and large intestines. The intestinal histomorphology was improved in all experimental groups by an increased villus height, VH : CD ration, colon crypt depth, and number of Ki-67+ epithelial cells. A higher number of goblet cells and their acidification were observed in group Pro, while the density of goblet cells was decreased by the herbs. Probiotics increased the number of intraepithelial lymphocytes (IELs), density of CD3+ cells in Peyer’s patches (PPs), and lamina propria (LP). In group H, a dual effect on the CD3+ cell distribution was observed. The herbs reduced the number of IELs and CD3+ in LP but increased the distribution of CD3+ cells in PPs. In the colon, herbs increased CD3+ cells in LP as well. It suggests that probiotics and herbs had influence on the intestinal histomorphology and the ability to modulate the mucosal immune system; however, the combination of probiotics and buckwheat bran was not so convincing, probably due to the inhibitory effect of the buckwheat bran on the probiotics used."> 益生菌和草药产品在仔猪肠道Histomorphological和免疫学的发展 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果

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兽医国际/2020年/文章

研究文章|开放获取

体积 2020年 |文章的ID 3461768 | 14 页面 | https://doi.org/10.1155/2020/3461768

益生菌和草药产品在仔猪肠道Histomorphological和免疫学的发展

Daiga Gāliņa,1 Līga Ansonska,2 和 安达Valdovska1

1拉脱维亚大学生命科学和技术,Lielā我2,Jelgava, lv - 3001,拉脱维亚

2食品安全研究所、动物健康和环境“BIOR”, Lejupes我3,Rīga, lv - 1076,拉脱维亚

学术编辑器:维托Laudadio
收到了 2019年12月19日
接受 2020年3月25日
发表 2020年4月24日

文摘

这项研究的目的是评估的影响益生菌和草药产品在仔猪肠道histomorphological和免疫学的发展。因此,枚小猪被分配在两星期4组:C(基底饮食),专业(基础饮食+益生菌),专业+ B(基底饮食+益生菌+荞麦麸)和H(草药粉)。后6周的实验,从每个实验组4只小猪被随机选中,在屠宰场屠宰。的组织样本和消化内容收集从空肠和结肠细菌,组织学和免疫组织化学检查。结果表明,益生菌的数量增加乳酸菌种虫害的小 和大肠。肠道组织形态学的改进 在所有实验组绒毛高度增加,VH: CD配给,结肠隐窝深度、和ki - 67的数量+上皮细胞。一个更高的数字 杯状细胞和酸化观察组Pro,杯状细胞密度降低时的草药。益生菌的增加 上皮内淋巴细胞的数量(IELs), CD3的密度+派尔集合淋巴结细胞补丁(PPs)和固有层(LP)。在H组,CD3的双重影响+观察细胞分布。草本植物减少 IELs和CD3的数量+在LP,但增加CD3的分布+在PPs细胞。在结肠、草药CD3增加+细胞在LP。它表明,益生菌和草药对肠道组织形态学的影响和调节粘膜免疫系统的能力;然而,益生菌和荞麦麸皮不那么令人信服,可能由于荞麦麸皮的益生菌的抑制作用。

1。介绍

断奶是一个关键时期的猪;从播种等因素分离,一个新的环境,改变饮食促进仔猪的生长产生负面影响。此外,集约农业的主导模式,小猪组的大小的增加,和有限的空间导致伤害和传播疾病的猪。这是一个巨大的挑战对胃肠道粘膜的免疫系统,在这种生活并不完全成熟时期的猪1]。此外,降低采食量影响消极取向和肠黏膜的形态学断奶时期(2]。这种情况下可能会增加抗菌素的必要性;然而,他们促进抗药细菌的传播3]。尽管使用抗生素作为饲料添加剂被禁止食用动物,抗生素耐药性是一个高优先级的欧盟的政策,和高水平的抵抗几个细菌物种仍在观察(4]。抗菌素耐药性是一个严重的全球威胁;因此补充替代饲料的发展是很重要的预防耐药细菌的选择和传播。

猪的胃肠道是一个非常重要的免疫主管机关。因此,免疫仔猪的发展可能是一个有效的干预针对不仅减少抗生素的使用,也提高生产性能和更高的回报率输入猪生产者(5]。胃肠道的成熟和免疫的发展取决于土著微生物群的组成(6]。肠道微生物群的一个不可或缺的角色介绍,培训,和宿主的免疫系统的功能,但是,另一方面,免疫系统必须保持主机与各种微生物的共生关系(7]。此外,微生物群可以影响肠道形态,改善肠道发展,健康,和功能(8]。据报道,可以影响肠道微生物群的饮食意味着使用不同饲料补充益生元、益生菌,草药产品(9]。

益生菌都进行了广泛的研究,和对仔猪的积极作用已经观察到:主导地位的增加健康的微生物群,减少脱落的病原体和疾病症状,促进消化能力,改善了肠组织的成熟和改进的免疫反应(9,10]。虽然益生菌的影响尚未普遍,有很多他们所依赖的因素,例如,使用微生物菌株的变异,剂量,治疗时间和饲养实践(5]。荞麦是一种重要的功能性食品。蛋白质尤其富含赖氨酸、精氨酸和天冬氨酸;除此之外,也富含许多稀有的组件,如黄酮、黄酮、植物甾醇,d-fagomine [11]。D-Fagomine eubiotic影响肠道菌群;它促进肠道微生物群的多样性(12]。来自植物的天然生物活性化合物有积极影响动物的生长和健康(13]。香草和他们的产品有抗菌、抗炎和抗氧化性能;他们促进消化和免疫;然而,他们的应用程序在饮食仍大多是基于他们的抗菌效果14]。车前草的药用价值已经众所周知的世界各地的数百年。大蕉含有黄酮类化合物、生物碱、萜类化合物、环烯醚萜苷(aucubin catalpol)、脂肪酸、酚酸、和维生素;几个研究表明,车前草在溃疡的管理具有重要作用,细菌和病毒感染、疼痛、炎症和腹泻(15]。荨麻中富含生物活性化合物和营养;其提取物能抑制促炎细胞因子生产,降低c反应蛋白水平,并增加超氧化物歧化酶,从而证明其抗炎和抗氧化作用[16]。圣约翰草的主要生物活性成分金丝桃素和hyperforin。这些生物活性化合物是众所周知的抗抑郁药,,此外,抗菌,抗病毒,抗炎作用也被观察到(17]。

