文摘

超数排卵的影响孕马血清促性腺激素(PMSG)自体移植卵巢在老鼠的腰椎肌肉histomorphometrically评估使用的数量和体积的指数不同的卵泡和黄体,卵巢和基质。血管新生小鼠卵巢移植后观察卵巢移植后14天、21天。移植后,中小学卵泡的数量和体积减少,同时PMSG超数排卵的总数量和总量增加三级卵泡和卵巢移植后体积。移植的平均大小主要增加,二级和三级卵泡。因此,中小学毛囊可以自体移植后生存但他们预订减少通过增加移植的时间。然而,三级卵泡数量和移植后随着时间的推移,他们对超数排卵的反应增加。

1。介绍

卵巢移植的方法保护濒危物种和有价值的1]。另一方面,卵巢移植有可能申请维持化疗和放疗后生育的女性(2]。由于卵巢移植,可能消耗卵泡储备和肥力恢复存在限制3]。嫁接的主要担忧是,移植物的生存完全依赖于建立新血管形成的4]。卵泡的数量可能会丢失,因为缺氧和缺血。为评价卵巢移植后缺血的影响,全部或部分可以使用小的实验室啮齿动物卵巢(5]。防止缺血,增加血管生成的速率,手术必须快速、卵巢组织应放置在一个高度维管组织(6]。表明缺血可能导致消失50%或更大的比例的初级毛囊和几乎所有的增长毛囊移植后3到7天前发展血管生成(7]。

类固醇生成、增殖和分化的卵泡颗粒细胞增长排卵期前的阶段的卵泡促卵泡激素(FSH)引起的。然而,原始卵泡的最初发展是FSH独立(8),但无血清FSH作为生存因素卵巢皮质组织培养在原始卵泡过渡到中小学毛囊(9]。此外,协调生殖细胞系和体细胞隔间卵泡发展的鼠标是通过FSH (10]。FSH在成年小鼠可以诱导使用孕马血清促性腺激素(PMSG),一种绒毛膜促性腺激素荷尔蒙的怀孕的母马。PMSG超排卵技术可以作为很好的模型来理解FSH行动在卵泡发育的可能机制11]。

有鉴于此,收获成熟的卵母细胞的体外受精过程增加生殖成功的机会,PMSG目前用于生产成熟的超数排卵卵母细胞体外受精的有价值的物种包括濒危物种。此外,它是不知道是否保留卵巢移植可以对实现这一目标的超数排卵收获更高的成熟卵母细胞的数量。本研究的目的是(1)评估超数排卵与PMSG移植卵巢的指标posttransplantation窦的卵泡的正常活动,(2)评估histomorphometrically posttransplantation缺血的影响在不同的滤泡阶段,和(3)评估恢复时间的影响小鼠卵巢的卵泡增长自体移植后使用PMSG超数排卵的感应。

2。材料和方法

2.1。动物

实验研究是经伦理委员会批准的兽医学院的设拉子大学。36个成年女性Balb / c小鼠体重大约25 - 30 g提供了从实验动物中心,设拉子大学医学科学。动物被保存在 和 相对湿度与12 h光/暗周期。他们被给予标准颗粒和水随意在实验期间。

老鼠被随机分为6组( ),四个移植组和两个对照组(表1)。移植组包括两个移植(14和21 d)组和两个PMSG /移植(14和21 d)组。对照组被细分为积极控制PMSG组和阴性对照组。间情期的老鼠进入研究天使用阴道涂片。PMSG阳性对照组的小鼠接受单一的PMSG腹腔内注射(5 IU, Pregnecol, Bioniche动物卫生(A /亚洲)企业有限公司出,新南威尔士、澳大利亚)和48 h后,动物安乐死醚和颈椎错位。移植组(14和21 d),两侧卵巢自体是脊髓间情期阶段。14和21 d后,移植组的老鼠被牺牲了。PMSG /移植组(14和21 d),相同的自体移植过程执行和12 d在第一组和19 d后在第二个PMSG (5 IU)腹腔注射和48 h后,小鼠安乐死。阴性对照组,手术并不是和老鼠牺牲在发情阶段。发情周期阶段确定基于阴道涂片法(12]。

表1
组织和程序评价超数排卵的影响自体卵巢移植后小鼠卵泡发展。

2.2。卵巢自体移植手术方法

手术在无菌条件下进行,24°C温度手术室。间情期小鼠的体重和IP注射氯胺酮麻醉(100毫克/公斤,Alfasan Woerden,荷兰)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤,Alfasan Woerden,荷兰)。手术的腹部和侧腰部的老鼠手术准备。卵巢的老鼠都远离中线腹部切口和转移到无菌盘装满prewarmed (39°C)无菌生理盐水。脂肪和结缔组织仔细从卵巢中取出使用立体显微镜(SZM、Optika、意大利)。腹部肌肉和皮肤缝合了一个标准的两层使用一个简单的连续缝合关闭模式。然后,paralumbar切口两边,平行于腰椎脊髓。卵巢被嫁接到背腰部肌肉和皮肤总是关闭。氧四环素喷雾应用切口网站。动物被放置在个人控制25°C温度恢复的笼子里。

