孟加拉玫瑰、补体固定和间接ELISA检测诊断埃塞俄比亚牛布鲁氏菌病的敏感性和特异性的贝叶斯估计

摘要

在没有金标准试验的情况下，利用埃塞俄比亚国家动物卫生诊断和调查中心(NAHDIC)的三种商业可用试验，包括RBPT、CFT和I-ELISA，对牛布鲁氏菌病的诊断和筛查进行了试验评价。采集5个奶牛群体278份血清进行检测。每个血清样本均进行三种检测，并记录检测结果，采用贝叶斯模型对检测结果进行交叉分类，估计检测的敏感性和特异性。模型中使用了先前发表的数据中产生的关于牛布鲁氏菌病的敏感性和特异性的信息。在假设奶牛具有相似的管理系统和疾病状态未知的情况下，利用WinBug软件对三检验一种群贝叶斯模型进行了修改和应用。RBT、I-ELISA和CFT的Bayesian后验灵敏度分别为89.6 (95% PI: 79.9-95.8)、96.8 (95% PI: 92.3-99.1)和94 (95% PI: 87.8-97.5)，特异性分别为84.5 (95% PI: 68-94.98)、96.3 (95% PI: 91.7-98.8)和88.5 (95% PI: 81-93.8)。在这项研究中发现，与CFT和RBPT相比，I-ELISA的灵敏度和特异性分别为96.8 (95% PI: 92.3-99.1)和96.3 (95% PI: 91.7-98.8)。

1.介绍

布鲁氏菌是革兰氏阴性的兼性细胞内细菌，可感染多种动物和人。在该属内可识别出10种布鲁氏菌．有6种“经典”物种: B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. ovis, B. canis,b . neotomae［1，2]，最近还发现了其他四种物种[3.］．布鲁氏菌病的主要表现是生殖功能衰竭，如流产或出生不健康的新生儿和不育症[4，5］．在中东、亚洲、非洲、南美和中美洲、地中海盆地和加勒比地区，动物和人类感染布鲁氏菌病仍然很常见。布鲁氏菌melitensis在地中海盆地尤为常见，在非洲、印度和墨西哥也有报道[6］．

以前在埃塞俄比亚使用玫瑰孟加拉和补体固定试验对牛布鲁氏菌病进行的研究表明，集约化和半集约化奶牛场的发病率高于大农场[1，7，8］．1987年，世界动物卫生组织报告布鲁氏菌病的患病率为20%，大城市周边高于农村地区[9］．在埃塞俄比亚中部高地，据报道瘤牛中4.2%的布鲁氏菌病患病率[7］．Eshetu等人[10]报告说，2005年亚的斯亚贝巴附近的埃塞俄比亚中部(Wuchale-Jida区)的小农农场患病率为10%。Kebede等人[11]报告了在粗放管理系统下的牛患病率为11%。2003年及2005年在不同地区进行的研究报告显示，动物流行率分别为0.8%及3.2%，牧群流行率分别为2.9%及42.3% [8，12］．2003年至2004年在埃塞俄比亚进行的另一项研究报告称，患病率为1.6%，群体水平患病率为13.7% [1］．2011年至2012年一项关于外来奶牛和杂交奶牛和养殖场的最新研究报告称，埃塞俄比亚动物水平患病率为1.9%，牧群水平患病率为10.6% [13］．

血清学测试被广泛用于进行若干流行病学研究和诊断目的，但目前还没有完善的血清学测试[14，15］．然而，一种检测的诊断性能和鉴别能力可以通过分析比较几种检测的敏感性和特异性来评估[14，16］．测试的诊断性能可以通过与标准参考测试比较来评估，并使用潜在模型进行分析[17- - - - - -19］．本研究的目的是评价玫瑰孟加拉板试验(RBPT)、补体固定试验(CFT)和间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)用于筛选和确诊埃塞俄比亚牛布鲁氏菌病的贝叶斯方法的诊断性能和鉴别能力。本研究是埃塞俄比亚牛布鲁氏菌病现场诊断试验评价的一项研究，对疾病监测和未来的控制工作具有重要意义。