益生菌和草本植物有很多积极的属性;他们可以很准,但它们的用法在猪的农业增长缓慢,主要是由于他们的变量的结果,可能的地方有些植物的刺激或他们的产品,和不清楚的方式行动。因此,本研究的目的是评估的影响益生菌和草药产品在仔猪肠道histomorphological和免疫学的发展。

2。材料和方法

2.1。饲料添加剂的制备

益生菌、草药粉,荞麦麸皮作为补充饲料。包含各种益生菌菌株的乳酸细菌和酵母是商用“ProbioHelp”(波罗的海益生菌、拉脱维亚)。荞麦(Fagopyrum esculentuml .)麦麸被选中在拉脱维亚一家有机农场。草药粉是由这篇文章的作者用荨麻叶(荨麻属dioical .)、大蕉(Plantago主要l .),开花的圣约翰麦芽汁(贯叶连翘l .)。收集2017年7月期间,植物在拉脱维亚Dobele和Livani地区,并且每个植物标本验证了园艺研究所拉脱维亚大学的生命科学和技术。植物干在室温阴凉,通风良好的空间和接地后由机械磨粉。

2.2。实验设计和样本收集

实验设计涉及44小猪(杜洛克猪×长白猪)在两周的年龄。小猪被分配在四组(11小猪笔),称为组C,职业,专业+ B,分别和H。控制(C组)收到了基底饮食,集团亲收到了基底饮食补充益生菌,和专业+ B组患者接受了基底饮食补充益生菌和荞麦麸皮,但H组收到基底的饮食补充了草药粉。益生菌的组合是一个除了小猪的饮用水根据年龄:2,3,5,6,7周大了浓度为1%,0.75%,0.45%,0.34%,和0.32%,分别;然而,荞麦麸皮和草药粉被包含在基底的饮食在恒定浓度的3%和1.5%,分别。所有的小猪有基底的饮食和水通过一个本地馈线和乳头爱好者。在实验的最后,从每个实验组4只小猪被随机选择和屠宰场屠宰。他们的组织样本(约1.5 - 2厘米)的近端空肠(20厘米回盲肠的褶皱(皱襞ileocaecalis))和结肠(近端部分结肠舌)收集。样本与冷生理盐水冲洗0.9% (w / v)和中性缓冲福尔马林固定在10%。相同的内容网站收集空肠和结肠的无菌容器和放在一个凉爽的盒子。内容样本送到实验室在2小时内细菌检查。

2.3。枚举的细菌

空肠和结肠的内容用于计数的决心肠杆菌科,大肠杆菌,乳酸菌spp。最初的和连续稀释在蛋白胨盐水稀释剂(最大恢复稀释剂,Biolife)根据ISO 6887 - 1:1999。的隔离和枚举肠杆菌科和大肠杆菌紫罗兰色胆汁葡萄糖琼脂(Biolife)和胰蛋白胨胆汁X-Gluc琼脂(Biolife)使用根据ISO 21528 - 2:2007和ISO 16649 - 2:2007,分别。的隔离和枚举乳酸菌spp。夫人琼脂渐变80 (Biolife)是根据制造商的说明用于这个媒介。菌落进行计算,并表示为日志10菌落每克消化内容。

2.4。幻灯片准备组织学和免疫组织化学

福尔马林固定的组织被削减,通过磁带。然后组织脱水在增加酒精的浓度的解决方案,嵌入在石蜡,并使用旋转式切片机切片。从每个样本,几个幻灯片准备,每个人都包含两个3μ米的部分。

2.5。肠道组织形态学分析

组织部分被苏木精和伊红染色(18]。之后,他们被光学显微镜分析(德国徕卡DM3000LED)和图像由相机拍摄(德国徕卡DFC450)。使用一个图像处理获得的图像处理和分析系统(徕卡应用程序套件,版本4.10.0)。形态学测量,绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度,绒毛高度隐窝深度比使用100 x放大进行了分析。总共十个以villus-crypt结构选择和测量每个样品一式三份。绒毛高度测量从地下室的口的绒毛。隐窝深度测量的最低点之间的凹入相邻的绒毛地穴的口和绒毛宽度在绒毛的中间。杯状细胞的总数在绒毛和地下室的结构计算,以及杯状细胞单位的绒毛高度和隐窝深度。组织病理学特性(等级的炎症,炎症细胞、寄生虫和细菌)为每个实验动物进行分析使用100 x - 1000 x放大。

2.6。中性和酸性粘蛋白染色

Periodic-Acid-Schiff (PAS)和阿尔新蓝(AB, pH值2.5)染色技术(18,19)被用于检测中性和酸性黏液分泌的杯状细胞,分别。粘蛋白分泌杯状细胞的总数统计,评估每组10绒毛和隐窝。粘蛋白分泌杯状细胞的密度计算的杯状细胞的数量/微米绒毛高度和隐窝深度。使用的分析,400 x放大。

2.7。免疫组织化学(包含IHC)

