文摘
目的如下:(1)评估两个浓度的效果在48和96 h(25 - 50%)的白细胞和富含血小板凝胶(L-PRG)和纯PRG (P-PRG)上层清液在生产/退化在正常马滑膜外植体(SME)同种型血小板衍生生长因子BB,转化生长因子beta 1,肿瘤坏死因子α,白介素(IL) 4 (IL - 4)、IL - 1受体拮抗剂(IL-1ra)和透明质酸(HA)合成和(2)关联这些分子与各自的PRG上层清液治疗。中小企业从6匹马培养了96 h和L-PRG P-PRG上层清液在25和50%的浓度,分别。中小企业文化媒体改变了每一个48 h和用于ELISA测定的分子,也决定在滑液。25% L-PRG上层清液产生持续释放IL-1ra随着时间的推移,逐渐释放哈,而50% L-PRG上层清液产生随时间持续增加的il - 4和哈。50% P-PRG上层清液生产和持续增加的生产IL-1ra和il - 4。细胞成分和关节的浓度(体积)富含血小板血浆制备可能影响抗炎和合成代谢与骨关节炎共同反应马。
1。介绍
骨关节炎(OA)是一种常见的跛马和一个潜在的导致原因浪费宝贵的动物(1,2]。这个关节疾病可能出现由于几个诱发因素,如重复创伤(创伤性关节炎)和滑膜炎从不同的原因,如骨软骨病(OCD)和联合感染(3]。尽管OA,在人类通常并不是与滑膜炎有关,最后变更是一个临床和病理备注在马的病理4]。一般来说,已是不争的滑膜炎增加关节软骨损伤基因upregulation和分解代谢的细胞因子的生产,主要interleukin-1 (il - 1)、肿瘤坏死α(TNF -α)、基质金属蛋白酶(MMPs),和类花生酸(3,4]。
虽然马OA一直被处理关节内注射糖皮质激素和透明质酸(5),目前有几个新兴再生疗法,如自体血清条件(ACS) (6),自体蛋白质溶液(APS) (7),干细胞(8,富含血小板血浆(PRP) [9- - - - - -11]。值得注意的是,PRP可以被认为是一个最全球再生疗法用于临床的人12)、马(10,11与OA[],和狗13,14]。
一些报道表明PRP的有益作用与天然OA(马10,11)和一些在体外研究[15,16),在活的有机体内研究[17)最近为了解释执行PRP能诱发关节组织合成代谢。然而,几乎没有信息这种物质生产的基本机制缓解疼痛和改善关节功能。
目前还没有共识如何雇佣的“理想PRP制剂”intraarticular联合治疗OA患者(16]。虽然提出了一些想法,以分类过多的PRP制剂使用(18),一般来说,在马,这些物质可以分为白细胞和富含血小板血浆(L-PRP)和纯富含血小板血浆(P-PRP)。L-PRP制剂既有增加血小板(PLT) (~ 3-5-fold甚至更多),白细胞(WBC)(三倍或更多)全血计数对基底细胞数量。P-PRP产品显示从低生理PLT数倍,从微不足道的白细胞浓度2倍的白细胞计数对基底细胞计数在全血(19]。当这些PRP制剂被激活,他们改变了富血小板凝胶(PRGs)。因此,PRG L-PRP称为L-PRG和PRG P-PRP称为P-PRG [18]。
如前所述,滑膜炎是一种的必要临床前和病理改变与OA(马4]。牢记这一点,有必要知道上层清液从L-PRG P-PPG可能影响马滑膜的炎症反应和新陈代谢。因此,本研究的目的是(1)评估时间影响(48和96 h)两种浓度(25 - 50%)的L-PRG和P-PRG上层清液在正常生产或退化马滑膜外植体(SME)的合成代谢生长因子(同种型血小板衍生生长因子BB (PDGF-BB)和转化生长因子beta 1 (TGF -)),促炎肿瘤坏死因子-α(TNF -α),抗炎细胞因子白介素(IL) 4 (IL - 4)和IL - 1受体拮抗剂(IL-1ra)和透明质酸(HA)和(2)来执行这些分子之间的相关分析和各自PRG上层清液治疗。
2。材料和方法
本研究通过动物实验伦理委员会的作者的机构。
2.1。动物和样品