2.材料和方法

2．1.研究区域及人口

该研究是在距离亚的斯亚贝巴35公里、100公里、90公里、170公里和200公里的Sululta、Awash、Wonji、Adami Tulu和Alage 5个奶牛场进行的。农场管理制度和品种相似，疾病状况不明。因此，农场被假定为一个群体。选取该农场所有6月龄以上的动物进行抽样，研究动物总数为278头纯荷斯坦奶牛和杂交荷斯坦奶牛。

抽样时的农场史显示，所有农场均未接种布氏菌病疫苗。从颈静脉取血5 - 7ml，用真空纯管取血。样品在室温下凝固2-3小时。然后以2500转/分纺丝5分钟提取血清，置于−20°C冰箱中保存，直至试验完成。除了Sululta之外，所有的农场都位于埃塞俄比亚的大裂谷地区。

2．2.诊断测试

为进行检测评估而进行的所有血清学检测均在埃塞俄比亚Sebeta的NAHDIC(细菌血清学实验室)进行。

2.2.1。玫瑰红的测试

孟加拉玫瑰试验是按照国际兽疫局2009年规定的程序进行的。孟加拉玫瑰试验用抗原的制备b .流产用孟加拉玫瑰染色，悬浮于pH为3.65的酸性缓冲液中。同等体积(30μL)抗原和试验血清用微管通道聚集在一起;彻底搅拌后，摇四分钟;最后用放大镜读取结果，根据血清中抗原-抗体反应的有无凝集反应记录为阳性或阴性。孟加拉玫瑰抗原购自英国利利代尔诊断公司。

2.2.2。补体结合试验

补体固定试验采用Alton等[20.)方法。作为一种原则，如果有针对牛的特异性抗体布鲁氏菌在血清中，抗原-抗体复合物形成，补体结合。试验阳性结果为未发生红细胞溶血。如无特异性抗体抗布鲁氏菌，游离补体的存在会引起绵羊红细胞致敏，导致溶血。使用阳性和阴性对照对结果进行验证。根据滴定结果解释规模考虑强烈反应,当超过75%的固定补(3 +)发生在稀释1:5和反应是归类为弱阳性50%固定补(2 +)发生的稀释1:10以上。布鲁氏菌制备补体结合试验用抗原b .流产S99和标准的OIEISS给予50%固定在稀释1/200。布鲁氏菌抗原和补体固定试验阳性对照从AH-VLA (Animal Health Veterinary Laboratory Agency, UK)获得。溶血血清和豚鼠补体由ID VET (Innovative Veterinary Diagnostic)公司提供。

2.2.3。间接ELISA试验

测试是根据制造商的说明和程序进行的。ELISA kit by VLA Lillidale Animal Health Limited, Badbury View, Bothenwood, Wimborne, Dorset BH214HU, UK (https://www.gov.uk/government/organisations/animal-health-and-veterinary-laboratories-agency)．

试剂的制备．稀释缓冲液加入5片PBS 0.5 mL酚红指示剂和250μL的吐温20至500ml蒸馏水;pH调整为7.2。然后加入钠安瓿的量制得溶液₂HPO₄和1毫升吐温20至10升蒸馏水。底物缓冲液1片溶于120 mL蒸馏水中。用1 mL无菌蒸馏水溶解2片，制得显色剂。用500ml蒸馏水稀释叠氮化钠安瓿，配制停止液。抗原由经批准的光滑脂多糖制备b .流产菌株99 1µg/m/L包被0.05 m碳酸氢盐/碳酸氢盐缓冲液，pH为9.6，涂于平底微孔板上。阳性和阴性对照用1ml无菌蒸馏水重新配制，直到获得均匀的悬浮液后再使用。试验程序:首先将所有试验品和对照血清进行1/40的预稀释;然后在盘子里加入80μL的稀释缓冲液到井中，然后转移20μL的预稀释样品放入96孔微孔板中布鲁氏菌脂多糖(LPS)。光密度(OD0)设置为405纳米，在H12孔上空白，存在或不存在抗LPS的抗体布鲁氏菌比较阳性对照的平均OD值。在井内显色表明样品有抗体布鲁氏菌．验证标准如下:阳性/阴性临界值为阳性对照井平均外径的10%。任何OD值等于或高于此值的检测样品都应视为阳性。