在包含IHC染色,特定的CD3抗体(Dako A0452)和ki - 67 (Dako、克隆MIB-1 IR621)被用于早期的识别和细胞增殖的标志,分别。短暂,部分被放置在包含IHC显微镜载玻片(APTACA, 1804532)和固定为1小时60°C。然后部分deparaffinised,水化,用去离子水冲洗。抗原表位被海尔缓冲检索(目标检索解决方案(10倍),pH值9日Dako, S2367)在微波(350 W-15分钟和750年若min)的沸点三次。内源性过氧化物酶活性与过氧化物酶阻断剂被孵化10分钟(双内源性酶块,Dako SM801),紧随其后的是冲洗TBS缓冲区(清洗缓冲20 x, Dako)。主要的CD3抗体和ki - 67被添加和孵化了60分钟。CD3抗体的稀释1:添加了200年,但ki - 67是可以使用了。孵化后,主要的抗体被TSB冲洗缓冲(清洗缓冲20 x、Dako K8000),及其与合绑定检测系统(想象™+双链接System-HRP(民建联+),Dako, K8010)。部分是孵化为45分钟,冲洗TBS缓冲区(清洗缓冲10 x、Dako K8000)。Diaminobenzidine(民建联+ Dako K8010)添加可视化的光学显微镜的褐色反应积极的结构。 Finally, the sections were counterstained with haematoxylin and mounted with a coverslip. For analysing IHC, 100–400x magnification was used. The numbers of proliferating epithelial cells (Ki-67+)和上皮内T细胞(CD3+)在地下室计算和绒毛,分别表示为每100人阳性细胞的数量μm。CD3的相对频率+分析了细胞在固有层(每个区域独立的隐窝和绒毛)空肠和结肠,在派尔集合淋巴结补丁(每个区域独立intrafollicular和圆顶+ folicullar)和结肠黏膜下层。10个随机选择的视觉领域对每个样本进行分析。

2.8。统计分析

R工作室软件(版本0.99.489)是用于统计分析。治疗细菌群体和组织形态学的影响分析了仔猪空肠和结肠的单向方差分析;邓肯的多个范围测试被用于事后鉴定治疗组之间的显著差异。CD3的相对频率+细胞决定根据半定量的计算方法(20.]。积极的相对频率结构视图中的字段标记如下:(0)-不,(0 / +)偶尔,(+)很少,(+ / + +)很少适量,(+ +)——适度,(+ + / + + +)——温和许多数量,和(+ + +)化为乌有;获得的数据转换为等级0,1,2,3,4,5,6,统计分析,分别。克鲁斯卡尔-沃利斯H测试和Conover-Iman事后测试被用于非参数方差分析。结果表示为均值±SEM。被认为是在统计意义 。的值 据报道倾向。Microsoft Excel 2016版本(16.0.4266.1001)是用于数据的可视化表示。

3所示。结果

3.1。肠道菌群

的饮食补充益生菌的数量增加乳酸菌种虫害的空肠 和结肠癌,而组C和h .草药的趋势 减少的数量肠杆菌科在结肠。的数量大肠杆菌在H组低,但差异不显著(表吗1)。
网站和微生物群(log10 cfu·g−1) 集团 价值
C 箴 箴+ B H
空肠
肠杆菌科 5.29±2.690 3.92±0.563 3.04±0.850 2.99±0.671 0.4703
大肠杆菌 4.74±2.210 3.54±0.457 3.96±0.826 2.99±0.670 0.5938
乳酸菌spp。 6.27±0.815b 7.75±0.242一个 6.62±0.140ab 5.98±0.511b 0.0354
结肠
肠杆菌科 5.80±0.804x 5.57±0.290xy 4.00±1.043xy 3.55±0.279y 0.0937
大肠杆菌 4.86±0.613 5.21±0.256 3.88±0.989 3.51±0.293 0.2136
乳酸菌spp。 6.48±0.265y 7.99±0.031x 7.12±0.417xy 7.12±0.375xy 0.0842
扫描电镜:标准测量误差。a、b行中的平均值与不同的上标字母是明显不同的 。 x, y行中的平均值与不同的上标表示倾向于区别组为0.05 < < 0.10。
表1
益生菌和草药产品对肠道菌群的影响(均值±SEM)。
3.2。肠组织病理学

在所有实验小组的小猪,最小的轻度慢性弥漫性小肠结肠炎被发现与最小轻度炎症细胞的浸润,主要包括淋巴细胞和浆细胞(图1 (b))。此外,在空肠,温和的嗜酸性粒细胞的浸润白细胞被发现,但在单独的结肠隐窝最小观察嗜中性白细胞的浸润。嗜曙红细胞白细胞多位于固有层(LP)内隐窝的一部分,观察稍微补充组。在所有组,一些绒毛被钝化,融合以最小的上皮中度脱屑。此外,观察轻度脱屑表面部分结肠粘膜的全部实验小组。在空肠,少量的细菌检测表面的绒毛组织,但细菌的存在在隐窝观察组Pro和Pro + B。同样,在结肠内,最小的温和量子的细菌表面观察粘液(图1(一)),而在隐窝,再一次,这只观察组Pro和Pro + B。所有实验的团体,在一些结肠隐窝,有一个最小的隐孢子虫的入侵,稍微一组H和C,但实验组之间没有显著差异被发现。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
空肠和结肠组织学特性的小猪:苏木精和伊红技术。(一)结肠部分展示了最小数量的细菌粘膜表面,1000 x放大。(b)结肠部分显示轻微的炎症细胞浸润固有层,主要包括淋巴细胞和浆细胞,400 x放大。
3.3。Histomorphological测量肠