从背伤关节滑膜样本6匹马的平均年龄9(±3.3)年。样本从马自由muscle-skeletal疾病和安乐死戊巴比妥静脉注射过量的其他医疗原因。所有的关节都射线透照和宏观评估不包括马OA关节变化有关。进一步,2毫升的滑液从每个关节得到为了知道PDGF-BB的实际浓度,TGF -肿瘤坏死因子-αil - 4, IL-1ra,哈哈。
2.2。L-PRP和P-PRP准备
静脉血从1成人临床健康,11岁的母马被用来避免女朋友的大变化,细胞因子,HA浓度PRGs上层清液用于实验。L-PRP和P-PRP通过手动双离心管法(20.)时,此前的验证和使用临床与OA(马10]。短暂,血液从颈静脉穿刺和存入4.5毫升管与柠檬酸钠溶液(BD真空采血管,正欲开车,富兰克林湖,新泽西,美国)。在120 g离心后五分钟,第一个浮在表面的等离子体顶部分数的50%,毗邻巴菲外套,收集。这个分数在240 g 5分钟然后离心机,第四部分是收集底部。这个分数被认为是L-PRP。上等离子体分数被认为是P-PRP。分析了全血和PRP PLT和白细胞浓度使用impedance-based血液学设备(Celltac -α日本Kohden MEK 6450年,日本)。
与葡萄糖酸钙PRP都激活(比1:10)和仍在孵化37°C 1 h,直到凝固收缩。L-PRG和P-PRG上层清液总是使用新鲜的在每个文化媒体改变1和49 h。整除的PRG上层清液得到在每一个时间点都冻结在−86°C为以后感兴趣的分子的量化。
2.3。文化和研究设计
滑膜样本获得无菌和圆形4毫米直径外植体获得使用一次性活检穿孔(KAI医疗,索林根,德国)。中小企业从关节囊解剖,在磷酸盐缓冲盐水洗。的设计研究包括五个实验的评价组,如下:1中小企业对照组(不添加任何PRG上层清液)和4中小企业组织培养与L-PRG或P-PRG上层清液在两个不同的浓度,25%和50%。
滑膜外植体稳定文化传媒(瑞士巴塞尔DMEM Lonza集团有限公司),并配以链霉素(100μ(100 g / mL)和青霉素μ没有添加血清g / mL)。文化是孵化有限公司5%2大气和水饱和24 h,然后更换新鲜培养基。1 h(孵化L-PRG P-PRG后上层清液浓度添加获取25 - 50%。所有中小企业群体中培养48 h和文化媒体改变了,取而代之的是新鲜的培养基和新鲜PRG上层清液和孵化为其他额外48 h。文化媒体获得1、48、49岁和96 h被整除,冻结在以后确定PDGF-BB−86°C, TGF -肿瘤坏死因子-αil - 4, IL-1ra,哈哈。
2.4。ELISA分析
L-PRG和P-PRG上层清液、文化媒体来自中小企业组织获得1,48岁,49岁和96 h,滑液进行了分析(通过复制)的浓度测量感兴趣的分子使用ELISA试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)。PDGF-BB(人类PDGF-BB DuoSet DY220)和TGF -(人类TGF -DuoSet DY240E)测定使用人类抗体,因为这些蛋白质在人类之间有很高的同源性和马(21,22]。此外,这些工具用于相同的目的在其他马PRP研究[17,20.]。肿瘤坏死因子-α(马tnf DuoSet DY1814), il - 4(马il - 4 DuoSet DY1809)和IL-1ra(马IL-1ra / IL-1F3 DuoSet, DY1814)与马化验特定抗体和HA(透明质酸DuoSet DY3614)确定使用multispecies检测酶联免疫试剂盒。标准为每个酶联免疫试剂盒用于准备每个标准曲线遵循制造商的指示。读数进行450海里。
2.5。统计分析
统计分析软件SPSS 19.0(美国芝加哥,IBM IL)。Shapiro-Wilk测试是用来评估数据集的正态分布拟合优度。PLT和全血白细胞计数和PRP和PDGF-BB TGF -肿瘤坏死因子-α,IL-1ra il - 4和HA浓度在所有评价组表现出正态分布()。
全血中血小板和白细胞计数、L-PRP和P-PRP被单向方差分析评估(方差分析),紧随其后的是一个图基测试。PDGF-BB TGF -肿瘤坏死因子-α,IL-1ra il - 4和HA浓度从PRG上层清液,滑液和血液细胞进行评估以类似的方式。PDGF-BB TGF -肿瘤坏死因子-α,IL-1ra il - 4和HA浓度从滑液和文化媒体获得48和96 h中小企业群体分析广义直系模型(GLM)必要时由图基测试。
