响GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba血清型答：1，”GydF4y2Ba兽医国际GydF4y2Ba，卷。2016年，第2579345号，7页，2016年。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
23. 美国乳品科学协会，GydF4y2Ba研究和教学中农业动物的护理和使用指南GydF4y2Ba，飞鹤乳业科学协会，芝加哥，伊利诺伊州，美国，第3版，2010。GydF4y2Ba
24. A.Böyum，“从人血中白细胞的分离。进一步观察。甲基纤维素，葡聚糖和聚蔗糖作为红细胞聚集剂”GydF4y2Ba斯堪的纳维亚临床与实验室调查杂志。补充GydF4y2Ba，卷。97，pp。31-50,1968。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
25. L. Lignitto，L.沓的Dalt，S.巴尔赞等人，“牛淋巴细胞的用途来评估天然提取物的免疫调节效应，”GydF4y2Ba意大利畜牧杂志GydF4y2Ba，第6卷，第440-442页，2007。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
26. I. W.Wilkie，M. Harper，J. D. Boyce和B. Adler，“GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba：疾病和发病机制，“GydF4y2Ba微生物学和免疫学的当前主题GydF4y2Ba，卷。361，pp。1-22,2012。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
27. H. Jamali，M. Rezagholipour，S.Praphah等，“流行，表征和抗生素抗性GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2Ba从牛呼吸道感染中分离出来的GydF4y2Ba兽医杂志GydF4y2Ba，卷。202，没有。2，pp。381-383,2014。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
28. H.L.Wigg，“体液免疫防御（抗体），”GydF4y2Ba美国胸部社会的诉讼程序GydF4y2Ba，第2卷，第2期5，页417-421,2005。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
29. F. nimmerjahn，“体内免疫球蛋白G活性的分子和细胞途径”GydF4y2Ba国际学术研究通知GydF4y2Ba文章编号524081,13页，2014。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
30. S.王，刘H.，X.张和F.钱，“鼻内和与基于蛋白质的抗原口服疫苗：优势，挑战和配方策略，”GydF4y2Ba蛋白质和细胞GydF4y2Ba，卷。7，pp。480-503,2015。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
31. K. M.丹尼斯D.柯里，一Gursel和D. Verthelyi，“寡核苷酸的CpG免疫佐剂的使用，”GydF4y2Ba免疫学检查GydF4y2Ba，卷。199，没有。1，pp。201-216，2004。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
32. O.塞泽尔，E.Özcengiz，I.Gürsel，和G.Özcengiz，“免疫原性和重组巴斯德氏脂蛋白Ë的保护效力和外膜蛋白H从多杀性巴氏杆菌一个：在小鼠3，”GydF4y2Ba兽医科学研究GydF4y2Ba，卷。93，没有。3，pp。1261-1265,2012。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
33. P. W.泰勒，“杀菌和抗革兰氏阴性菌血清的溶菌活性，”GydF4y2Ba微生物评论GydF4y2Ba，第47卷，第47期。1，第46-83页，1983。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
34. T. Mosmann，“用于细胞生长和存活的快速比色测定：适用于增殖和细胞毒性测定”，“GydF4y2Ba免疫学方法杂志GydF4y2Ba，卷。65，不。1-2，pp。55-63,1983。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
35. M. Boncler，M.Róžalski，U.Krajewska，A.Podsędek和C. Watala，饲养和MTT测定的细胞活力的比较评估植物内皮细胞植物提取物的抗增殖作用“GydF4y2Ba药理学和毒理学方法杂志GydF4y2Ba，卷。69，没有。1，pp。9-16,2014。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba出版商网站GydF4y2Ba|GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba
36. B. Kumar, V. K. Chaturvedi, S. R. Somrajan等，“纯化的天然OmpH蛋白的比较免疫应答来自GydF4y2Ba巴斯德菌multocidaGydF4y2BaP52和油助剂疫苗针对小鼠的出血性败血症疫苗，“GydF4y2Ba印度动物科学杂志GydF4y2Ba，卷。81，没有。12，PP。1193-1196，2011。GydF4y2Ba视图:GydF4y2Ba谷歌学术搜索GydF4y2Ba

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