基底饮食与草药补充,益生菌,它们的结合荞麦麸绒毛高度增加组H (+ 35%, ),箴(+ 17%, ),和专业+ B (+ 12%, )相比,C组绒毛宽度在C组降低 而所有的补充组。在空肠,补充饲料添加剂对隐窝深度无显著影响。隐窝深度的绒毛高度(VH: CD)比例增加 在H组,Pro和Pro + B与对照组相比。在结肠隐窝深度被观察到更高 H组Pro,箴+ B, C组相比(表2)。
项 集团 价值
C 箴 箴+ B H
空肠
绒毛高度(μ米) 357.37±23.433c 416.87±9.805b 400.79±8.870b 482.87±14.956一个 < 0.0001
绒毛宽度(μ米) 146.75±6.597b 176.83±6.555一个 168.64±5.504一个 168.32±5.672一个 0.0310
隐窝深度(μ米) 327.16±21.484 306.03±6.947 299.02±7.942 290.51±9.614 0.1625
VH: CD比 1.12±0.051c 1.39±0.042b 1.38±0.049b 1.72±0.068一个 < 0.0001
结肠
隐窝深度(μ米) 461.31±7.007c 533.98±10.857一个 525.90±12.819ab 498.58±5.692b 0.0002
扫描电镜:标准测量误差,VH:绒毛高度、CD:隐窝深度。a、b平均值在一排不同的上标字母是明显不同的 。
表2
益生菌的影响和草药产品在仔猪肠道形态学(均值±SEM)。
3.4。杯状细胞及其分泌黏蛋白

在空肠绒毛,杯状细胞的低密度在H组观察到 ,在杯状细胞的总数并没有受到影响。相比之下,在殖民隐窝,杯状细胞的总数是高组收到了益生菌,但并不影响杯状细胞的密度(表3)。
杯状细胞 集团 价值
C 箴 箴+ B H
空肠
n /绒毛 9.05±0.809 10.88±0.714 9.98±0.481 9.55±0.491 0.2330
GC /单元高度(μ米) 0.03±0.004一个 0.03±0.002一个 0.03±0.001一个 0.02±0.001b 0.0042
n /地下室 21.55±1.550 23.43±1.138 22.08±0.966 20.75±0.699 0.2761
GC /单元深度(μ米) 0.07±0.007 0.08±0.004 0.08±0.004 0.08±0.003 0.8101
结肠
n /地下室 34.90±1.610b 38.38±1.118一个 35.30±1.222ab 34.35±0.660b 0.0394
GC /单元深度(μ米) 0.08±0.004 0.07±0.002 0.07±0.002 0.07±0.003 0.2751
GC:杯状细胞,SEM:标准误差的测量。a、b平均值在一排不同的上标字母是明显不同的 。 杯状细胞数量单位绒毛高度、隐窝深度。
表3
总数量和密度的均值±SEM在仔猪的肠道杯状细胞。

在空肠,基底饮食中包含益生菌增加 AB的总数+杯状细胞的绒毛和隐窝,但是草本植物降低了 AB的密度+绒毛的杯状细胞。在结肠,不是的总数+杯状细胞在C组 减少,但AB的总数+杯状细胞是高组Pro (表4和数字2(一个)和2 (b))。
参数 C 箴 箴+ B H 价值
绒毛(空肠)
作为+n /绒毛 8.30±0.645 9.63±0.685 9.48±0.510 10.00±0.621 0.4221
不是+GC /单元高度(μ米) 0.03±0.003 0.02±0.001 0.02±0.001 0.02±0.001 0.2158
AB+n /绒毛 8.05±0.720b 10.78±0.686一个 9.45±0.556ab 8.37±0.512b 0.0116
AB+GC /单元高度(μ米) 0.02±0.003一个 0.03±0.002一个 0.02±0.001一个 0.02±0.002b 0.0004
crypt(空肠)
不是+n /地下室 20.30±1.244 21.98±0.708 21.83±0.697 21.53±0.617 0.5588
不是+GC /单元深度(μ米) 0.07±0.006 0.07±0.003 0.08±0.004 0.08±0.003 0.3131
AB+n /地下室 21.10±0.932ab 22.53±1.005一个 20.38±0.690ab 19.13±0.687b 0.0240
AB+GC /单元深度(μ米) 0.07±0.005 0.08±0.004 0.07±0.003 0.68±0.003 0.2604
Crypt(结肠)
不是+n /地下室 29.35±1.091b 35.60±1.182一个 36.15±1.057一个 34.30±1.450一个 0.0082
不是+GC /单元深度(μ米) 0.06±0.003 0.07±0.002 0.07±0.002 0.07±0.005 0.4529
AB+n /地下室 31.20±1.423y 35.78±0.655x 34.80±1.181xy 33.48±1.312xy 0.0841
AB+GC /单元深度(μ米) 0.07±0.004 0.07±0.002 0.07±0.003 0.07±0.003 0.9939
不是+:定期Acid-Schiff阳性细胞,AB+:阿尔新蓝阳性细胞,GC:杯状细胞,SEM:标准误差的测量。a、b平均值在一排不同的上标字母是明显不同的 。 x, y行中的平均值与不同的上标表示倾向于区别组为0.05 < < 0.10。 杯状细胞数量单位绒毛高度、隐窝深度。
表4
总数量和密度的均值±SEM不是+和AB型+杯状细胞在仔猪的小肠。
(一)
(一)
(b)
(b)
图2
杯状细胞空肠的小猪,400 x放大。(一)Periodic-Acid-Schiff技术,用红色阳性细胞。(b)阿尔新蓝技术,阳性细胞在蓝色(pH值2.5)。
3.5。免疫组织化学分析细胞增殖和浸润的淋巴细胞

ki - 67+细胞主要在空肠隐窝和派尔集合淋巴结生发中心的补丁(PPs),但在结肠ki - 67+隐窝细胞主导的更深的地方。在空肠和结肠,很少到中度ki - 67阳性细胞的表达被另外的炎症细胞在LP。在空肠,所有的补充组 有较高的ki - 67 +肠上皮细胞与对照组相比,但在结肠,观察肠上皮细胞增殖的显著影响组织专业+ B和H(图3)。


图3
ki - 67积极空肠和结肠隐窝上皮细胞。(a, b)平均值与不同字母明显不同(P< 0.05)。误差显示测量值的标准误差(10个随机选择的视觉领域从每组4只小猪(n= 16))。