PDGF-BB TGF -肿瘤坏死因子-α,IL-1ra il - 4和HA浓度在新鲜培养基PRG上层清液1 h和48 h也与这些分子的浓度培养基从中小企业组织获得48 h和96 h使用配对的测试。进行相关分析来确定皮尔逊相关系数()之间的变量评价研究中。一个所有测试值接受为显著。数据给出平均值±标准误差(东南部)。
3所示。结果
3.1。细胞和生长因子、细胞因子和HA浓度L-PRP / L-PRG P-PRP / P-PRG和滑液
血小板计数明显()不同全血、L-PRP和P-PRP P-PRP最低浓度(PLT /μL(平均±平均标准误差)),其次是全血(PLT /μL)和L-PRP (PLT /μL)。白细胞计数也评价组之间明显不同,L-PRP更高浓度(WBC /μL),其次是全血(WBC /μL)和P-PRP (WBC /μL)。
TGF -L-PRG之间浓度相似,P-PRG和滑液。PDGF-BB明显(相比)更高浓度L-PRG P-PRG和滑液;然而,这个女朋友的浓度最后这两个组件之间的相似。肿瘤坏死因子-α浓度显著()高滑液相比P-PRG上层清液。然而,没有显著差异的上层清液中细胞因子L-PRG P-PRG。il - 4浓度显著()高滑液相比都PRG上层清液;然而,这些细胞因子的浓度之间的相似PRG上层清液。IL-1ra浓度之间的相似L-PRG上层清液,滑液,但这种细胞因子的浓度显著()低P-PRG上层清液。HA浓度显著()高滑液相比都PRG浮在表面的,但它是相似的两国PRG上层清液(表1)。
3.2。生产/退化的生长因子、细胞因子、和中小企业TGF - HA在媒体文化β1
最初的TGF -β1获得的浓度在1和46 h在文化媒体明显()降低相比,每个同源PRG上层清液治疗48和96 h,分别为(数字1(一)和1 (b))。这个女朋友是大幅产生中小企业对照组和它的浓度在48 h相似相比TGF -浓度测量在中小企业接受的文化传媒25% PRG上层清液。中小企业组织培养有50% L-PRG上层的最高()对这种蛋白质浓度相比治疗组与对照组的中小企业和中小企业与25% PRG上层清液(图1(一))。96 h时,一个重要的()增加TGF -集中在中小企业集团培养和50% L-PRG上层清液与中小企业相比对照组(图1 (b))。要注意,滑液TGF -β1浓度是类似于培养基从所有中小企业评价组48和96 h。
(一)
(b)
3.3。PDGF-BB
血小板衍生生长factor-BB浓度显著()高培养基从所有中小企业群体对待不同PRG上层清液浓度在1和49 h与这些相比PDGF-BB浓度测量在同一组48和96 h,分别为(数字2(一个)和2 (b))。在48 h,显著减少PDGF-BB浓度是注意到所有中小企业群体对待所有PRG上层清液。在这个时间点,从显示中小企业对照组培养基PDGF-BB浓度与浓度在滑液和中小企业获得团体治疗与25% PRG上层清液浓度。此外,培养基从中小企业接受50% L-PRG浮层显示一个重要()增加了对照组PDGF-BB浓度相比,中小企业和中小企业团体治疗与25% PRG上层清液浓度(图2(一个))。
(一)
(b)
在96 h类似的趋势的浓度这个女朋友是观察,尽管PDFG-BB浓度培养基的中小企业接受50%的L-PRG上层清液显著()高与同一组相比在48 h(图2 (b))。值得注意的是,这种生长因子的浓度保持在所有的评估中小企业群体在接近或类似的浓度来获得在滑液,除了PDFG-BB浓度的培养基中小企业接受50%的L-PRG 96 h。
3.4。肿瘤坏死因子-α
肿瘤坏死因子α所有中小企业群体的文化媒体发布评估。在48小时,细胞因子的浓度在中小企业对照组和治疗组与25% PRG浓度显著不同()相比,滑液。另一方面,肿瘤坏死因子-α浓度显著()降低培养基从中小企业接受25% L-PRG上层清液治疗组相比,那些与50% PRG上层清液(图3(一个))。在96 h,类似的趋势在这个细胞因子的浓度在所有的评估组织注意到(图3 (b))。
