文摘
本研究旨在建立一个系统c . parapsilosis在环磷酰胺引起的免疫抑制ICR小鼠感染模型和评价氟康唑抗真菌效率。三个实验将确认的最佳感染剂量c . parapsilosis传染病模型的结果,和体内氟康唑抗真菌效率。在第一个实验中,比较不同感染剂量治疗组之间的生存比例显示,最佳的培养液c . parapsilosis是0.9×105CFU /鼠标。以下实验是观察的结果感染剂量为0.9×105CFUc . parapsilosis。后期和组织病理学检查fugal-specific multiorgans病变,特别是肾脏,表现为炎症,无数微小脓肿,和真菌渗透。CFU计数与组织的组织病理学变化是一致的。观察Th1 / Th2细胞因子的不平衡增长的促炎细胞因子和抗炎细胞因子的反应血清和肾脏。在过去的实验中,基于模型的评价氟康唑表示,有理想为氟康唑抗真菌活动10 - 50毫克/公斤/ d的剂量。数据表明,该研究小组建立了一个系统c . parapsilosis在免疫抑制ICR小鼠感染模型,提供机会,增加我们的理解真菌发病机理和治疗。
1。介绍
假丝酵母,通常无害的共生体在健康个体,可能成为易感宿主机会致病菌,尤其是在严重drug-immunosuppressed或免疫缺陷病人1- - - - - -3]。在过去的二十年里,candidemia病原体已经改变了白念珠菌非-白念珠菌,患者感染非白念珠菌逐渐增加。假丝酵母感染约占8到9%的院内感染,成为第四个这样的感染最常见的原因(4,5]。c . parapsilosis一个典型的人类皮肤的共生体,出现了众所周知的能力在全静脉营养和生长形成生物膜植入导管和其他设备上(6,7]。在过去的十年中,发病率c . parapsilosis大幅增加,成为第二个最常见的孤立假丝酵母物种从血培养。
鉴于相关疾病的发病率和死亡率高得令人无法接受c . parapsilosis,迫切需要更有效的预防,诊断和治疗策略。实验动物模型是一个关键组成部分的理解发病机理和宿主抗感染和发展的更有效的抗真菌治疗。以前,免疫力低下小鼠模型c . parapsilosis我们已经建立的用来评估微生物代谢物作为结合剂用于治疗真菌感染(8]。经过进一步优化程序,建立动物模型更稳定和全身感染的结果。本文将详细描述的结果系统性鼠标c . parapsilosis模型,包括死亡率、组织真菌负担,组织病理学,血清和肾细胞因子,为评价氟康唑的使用模型。
2。材料和方法
2.1。动物和伦理语句
SPF女性ICR小鼠年龄在4到6周,体重20到22 g被用于这项研究。动物从线性购买实验动物中心有限公司,上海,以前从来没有用于任何实验过程。到来后,动物驯化前3天实验。
综述了动物使用协议和批准IACUC广东省实验动物研究所按照监控指导实验室动物保健和使用的(9]。动物被饲养在负压隔离的笼子里的动物负压设备的批准和监督由当地省级机构环境健康和安全办公室。
2.2。真菌菌株培养液和准备
c . parapsilosisATCC22019通常存储在−86°C被用于这项研究。股票剂的悬浮液c . parapsilosis从> 20 h 1640年RPMI媒介文化孵化30°C用颤抖的在150 rpm。和> 95%的c . parapsilosis细胞应该blastoconidia显微镜检查。
2.3。环磷酰胺诱导免疫抑制
十小鼠腹腔注射环磷酰胺(CY)(100毫克/公斤体重/天)连续3天。收集血液样本(0.20毫升)通过窝orbitalis静脉注射每日从0到6天后CY。然后,总白细胞计数被执行的Sysmex xt - 2000四世自动血液分析仪。另一个10小鼠接受生理盐水组控制。
2.4。研究设计
第一个实验是确认感染剂量。免疫抑制小鼠接受CY注射0.1毫升c . parapsilosis悬架通过尾静脉1×10的剂量2那么,0.9×105那么,5.0×105那么,8×105分别CFU。对照组小鼠接受生理盐水注射0.1毫升生理盐水通过尾静脉。根据生存曲线的结果,最优感染剂量会确认。
在第二个实验中,另一个最佳感染剂量接种免疫抑制组c . parapsilosis将观察感染的结果。天1、4和6 postinfection 3小鼠安乐死,收集血清,和靶器官(心、肝、脾、肺、肾、大脑)被切除组织真菌负担,病理检查,细胞因子测量。
第三个实验的目的是评价氟康唑(σ)。四组受感染的老鼠与剂量的氟康唑治疗腹腔内0,0.5,10日和50毫克/公斤/天体重1 h postinfection连续7天。存活率和组织真菌负担被用来评价氟康唑抗真菌的功效。