的CD3+在小肠细胞发现变量。考虑补充组之间的差异,在空肠上皮内CD3的总数+细胞是高(p < 0.05)在职业组,但在结肠- B组Pro,箴andH,而C组(图4)。许多大量的CD3+细胞中观察到的intrafollicular区PPs(图5)。中度到无数的CD3+细胞中观察到的LP空肠绒毛和结肠隐窝(图6)。数量的CD3+细胞在圆顶地区被划分为几个温和,但它是罕见的在PPs的生发中心(图7(b))。


图4
上皮内(IE) CD3的数量+T细胞在空肠和结肠。a、b平均值与不同的字母是明显不同的 。误差显示测量值的标准误差(10个随机选择的视觉领域从每组4只小猪(n= 16))。

图5
CD3的相对频率+派尔集合淋巴结细胞补丁空肠和结肠黏膜下层的政府的草本植物,益生菌和益生菌结合荞麦麸皮。a、b平均值与不同的字母是明显不同的 。误差显示测量值的标准误差(10个随机选择的视觉领域从每组4只小猪(n= 16))。

图6
CD3的相对频率+细胞固有层(LP)的政府空肠和结肠的草本植物,益生菌和益生菌结合荞麦麸皮。a、b平均值与不同的字母是明显不同的 。误差显示测量值的标准误差(10个随机选择的视觉领域从每组4只小猪(n= 16))。
(一)
(一)
(b)
(b)
图7
包含IHC。(一)增生的上皮细胞(ki - 67+细胞)在空肠的隐窝,200 x放大。(b) CD3+T细胞在不同部分空肠。F:滤泡区;D:圆顶;仪表:intrafollicular区;LP:固有层;100 x放大。

在PPs,益生菌和草药CD3的相对频率增加+细胞 intrafollicular区和圆顶+滤泡区。没有观察到CD3的分布差异+细胞在结肠黏膜下层(图5)。团体Pro和Pro + B增加 CD3的相对频率+细胞在LP的绒毛。组织专业,专业+ B和H增加 CD3的分布+细胞在结肠LP(图6)。IHC阳性细胞(ki - 67+和CD3+)是显示在图7(一)和7 (b)。

4所示。讨论

肠道上皮细胞和免疫细胞与黏液层提供第一屏障对土著微生物群,病原体,和外部的抗原。土著微生物群与粘液防止殖民病原体通过占据空利基市场,刺激粘膜防御机制,保持体内平衡的免疫反应(21]。断奶的小猪是一个非常关键的时期;它会导致失衡的微生物群和肠粘膜屏障功能障碍,导致肠道炎症和腹泻(22]。

小猪的主要条件,健康是一个健康的肠道菌群。肠道菌群有几个非常重要的角色,例如,参与消化,发酵的碳水化合物,促进成熟的肠道粘膜,保护病原体,生产的维生素和参与感应,和培训和功能的免疫反应23]。我们的研究结果表明,益生菌的数量增加乳酸菌种虫害在小肠和大肠。益生菌的能力增加的计数乳酸菌种虫害在小猪已经被很好地记录下来了5]。益生菌和荞麦麸略微下降的计数肠杆菌科和计数增加乳酸菌种虫害,但没有达到同等水平乳酸菌种虫害是观察当只使用益生菌。一些作者已经证实,荞麦具有益生元的活动(24,25),可改善肠道菌群通过增加乳酸菌计数,计数的下降肠杆菌科(24),大肠杆菌(9,26]。一方面,计数的肠杆菌科可能减少由于醋酸盐、乳酸和乳酸菌产生的细菌素(27]。另一方面,荞麦麸皮,种子层包含一个高含量和酚醛树脂的多样性,如表儿茶素、原花青素B2,表儿茶素没食子酸盐,芸香苷、儿茶素,isovitexin, hyperoside, isoquercetin [28与抗菌活性[]29日,30.]。因此,可能,抗菌活性的荞麦麸皮不仅旨在减少肠杆菌科但也可能影响的活动补充益生菌,防止增加的数量Lactobacilluspp。在我们的研究中,所选的植物组合是专注于数的减少肠杆菌科的数量没有显著影响乳酸菌spp。许多草药有抗菌活性,鼓励他们作为替代抗生素对仔猪的饮食(14]。革兰氏阳性细菌的结构虽然负责的事实,他们更敏感,大多数中药的抗菌活性,土著微生物群使用pili细胞外基质蛋白质结合形成生物膜,使其抗宿主生物体(14,31日]。因此,荨麻的组合、车前草、圣约翰麦芽汁能够成功调制的肠道微生物群,目的是减少pathobionts的数量,而不影响土著微生物群。

在组织病理学检查,最小轻度慢性弥漫性观察小肠结肠炎实验团体的小猪。饮食和环境因素的变化,断奶引起显著的形态和功能改变在胃肠道,称为weaning-associated肠道炎症。在断奶期间,小猪有慢性肠炎特征与多种炎症细胞,特别是LP(单核细胞浸润32,33]。本研究研究的作者观察嗜曙红细胞白细胞浸润在LP,虽然在小肠寄生虫的存在并没有检测到。据报道在嗜酸性粒细胞的浸润特性观察健康猪没有寄生虫感染(34]。不仅研究发现,嗜酸性粒细胞炎症效应细胞的重要组成部分的寄生虫感染或过敏但也可以作为免疫调节细胞(35]。反过来,嗜中性粒细胞的浸润白细胞在一些结肠隐窝与轻度入侵隐孢子虫(36]。组织病理学结果显示细菌传播表面粘液和隐窝。一些作者坚持认为肠道菌群形成生物膜上面的粘液外层在正常情况下37]。断奶后低采食量和肠内营养的缺乏引起急性肠道生理变化和影响土著微生物群(38]。因此,生物膜的碎片和pathobionts穿过粘液屏障和坚持上皮细胞,通过细胞paracellularly把。Pathobionts激活宿主免疫和引起炎症37]。然而,可能有另一种解释为隐窝里的细菌的存在。一些作者指出,一些细菌,包括乳酸菌spp,能够幸存的接近甚至在绒毛和隐窝上皮表面。细菌的存在在这些特定的利基市场可能是至关重要的,最初的细菌社区在肠道内腔环境挑战31日]。在小猪收到益生菌,细菌的最低温和的位置经常观察隐窝。由于益生菌的主要成分是不同种类的乳酸菌的原因,可能是益生菌能够促进有益微生物群的附件这些特定的利基市场。作为实验组之间没有明显的组织病理学观察发现,最小的在所有组轻度慢性弥漫性小肠结肠炎肠成熟可能是一个合乎逻辑的步骤,由新的饮食和环境造成的。