(一)
(b)
3.5。il - 4
在48 h, il - 4浓度显著()降低培养基对照组中小企业和团体治疗与L-PRG上层清液浓度和25% P-PRG浓度相比,中小企业集团处理50% P-PRG浓度。il - 4滑液浓度是类似于培养基获得中小企业接受50% P-PRG上层清液(图4(一))。在96 h, il - 4浓度是类似的中小企业组织的滑液和培养基之间对待PRG上层清液。相反,这个细胞因子的浓度显著()降低培养基的中小企业相比对照组滑液(图4 (b))。此外,96 h, il - 4浓度显著增加的中小企业接受50% L-PRG上层清液与文化媒体相比从同一组48 h。
(一)
(b)
3.6。IL-1ra
在48和96 h, IL-1ra浓度显著()提高中小企业集团处理25% L-PRG上层清液滑液和培养基相比对照组中小企业和团体治疗L-PRG 50%和25% P-PRG浮层(数据5(一个)和5 (b))。
(一)
(b)
3.7。哈
在1和49 h, HA浓度显著()降低中小企业的所有文化传媒集团对待PRG上层清液(图6)。在48和96 h显著()这个分子的浓度明显增加所有中小企业群体评估1和46 h。然而,HA滑液浓度显著()相比,文化高媒体从所有中小企业评估组织(图6)。在96 h,显著增加了HA浓度培养基从中小企业集团处理50% L-PRG上层清液与HA浓度的同一组相比在48 h。值得注意的是,50% L-PRG上层清液刺激(尽管不明显)最高的HA释放的培养基相比中小企业处理与其他中小企业评估(图6)。
3.8。相关性
没有显著的变量之间的相关性被发现的研究。
4所示。讨论
本研究旨在了解在体外两PRG的效果上层清液在25和50%浓度生产和损失(退化)中小企业的一些关键分子与OA的病理生理学(密切相关3]。TGF -和PDGF-BB评估在这个研究中,因为他们已经证明了他们的重要合成代谢对联合组织的影响。一般来说,两种软骨蛋白增加ECM合成,减少关节疼痛和炎症,促进滑膜细胞的分化在软骨细胞(23]。女朋友都是主要存储在血小板α颗粒,治疗效果的原因很多的PRP归因于这些蛋白质(19]。肿瘤坏死因子-α被选为促炎细胞因子,因为这种蛋白质和il - 1代表的基石与典型相关的蛋白质分解代谢的不平衡从办公自动化24]。这种蛋白质也是重要的滑膜炎症及其upregulation滑膜组织中与一个更激进的侵蚀性的关节炎的临床情况(25]。此外,最近一项临床研究显示,肿瘤坏死因子-α是一个有用的生物标志物识别OA严重的马相比,il - 1 (26]。
il - 4和IL-1ra被选择,因为有重要的抗炎细胞因子直接与办公相关的病理生理学(3]。il - 4与chondroprotection有关,因为它会增加ECM的合成软骨(27]。然而,这个角色在关节炎比合成抗炎细胞因子,因为它增加IL-1ra的合成,会使肿瘤坏死因子-α(28- - - - - -30.]。另一方面,IL-1ra是一种天然的拮抗剂il - 1的效果,因为它块所需的细胞受体诱导软骨关节炎症和分解代谢由最后一个细胞因子(31日]。
本研究的最重要的一个方面是所有的分子评价以PRG上层清液,文化传媒(在不同的时间点),和滑液。这种方法论的方法允许建立中小企业团体试图达到他们的文化媒体分子环境中所观察到的类似滑液样本。然而,一般来说,中小企业群体对待PRG浮层显示一个更健壮的生理反应与更高的所有分子释放文化媒体评估与中小企业相比对照组。
TGF -和PDGF-BB培养基浓度达到48和96 h PRP联合注射后观察到的类似的模式在马在不同时间点17]。这可能表明,滑膜细胞平衡TGF -的浓度PDGF-BB,通过蛋白质生产或退化,为了达到一个自然的这些蛋白质比例滑液。