2.5。临床评估
动物被观察到每天在改变行为的研究,食欲,和死亡率。
2.6。后期和组织病理学检查
老鼠被公司牺牲2吸入。心、肝、脾、肺、肾、脑、胃和膀胱立即删除并保存在10%福尔马林。石蜡包埋和切片后,标准5μ米部分被削减和苏木精和伊红染色())和周期性acid-Schiff (PAS)。
2.7。组织真菌负担
一半的靶器官是均质在1.0毫升无菌生理盐水。组织匀浆从单个小鼠连续稀释在SDA盘子和培养48 h 35°C。结果表示为CFU日志10每一个器官。
2.8。细胞因子测定
il - 1α,il - 1β2、il - 4 IL-5, il - 6、il - 10, IL-17, IL-23, gm - csf,干扰素γ和肿瘤坏死因子-α在串行控制和感染小鼠的血清和肾样本测量仪珠数组。
2.9。数据分析
所有数据被表示为平均数±标准差。定量数据的差异进行了分析测试。而生存的差异进行了治疗Log-rank (Mantel-Cox)测试。意义被认为在0.05水平。
3所示。结果
3.1。CY诱导免疫抑制
没有发现重大的改变总白细胞计数控制老鼠注射生理盐水。然而,老鼠接受CY显示天1到4的时间相应减少。在第四天,老鼠接受CY的总白细胞计数达到最低水平,后跟一个逐渐增加直到第14天(图基础水平1)。结果表明,最优感染后3到6点天CY管理。
3.2。确认感染剂量的生存比例
在第一项研究中,每一个免疫抑制组提出postinfection动物的死亡。除了1×102CFU组1到15 postinfection从天死亡。为1×102CFU集团92%的动物一直延续到12天postinfection验尸。
生存曲线如图2。0.9×105与其他组(CFU组表现出显著差异生存率较,)。平均生存时间为0.9×105那么,5.0×105那么,8.0×105CFU组是5.5天,2天,2.5天,分别。这些数据表明,最佳接种体c . parapsilosis是0.9×105每只老鼠免疫抑制小鼠CFU。
3.3。模型的临床症状
窘迫的临床症状,如运动减少,食物和水的消耗,减少体重,自我孤立,和艰难的呼吸,是明显的在大多数感染动物postinfection 2天。每个感染组动物在感染期间去世。在死之前,他们中的大多数表现出严重的神经系统疾病,包括角弓反张、斜颈、共济失调。
3.4。总模型的观察
在验尸,肾脏肿大覆盖着白色的焦点在所有被感染的老鼠(图观察3)。某些情况下显示出血瘀点和瘀斑的肺表面的叶和大脑。此外,适度规模化、脾脏被观察到在大多数动物。没有特定的严重损伤被发现在其他器官。
3.5。组织学分析模型
在第一天,所有的器官的病变是相对温和,表现为炎症和真菌肾组织的渗透。
在4和6,代表病变可以观察到在大多数器官。肾脏遭受了最严重的损伤比其他器官或组织。大量肉芽肿在肾皮质和髓质(图扩散4)。显微镜检查显示,所有的肉芽肿包含真菌菌丝,芽生孢子,chlamydospore-like结构(数据5(一个)和5 (b))。肝脏只有经历过轻微病变,门静脉周的渗透多形核白细胞和真菌和一些元素(数据5 (c)和5 (d))。脾脏证明减少淋巴细胞的非特异性病变在白髓和渗透一些PAS-positive真菌元素(数据5 (e)和5 (f))。一定数量的肉芽肿或局灶性坏死可能观察到心脏肌肉,它总是由一个坏死中心,白细胞浸润,菌丝、芽生孢子和PAS-positive组件(数字5 (g)和5 (h))。某些焦点黑斑病的红细胞渗透,lymphocyte-like细胞,PAS-positive菌丝,芽生孢子和chlamydospore-like结构被发现在肺间质(数字5(我)和5 (j))。大脑的损伤比其他器官相对更严重,除了肾脏。焦液化性坏死与充裕的入侵真菌假菌丝中断的前脑(数字5 (k)和5(左))。多病灶的观察合并坏死和真菌入侵的胃壁,破坏胃壁的深层结构包括固有膜,膜肌层和地层subvascular(数字5(米)和5 (n))。类似的病变和广泛的真菌入侵胃壁也呈现在膀胱壁(数据5 (o)和5 (p))。
(一)
(b)
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
(左)
(m)
(n)
(o)
(p)
3.6。组织模型的真菌的负担
c . parapsilosis可以检测到从肾、肝、脑、心、脾、肺组织从第一天postinfection悬挂。真菌的动态变化在这些器官负担是相同的,显示瞬时增加一个短暂的峰值在第四天postinfection(图6)。肾脏出现更高的CFU分数与其他器官相比,相同的时间(以及,)。