2.2.4。使用贝叶斯模型进行测试评估

通过贝叶斯模型估计诊断测试的敏感性和特异性具有提供更稳定的点和区间估计的优势，而无需大样本容量[21，22］．采用贝叶斯方法的原因之一是，在缺乏培养和分离等金标准方法的情况下，贝叶斯方法可以很好地估计敏感性和特异性。贝叶斯方法是一种成熟的稳健诊断测试评估方法。我们不能培养样品进行细菌分离布鲁氏菌因为生物风险和生物安全问题。最后，我们认为这并不影响我们的研究结果。

利用从5个奶牛场采集的278份血清样本，对3种检测方法的敏感性和特异性进行了评价。每一份血清样本都要进行三次检测，并将结果输入计算机。将三种试验结果的观测数据汇总成交叉表。采用无金标准贝叶斯模型进行敏感性和特异性估计。模型中未知数据的先验信息来自已发表的牛布鲁氏菌病数据[15，23］．

Gall和Nielsen [15]综述了50多篇出版物，其中用于检测暴露的测定方法的灵敏度和特异性值流产布鲁氏菌其中，每个测试的灵敏度和特异性值的总和被平均，以给出一个性能指标。同样，我们比较了I-ELISA RBT的敏感性和特异性，因此我们将其作为我们数据分析的先验信息。

从公布的数据中获得的平均灵敏度和特异性的不确定性，使用Betabuster免费软件转换为beta分布(http://www.epi.ucdavis.edu/diagnostictests［22])。RBP、I-ELISA和CFT敏感性的先验信息分别为0.91、0.97和0.94，转化beta (a, b)为beta (49.4, 6.0);(103.2, 3.73);(89.27, 6.14)。RBP、I-ELISA和CFT的先前特异性模式分别为0.86、0.97和0.89，转化后的beta分布(a, b)为(22.76,4.43);(102.1, 4.23);和(83.05,11.14)1)．

使用WinBUGS免费软件对一次总体-三次检验的贝叶斯模型进行了修改并应用于数据。后验分布的中值是在50,000次迭代和初始5,000次迭代燃尽后建立的。采用核密度和自相关图检验模型的敏感性，后验分布与数据吻合较好。检测的条件依赖性也进行了检查，因为这些检测是基于类似的生物学基础，这可能会导致相关错误，导致对灵敏度和特异性的错误估计[22］．然后，应用条件独立贝叶斯模型，我们可以估计Se和Sp的条件相关性(rhoD和rhoDc)，用于三个检验。

3.结果

所有血清标本均采用三种检测方法(RBT、I-ELISA和CF)单独盲测。测试结果为5/278;RBT、I-ELISA和CF分别为8/278和2/278阳性;说明I-ELISA在灵敏度和特异性上优于CF, 3种检测方法的Kappa检验一致性中等(Kappa = 0.70);rhoD和rhoDc值很小，聚集在0附近，这表明这些测试是条件独立的(表)2)．

RBT、I-ELISA和CFT的真实敏感性的后验推断分别为89.6 (95% PI: 79.9-95.8)、96.8 (95% PI: 92.3-99.1)和94 (95% PI: 87.8-97.5)，真实特异性分别为84.5 (95% PI: 68-94.98)、96.3 (95% PI: 91.7-98.8)和88.5(81-93.8)。在本研究中，I-ELISA的真实敏感性和特异性分别为96.8 95% PI(92.3-99.1)和96.3 95% PI(91.7-98.8)，高于RBPT和CFT。这些养殖场的布鲁氏菌病血清流行率估计为4 (95% PI: 0.8-11.45)。

评价三种检验条件依赖性的条件相关性表明，rhoD(敏感性)和rhoDc(特异性)的估计值都很小，概率区间聚类在零附近，这表明这些检验是条件独立的。基于后验分布核密度和自相关图的敏感性分析表明，观测数据与模型吻合较好，先验信息对中值估计没有显著影响(表)3.)．

4.讨论

筛查和确认性诊断试验是成功进行流行病学研究的主要工具。在埃塞俄比亚，尽管发表了许多论文以确定不同农场环境中牛布鲁氏菌病的流行情况，但我们找不到任何已发表的关于血清学试验敏感性和特异性的数据。了解检测的诊断敏感性和特异性，有助于限制正确分类受感染动物和未受感染动物时的诊断错误，并防止在检测错误分类动物时造成过度经济损失[24］．