这项研究的结果允许识别这两个L-PRG上层清液提出了更好的抗炎和合成代谢的影响比P-PRG上层清液。25% L-PRG上层清液产生一个健壮的和持续释放IL-1ra随着时间的推移,逐渐增加释放哈,而50% L-PRG上层清液产生随时间持续增加生产的il - 4公顷。相比之下,50% P-PRG上层清液产生抗炎效应体现的增加和持续生产IL-1ra和il - 4。然而,尽管不重要,HA浓度往往随着时间的推移而减轻。此外,25% P-PRG上层清液可能被认为是治疗最坏的结果,因为它产生的最低版本抗炎细胞因子,逐渐减少(但不明显)在HA浓度。
这项研究的结果是之前的矛盾在体外研究评估的影响几个PRP制剂马软骨和半月板外植体(15和屈肌腱移植组织32,33]。总的来说,这些研究表明,leukoreduced PRP (P-PRP)准备在这些组织生产一种合成代谢状态L-PRP制剂相比,诱导upregulation分解代谢的分子,如基质金属蛋白酶和促炎细胞因子(15,32,33]。我们的研究结果也不一致在体外研究评估PRP制剂的效果对人类软骨移植组织和synoviocytes coculture [16]和synoviocytes [30.]。
可以提出一些解释解释我们的研究结果的差异,上述研究的结果15,16,30.,32,33]。我们相信,每一个研究的不同技术和方法论的条件特别是可能影响最终结果和妥协之间的直接比较研究。在我们的研究中,两种浓度的L-PRG和P-PRG上层清液进行评估;然而,这种特殊情况没有在提到研究[15,16,30.,32,33]。此外,两个文化媒体变化每48 h进行研究;相比之下,没有文化媒体变化进行这些研究[15,16,30.,32,33]。此外,我们使用PRG上层清液的实验,而PRP制剂被用于这些研究[15,16,30.,32,33]。
本研究的结果不仅可以显示细胞浓度在PRP(尤其是白细胞),但它的浓度在文化媒体会影响分子的组织处理这种物质。我们的研究结果也表明PRP的必要性建立足够的体积或PRG上层清液治疗每一个特定的联合影响OA或创伤性关节炎。此外,这些结果开放问题哪些物质,PRP或PRG浮在表面的,更暗示治疗OA或创伤性关节炎。
本研究有几个局限性。首先,这是一个在体外研究中,这意味着只有有用的建议而不是推断的基本机制基于PRP治疗OA (10- - - - - -13]。研究使用在体外系统的组件,就像这一个,无法证明免疫系统的巨大作用及其监管措施在关节疾病34]。另一方面,许多分子直接与OA病理生理学,如il - 1、il - 6,基质金属蛋白酶,在别人,并不包括在这一研究预算的限制;这种情况在逻辑上限制了理解能力的影响PRG上层的评估研究。最后,进一步,在体外研究是必要的,以确定是否滑膜反应PRG上层清液可能会受到炎症诱导的影响由脂多糖或分解代谢的细胞因子是否使用PRP或PRG上层清液可能引起不同的滑膜反应。
5。结论
L-PRG和P-PRG上层清液在25和50%浓度影响了分子抗炎和促蛋白合成的中小企业组织培养与这些物质。25 %和50% L-PRG上层清液和50% P-PRG上层清液产生最好的抗炎和合成代谢的影响相比对照组中小企业和中小企业集团处理25% P-PRG上层清液。额外的在体外研究是必要的,以确定如果滑膜反应PRG上层清液可能会受到一个诱导炎症状态的影响。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突与本文有关。
作者的贡献
本文代表一个博士论文的一部分提交的戴安娜·l·里奥斯的生物医学科学博士课程大学de卡尔达斯马尼萨莱斯,哥伦比亚。Jorge Carmona构思研究,参与其设计、协调和修正。戴安娜·l·里奥斯和卡特琳娜洛佩兹获得数据,参与分析和解释,起草。所有作者阅读和批准了期末论文。
确认
戴安娜·l·里奥斯由于COLCIENCIAS由她的博士奖学金。作者感谢威尔逊戈麦斯和法比奥Robayo的援助。这个项目被授予不支持。397 - 2011国家项目的生物技术从COLCIENCIAS波哥大特区,批准号0250911的Vicerrectoria de Investigaciones y Postgrados大学de卡尔达斯马尼萨莱斯,哥伦比亚。