小肠组织形态学参数,如绒毛高度、隐窝深度,和他们比,是重要的肠道健康状况的各种指标39]。更高的绒毛确保更大的肠上皮细胞计数,这就增加了表面积,促进一些积极影响:更高的酶生产、吸收面积,增加和改善营养运输系统(40]。隐窝上皮干细胞的位置,负责上皮细胞的增殖。肠上皮细胞的增殖和分化提供覆盖和绒毛的增长;此外,他们在当地发挥关键作用,系统性免疫反应(41,42]。VH: CD比通常用于目标措施的组织学变化。更高的VH: CD比被认为主要是积极的,因为一个吸收表面增加和组织流失率减少(43]。我们的研究表明,包括基底的草药饮食增加了绒毛高度和VH: CD率。其他研究人员报道,类似于我们的结果对有益的药草在仔猪肠道组织形态学的影响(8)和家禽(44]。植物或精油在肠道组织形态学的影响主要是由于减少肠道细菌负荷(45]。除了积极作用的草本植物小肠绒毛高度和VH: CD比,我们还观察到更大的绒毛的宽度。Windisch et al。46]假定草本精油可以双重起源于植物的作用:一方面,他们能够减少病原体的压力,从而改善肠道表面积;另一方面,大多数精油会刺激肠道组织,因此,可以减少小肠表面积。基底的益生菌补充饮食改善了绒毛高度和增加了VH: CD率,从而积极影响小肠的发展形态。益生菌的有益作用可以导致肠道殖民化的利基市场,从而减少病原体的计数。减少毒性和提高养分吸收有助于增长和恢复的绒毛47]。在空肠,隐窝深度不受饲料补充;然而,更高密度的kfi - 67+肠上皮细胞中观察到的所有补充组。(低聚糖喂食后也观察到类似的结果48]。反过来,深隐窝在结肠组织形态学观察所有补充群体。基于荞麦和草本植物多糖表现出生命起源以前的属性(23,49),乳酸菌利用SCFAs,尤其是乙酸,丙酸,丁酸盐,是一种重要的能源增长colonocytes [50]。此外,丁酸盐是一个活跃的抑制剂的炎症和刺激粘膜的再生(51]。

小肠和大肠有特殊细胞,杯状细胞。他们分泌大量糖蛋白形成黏液层和上皮细胞。有一个单一的黏液层在小肠和大肠有两层系统;此外,内部致密,几乎无菌,外层是宽松,使生态系统的共生的细菌(52]。这是第一前线天生的宿主防御外生和内生刺激物和微生物粘附和入侵,但是,与此同时,它允许交换的水,气体,和营养53]。黏蛋白分为中性和酸性亚型。寡糖链中性粘蛋白含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖,而酸性粘蛋白通常涉及两组唾液酸和硫酸酸,和最终的分类决定了组织(主要54]。酸性和中性黏蛋白增加粘度上皮黏液层的保护,而酸性黏蛋白防止细菌易位(55]。我们发现益生菌增加大肠的杯状细胞的数量和影响其分化增加酸粘蛋白生产的小肠和大肠。益生菌的能力来影响杯状细胞的增殖和分化之前已经报道过了。在无菌鼠,杯状细胞的计数在小肠conventionalisation后增加了粪便微生物群(56]。挑战与产肠毒素的大肠杆菌(ETEC)在仔猪肠道杯状细胞的数量减少,但增加在口头接受中等剂量的小猪芽孢杆菌益生菌混合物作为预处理,在挑战面前ETEC [57]。growing-finishing猪,益生菌增加杯状细胞的数量在所有检查肠道隐窝;此外,酸性的增加在十二指肠生产杯状细胞和结肠癌是观察到的58]。一些科学家试图解释微生物群和益生菌可以改变粘蛋白的杯状细胞增殖,促进酸化。细菌在粘液和使用粘蛋白分子的碳、氮、和能源59]。他们释放黏液发酵的产物,不同的分泌代谢物,生物活性因子,激活不同的信号级联,杯状细胞分泌的元素和影响。例如,在最近几年,科学家们关注微生物群释放蛋白水解酶的作用,meprinβ锚定在肠上皮细胞的顶端膜。Meprinβ后扩散到粘液,它劈开和杯状细胞的释放MUC2附件(60]。此外,细菌结构元素,如脂多糖(LPS),鞭毛蛋白,和lioteichoic酸(LTA),或几个代谢物(SCFA,三磷酸腺苷)能够对宿主免疫应答的调节粘蛋白基因表达的影响。(61年]。例如,γδT细胞有重要作用调节肠道黏液层影响杯状细胞功能和粘蛋白的表达。因此,减少数γδT细胞负责的杯状细胞计数下降,减少粘蛋白含有唾液酸(62年]。我们的研究结果表明,益生菌的数量增加小肠上皮内淋巴细胞(IELs)。猪,IELs属于δγT细胞群(63年]。益生菌的结构元素(有限合伙人,LTA)是重要的刺激器先天和适应性免疫(61年),可能负责一个IELs数量的增加。因此,高数量的杯状细胞和粘液的酸化可以解释为益生菌的免疫刺激性影响使用;然而,与此同时,益生菌在杯状细胞的直接作用不应被排除在外。增加杯状细胞数和调制的影响粘蛋白通过结合使用荞麦麸皮和益生菌不那么令人信服而单独使用益生菌。这可能是由于荞麦麸皮使用的益生菌的抑制效果。草药杯状细胞密度降低;此外,酸性和中性粘蛋白生产杯状细胞减少小肠。目前,还没有报告直接影响植物的杯状细胞的数量;然而,一个较低的微生物群负载降低杯状细胞的数量和他们的大小64年]。草药研究广泛的抗菌活性;尽管数据是多方面的,其中大部分是认识到对大肠杆菌群抑制作用,大肠杆菌和Chlostridium perfringens(45]。基于我们之前的研究,我们国家这草药混合物的数降低肠杆菌科和大肠杆菌仔猪的断奶期(26]。据推测,我们的草药混合物的密度的影响杯状细胞也可能被解释成其抗菌活性。此外,稍微降低小肠的IELs水平表明免疫细胞由草本植物的抑制作用。粘膜免疫的抑制可能也是一个原因减少数量的杯状细胞和粘液素的生产。