没有一种血清学检测适用于所有流行病学情况和所有动物物种;所有的试验都有局限性，特别是在筛选单个动物时。应考虑到影响测试方法和测试结果与特定诊断解释或应用的相关性的所有因素。孟加拉玫瑰试验的抗原是通过沉积杀死制备的b .流产用孟加拉玫瑰染色并悬浮在pH为3.65的酸性缓冲液中。制备补体结合试验用抗原b .流产菌株99 (Weybridge)和标准对照OIEISS给予50%固定在稀释1/200。相同的b .流产菌株99 (Weybridge)也作为可溶性抗原提取物(间接ELISA的光滑脂多糖(S-LPS))的来源。因此，采用经批准的光滑脂多糖制备间接ELISA抗原b .流产菌株99 1μg/m/L包被0.05 m碳酸氢盐/碳酸氢盐缓冲液，pH为9.6，涂于平底微孔板上。这三种抗原都是用来检测光滑性感染的布鲁氏菌根据从制造商获得的信息，品种。用于检测评估目的的所有诊断试剂盒成分(如抗原、参考血清和补品)均来自英国VLA，该公司是国际公认的具有良好生产规范的诊断试剂盒供应商。

要估计一项试验的诊断敏感性和特异性，需要知道将采用金标准试验的动物的真实疾病状况;然而，在缺乏这种黄金标准测试的情况下，贝叶斯方法是评估测试特征的有用工具[18，19，25］．

贝叶斯方法的优势在于它提供了一个稳定的点和区间估计，而不需要大的样本量[21，26］．人们普遍认为，筛查试验应具有较高的敏感性，但可能具有较低的特异性。目前研究中RBT的敏感性相当高(89.6 (95% PI: 79.9-95.8))，高于Sanogo等人(2013)之前的研究结果[27] (54.9% (cr 23.5-95.1))。

以往的研究表明CFT是一种合适的确认性试验，具有较高的特异性[16但这与目前CFT特异性为中等(88.5 (95% PI: 81-93.8))的发现并不一致，这可能与我们研究的人群规模较小有关。然而，Gall和Nielsen (2004) [15]报道CFT的敏感性和特异性分别为Se 81.2和Sp 83.5，这与我们目前的发现一致。与CFT和RBPT相比，I-ELISA法对牛布鲁氏菌病的敏感性和特异性最好(95% PI: 92.3 ~ 99.1和95% PI: 91.7 ~ 98.8)。I-ELISA检测免疫球蛋白IgG的所有同位素，而CFT无法检测，这可能是其高准确度的原因[14］．间接ELISA的平均敏感性和特异性由Gall和Nielsen(2004)报告为Se 96.0和Sp 93.8，这与我们的估计一致。

试验的条件依赖性是灵敏度和特异性的条件相关rhoD和rhoDc值分别很小且聚在零附近，这表明试验是条件独立的，在试验组合中使用可能是一个优势[28］．利用不同先验信息进行的敏感性分析表明，后验分布核密度和自相关图表明，观测数据与模型吻合较好，先验信息对中值估计没有显著影响。

5.结论和建议

在此基础上，I-ELISA检测效果最佳，其次为CFT和RBPT。然而，针对不同目的选择诊断测试的决定不仅依赖于准确性，还应该考虑测试吞吐量、技术复杂性和成本效益的能力。尽管RBT的敏感性较低，但由于其快速的结果和成本效益，它仍然是最广泛使用的筛选试验。因此，进行检测验证对于了解检测特征、确定研究、流行病学监测或国际贸易需要使用的检测类型非常重要。我们建议进一步研究这些试验在绵羊和山羊布鲁氏菌病诊断中的应用，以获得足够的信息。

相互竞争的利益

论文作者之间没有利益冲突。

致谢

该研究小组感谢国家动物健康诊断和调查中心促进了实地项目，并感谢Belachew Dura先生、Mengistu Nemera先生和Tafesse Koran先生为研究从不同的奶牛场收集血清样本。

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