3.7。细胞因子水平的模型
CY组,检测血清和肾细胞因子没有显著变化。与CY组c . parapsilosis被感染的小鼠血清中呈现不同的动态变化和肾细胞因子(图7)。血清il - 6和TNF -α显示瞬时增加,达成最高的分在第四天,血清干扰素的增加——紧随其后γ。其他血清细胞因子(il - 4, - 2 IL-5, il - 10, IL-17, IL-23, gm - csf、il - 1α,il - 1β)没有特定的变化。肾il - 6、TNF -α干扰素-γ,il - 1α,il - 1β提出了从天4到6 postinfection显著增加。然而,另一个肾细胞因子(il - 4, - 2 IL-5, il - 10, IL-17, IL-23,和gm - csf)没有具体的变化。
3.8。基于模型的评价氟康唑抗真菌活性
四组的传染病模型被用来评估氟康唑抗真菌效率管理不同剂量的氟康唑。在实验期间,50毫克/公斤/天集团的所有动物幸存下来,而死亡率的100%,80%,和40%的人观察到0,0.5和10毫克/公斤/ d组,分别。生存曲线生成和比较之间(图2组8)。之间的显著差异被发现50毫克/公斤/ d组,另一组(生存率较,)。还有10毫克/公斤/ d组之间的显著差异和其他人。之间没有显著差异显示0.5毫克/公斤/ d组和控制。接受氟康唑后,50毫克/公斤/ d组显示大幅下滑的肾真菌负担(图9)。尽管有死亡率下降0.5和10毫克/公斤/ d组、肾真菌在第四天postinfection负担显著增加(以及,)(图9)。与控制相比,肾真菌负担50和10毫克/公斤/ d组在4和6天明显低于控制(以及,)。结果表明,有理想为氟康唑抗真菌活动10 - 50毫克/公斤/ d的剂量。
4所示。讨论
白念珠菌一直作为主要的物种与人类有关吗假丝酵母感染了几十年。和大多数的实验动物模型假丝酵母物种都集中在白念珠菌了。尽管许多种类的动物被用于研究假丝酵母感染,啮齿动物感染模型占据绝大多数经济原因,容易处理和基因改造的可用性(10]。在本文中,我们将试图引入一个理想c . parapsilosis基于免疫抑制ICR小鼠感染模型。
许多评议被用来获得免疫抑制小鼠,例如,醋酸可的松和氢化可的松琥珀酸(11]。在这里,我们用CY诱发ICR小鼠免疫抑制。老鼠提出一次瞬态总数的减少白细胞计数和达到最低点后第四天收到CY连续3天的剂量100毫克/公斤体重。结果表明,几天后3到6 CY政府被感染的最佳时间点。和第四天被选为感染小鼠在这项研究。
确保感染剂量的c . parapsilosis分别免疫抑制小鼠感染4剂量。根据生存曲线的结果,0.9×10的剂量5CFUc . parapsilosis是最优感染剂量免疫抑制ICR小鼠。的形态假丝酵母物种是重要的动物模型。我们先前的实验表明,菌丝体c . parapsilosis毒性比真菌孢子。和包含> 95%的接种体真菌孢子被用于这项研究。
基于0.9×10的感染模型5CFUc . parapsilosis提出的中位生存时间5.5天,这是足够长的时间来满足研究抗真菌剂。组织病理学和组织真菌负担显示模型是一个系统性感染,肾脏遭受了最严重的损伤,表明肾可能是一个合适的筛选抗真菌药物的靶器官。短暂的真菌负担会增加瞬态峰值在多个器官,第四天postinfection证明第四天postinfection是一个最佳的时间点来评估研究真菌负担或抗真菌药物评价,这是进一步确定通过使用氟康唑抗真菌的传染病模型的评估活动。一些血清和肾促炎细胞因子诱导和符合组织真菌负担,而抗炎细胞因子没有显著增加。Th1 / Th2细胞因子的不平衡会导致高死亡率受感染的老鼠。
这个项目建立了一个系统c . parapsilosis在免疫抑制ICR小鼠感染模型。在这个模型中,multiorgans,包括肾脏、肝脏、肺、脾、大脑,和膀胱壁,代表无数微小脓肿,这证明了拥堵,出血、肾小管变性、异染的渗透。这个模型提供的机会增加我们的理解真菌发病机理和治疗。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
于吴和Fangui分钟co-first作者。Yu说,Fangui Min,余张,任黄的构思和设计研究。前五的合作者进行了实验。立信张真菌菌株,并提供建设性的建议。所有的合作者阅读和批准了期末论文。
承认
这项工作是2010 b060500019和2014 a010107018赠款支持广东省科技项目。