基于包含IHC结果我们的研究,我们可以,益生菌增加上皮细胞的增殖(ki - 67+)在小肠隐窝和药草和益生菌和荞麦麸增加扩散在小肠和大肠。一些作者已经观察到益生菌可以破坏肠上皮细胞与基底膜之间的相互作用,增加增殖在隐窝肠上皮细胞,导致的增加的速度重新在小肠上皮细胞。此外,还有一个概率,一些益生菌菌株可能增加细胞增殖的效果与肠道干细胞(交互65年]。最近的研究报告强调了乳酸的关键作用肠道干细胞的发展。肠道干细胞的增殖乳酸绑定后刺激受体Gpr81造成Wnt /β连环蛋白的信号Paneth和肠间质细胞(66年]。比较、管理益生菌单独或结合荞麦麸皮,表明,这种组合显著增加上皮细胞增殖不仅在空肠结肠。荞麦麸皮纤维的重要来源(67年]。膳食纤维可以改变的微生物种群和影响生产SCFA猪模型。然而,主要生产商SCFAs土著微生物群专性厌氧菌。大多数益生菌间接增加SCFAs。的近端部分大肠,乳酸细菌,产生乳酸,这是一个的基质生产醋酸、丙酸和丁酸由几个SCFA-producing土著细菌(68年,69年]。SCFAs沉浸在结肠的粘膜上皮细胞作为燃料(70年]。它表明,额外的纤维纳入猪饮食增加了乳酸的生产和SCFAs,从而增加colonocytes扩散。有趣的是,最多的上皮细胞增殖后观察到的草药。一些研究报告指出,草药提取物能够影响细胞增殖和分化。的多糖和hyperforinHipericum叶连翘诱发和刺激角质细胞的分化在活的有机体内和在体外(71年,72年]。黄芪多糖刺激细胞增殖、迁移和分化的肠上皮细胞(11]。考虑的重要作用SCFAs改善肠道的生理和形态参数,几则报道关于草药的影响在肠道SCFAs生产。草本植物包含许多苷和碳水化合物,可以生产的衬底SCFAs [73年]。多糖的Plantago asiaticaL种子显著增加总短链脂肪酸和丙的浓度和丁酸的老鼠74年]。基于前面的报告和我们的研究,我们的研究表明,肠道上皮细胞的扩散主要是微生物代谢产物的影响,但这并不排除直接某些生物活性成分对细胞增殖的影响,尤其是当管理草药。因此,草药的化合物,尤其是多糖,是一个重要的步骤来了解草药的机制。

的另一个重要部分肠道屏障的粘膜免疫系统保护宿主对病原体的胃肠道通过使用内脏相关淋巴组织(GALT)。它形成的最大的部分身体免疫组织(75年),包括组织(肠系膜淋巴结,派尔集合淋巴结补丁(PPs)和免疫细胞分散在LP)和上皮细胞称为IELs [76年]。一直特别注意T细胞的分布。T细胞发挥关键作用提供肠道内稳态和激活免疫反应的病原体(77年]。我们观察到,益生菌在PPs增加T细胞的分布,LP, IELs。在无菌动物的研究,证明微生物群中扮演主要角色在发展中宿主的免疫系统。在无菌动物,PPs已经降低,T细胞的一个重要不足。此外,减少数量的免疫细胞中观察到的组织(78年]。有几种免疫调节器与微生物群,其中最重要的toll样受体和SCFAs79年]。益生菌的能力增加频率的T细胞在PPs报道之前,但效应之间的平衡和调节性T细胞是没有改变80年]。在我们的研究中,益生菌增加T细胞分布不仅在intrafollicular区(T细胞区)的PPs还在圆顶和B细胞滤泡区。独特的子集的CD4 T细胞位于:卵泡调节性T细胞(Tfr)和卵泡辅助T细胞(Tfh)。Tfh生发中心的形成中扮演了重要的角色(GCs);它促进分化的B细胞浆和记忆B细胞(81年),而总生育率抑制体液免疫(82年]。更详细的研究Tfh和总和生育率需要分配比估计益生菌影响体液免疫的能力。然而,以前的研究已经指出,益生菌在PPs增加IgA阳性细胞的数量,从而增加保护粘膜病原体。IgA抑制细菌绑定对毒素(上皮细胞和行为49]。引入后的PP、成熟的T细胞迁移到LP和上皮细胞之间。LP主要由CD4细胞+T细胞(63年]。CD4+T细胞代表不同集合的子集与特定的细胞因子和趋化因子可以激活其他免疫细胞,导致激活或抑制免疫反应(77年]。然而,在益生菌管理、LP的T细胞数量的增加往往是增加Treg [48,80年]。一些报告关于益生菌的能力增加IEL的计数仔猪的小肠和大肠已发表(33,83年]。在猪、IELs主要是CD8+(72年,84年]。在稳态条件下,IELs调节上皮细胞的noninterruption营业额。他们破坏受感染的细胞和刺激细胞增殖,产生角质细胞生长因子(85年]。IELs发挥重要作用的粘膜损伤或攻击病原体。他们产生细胞因子和趋化因子,迅速摧毁pathogen-infected或受损的靶细胞77年]。数量的增加与减少IEL小鼠,观察细菌在肠系膜淋巴结(86年]。因此,不仅包含仔猪饲料中益生菌调节细胞介导免疫和体液免疫的影响还提高了肠道屏障通过增加细胞上皮黏液层的扩散和监管。的主要效应的组合益生菌和荞麦麸观察大肠的增加人口在LP和IELs T细胞。鉴于荞麦麸皮纤维来源,首先,它是一个能量的来源的肠道微生物群。不被小肠消化,它到达大肠,微生物群分解nondigestible SCFAs纤维。众所周知,SCFA不仅可以调节有益菌也激活肠道免疫系统。虽然增加的数量的影响乳酸杆菌荞麦麸皮和益生菌的组合不是观察,效果等其他有益的细菌双歧杆菌不能排除在外。此外,益生元可以直接影响肠道微生物群的免疫系统没有任何调制87年]。有趣的是,这种组合中包含的益生菌没有增加在小肠IEL观察单独使用时,这可能表明荞麦麸皮的抑制作用包括益生菌。在我们的研究中,草本植物增加T细胞群intrafollicular区和圆顶和B滤泡区,它指向immune-modulating活动对派尔集合淋巴结细胞补丁。几项研究已经发现,多糖的不同的植物可以刺激immune-competent细胞PPs (88年]。有趣的是,管理药草后,T细胞的数量和IEL取决于位置的肠:在空肠,倾向于稍微观察T细胞的数量减少,而T细胞密度显著增加结肠癌。大多数植物包含分子能够适度的免疫细胞的活性;此外,同一植物可能刺激抑制效果取决于环境。植物的水提取物含有更多亲水成分,如多糖,它可以激活免疫系统的反应。相比之下,乙醇或甲醇提取的植物含有黄酮类和萜类化合物等疏水性化合物,通常抑制免疫细胞反应(89年]。在我们的研究中,草本植物减少IELs空肠。几个作者报道关于草药的影响减少IELs [90年]。一方面,大多数草本植物的抗菌性能,这让他们作为抗生素的替代品(14]。草本植物调节或减少微生物负载;他们减少激活toll样受体T细胞增殖下降[紧随其后79年]。另一方面,抗炎效果已经观察到在大多数草本植物(17]。生物活性成分的草药能减少前列腺素的生物合成(炎症介质)通过环氧酶抑制活性。降低炎症反应导致降低T细胞迁移的绒毛上皮细胞(91年]。车前草和圣约翰草具有很强的环氧酶抑制活性(92年,93年]。这可以减少IEL的主要原因在仔猪空肠。反过来,显著增加结肠IEL的解释可能是,草药的多糖,可以作为微生物群(益生元49]。肠道菌群代谢草药分子,产生一系列的代谢产物如SCFAs聚胺类、有机酸、吲哚衍生物,和维生素。大概,IEL的增加可能是由于增加生产短链脂肪酸的纤维和多糖在结肠。有几个积极SCFAs T细胞数量的影响:他们直接增强T细胞(Th1和Th17)的生成,因此增加抵抗病原体的能力;他们可以鼓励T细胞产生il - 10,这是一个重要方面,以防止炎症反应,在某些情况下,也可以增加/减少FoxP3 + T细胞(94年]。免疫细胞相互沟通不仅通过指导和信息交互,还分泌因素(95年]。的能力δγT细胞产生细胞因子(il - 1β和TGFβ)诱发的传播消炎抗菌的CD4 + T细胞在LP (79年]。因此,数量的增加IELs可以在LP影响T细胞的分布。

5。结论

轻度慢性弥漫性小肠结肠炎可能是一个合乎逻辑的步骤引起的免疫系统反应一个新的饮食和环境。因此,肠粘膜免疫的发展是最有效的方法来改善仔猪的肠道健康。益生菌补充剂改善肠道微生物群通过增加计数的乳酸菌小肠和大肠,而草本植物有一个倾向于减少的计数肠杆菌科。改进的微生物群的益生菌和随后immune-stimulatory效应增加了小肠的IELs数量。它促进了肠上皮细胞和杯状细胞的增殖,提高酸性黏蛋白的生产。此外,T细胞密度的增加在PPs和LP可能表明强烈提供免疫系统稳态和免疫调节作用,与此同时,提供对病原体的抵抗力。在小猪的草药饮食的特点是双重效应。抗菌和抗炎作用的草药都应该减少对粘液的小肠免疫调节作用,正如短缺杯状细胞和LP和IELs的T细胞数量减少。然而,与此同时,草本植物改善histomorphological参数(绒毛高度,VH: CD比)和改进的肠上皮细胞的增殖和colonocytes。另一方面,增加T细胞分布在PPs和草药的大肠表明一些组件可以调节免疫系统。益生菌和荞麦麸皮的影响不存在预期,尽管一些积极作用观察大肠。更多的研究是必要的为了研究荞麦麸皮和益生菌的抑制作用的组合。 Further studies are needed for an improved understanding of probiotics and plant effects on the intestinal ecosystem by alteration of the microbiota, improved morphology of intestine, and stimulation of the immunology. The improved understanding will lead to an increased use of these alternatives in swine production.

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究受到了美国国家研究项目(AgroBioRes)。

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