2.3。组织学评价卵巢

那天采样、动物安乐死与醚和卵巢控制,PMSG团体和周围肌肉的移植卵巢组织移植组移除。组织固定在新鲜10%缓冲福尔马林溶液在室温下。之后,他们被植入石蜡。乙醇和二甲苯用于脱水步骤。样本嵌入在石蜡和串行部分的厚度20μm进行。在块切片,串行部分被检查到卵巢组织石蜡切片中出现。被选为第一个部分卵巢和第十部分选择连续每10片,直到最后一节的观察卵巢组织的石蜡块。选择部分是deparaffinized 60°C和脱水乙醇分级浓度二甲苯和水化在室温和彩色苏木精和伊红染色。

2.4。Histomorphometric分析

在卵巢中卵泡类型部分被定义为先前解释(13)和主要的数字,二级和三级卵泡依靠光学显微镜(CX21、奥林巴斯、日本)。部分也与调整显微镜下拍摄的数码相机(AM423U目镜相机,Dino-Eye,台湾)和恐龙捕获2.0软件(AnMo电子公司,新台北市,台湾)。的面积总卵巢黄体,总毛囊的每个部分都由他们范围使用Digimizer软件(MedCalc软件投资兴建;Mariakerke、比利时)。

此外,卵巢的体积,开发各个阶段的卵泡和黄体的组( )根据椭圆圆锥体积计算公式: ,在那里 相当于3.14, 表示更大的直径, 表明卵巢直径越小,卵泡和黄体。意思是卵泡体积( )是通过测量的平均体积的卵巢三级卵泡的阶段,根据以下公式: ,在那里 表明卵巢中卵泡的数量的阶段。此外,基质体积( )按照下列公式计算: ,在那里 是卵巢的体积吗 卵泡的体积。

2.5。统计分析

卵巢组织学指标的数据受到Kolmogorov-Smirnov正态性检验和分析了单向方差分析和LSD事后测试(SPSS为Windows版本22,SPSS Inc .)、芝加哥,伊利诺斯州)。的 值小于0.05的被认为是具有统计学意义。组织手段和标准错误报告的文本和图表(GraphPad Prism 5.01版Windows, GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。

3所示。结果

组织学检查显示血管生成和嫁接在卵巢移植后folliculogenesis PMSG /移植组(图1)。此外,在微观评价PMSG组和卵巢的PMSG /移植(14和21 d)团体众多大型三级卵泡被观察到,但是在移植(14和21 d)组和对照组的数量和大小的三级卵泡小(图2)。

(一)
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图1
(a)黄体和次级卵泡的部分确认后卵巢功能和folliculogenesis 21天的自体卵巢移植侧腰部肌肉的老鼠没有超数排卵。(b)血管生成,箭头显示血管的血液细胞移植卵巢和周围的骨骼肌。他走时染色。
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图2
比较superovulatory效应的孕马血清促性腺激素(PMSG)自体卵巢移植后小鼠。卵巢组(a)的控制,(b) PMSG, (c)移植(14 d), (d)移植(21 d), (e) PMSG /移植(14 d),和(f) PMSG /移植(21 d)。他走时染色。

Histomorphometric分析表明,有一个显着减少的数量和总量的初级毛囊移植(14和21 d)和PMSG /移植(14和21 d)组与控制和PMSG组( ,数据3(一个)和3 (b))。意味着初级卵泡的体积移植(14 d)组比其他组除了PMSG /移植(14 d)组( ,图3 (c))。也有显著的减少意味着初级卵泡的体积PMSG组与其他组相比( )。

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图3
平均值和标准误差histomorphometric分析初级卵泡总数(a)、(b)总量,和(c)意味着卵泡体积对照组,孕马血清促性腺激素(PMSG)组,移植(14和21 d),和PMSG /移植(14和21 d)组织自体卵巢移植后和superovulatory PMSG的效果。 不同的上标字母显示不同群体之间的显著差异( )。

初级毛囊一样,在次级卵泡的数量显著减少移植(14和21 d)和PMSG /移植(14和21 d)组与控制和PMSG组( ,图4(一))。此外,PMSG组次级卵泡的总量超过PMSG /移植(21 d)组( ,图4 (b))。平均次级卵泡的体积移植(14 d)组显著高于控制,PMSG, PMSG /移植(21 d)组( ,图4 (c))。

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图4
histomorphometric平均值和标准误差分析次级卵泡总数(a)、(b)总量,和(c)意味着卵泡体积对照组,孕马血清促性腺激素(PMSG)组,移植(14和21 d),和PMSG /移植(14和21 d)组织自体卵巢移植后和superovulatory PMSG的效果。 不同的上标字母显示不同群体之间的显著差异( )。

三级卵泡的数量在移植(21 d)和PMSG /移植(21 d)组显著高于对照组( ,图5(一个))。三级卵泡的总量PMSG /移植(21 d)组显著大于对照组,PMSG,移植(14 d)组( ,图5 (b))。指PMSG三级卵泡体积/移植(14和21 d)组比控制和PMSG组( ,图5 (c))。

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图5
平均值和标准误差histomorphometric分析三级卵泡总数(a)、(b)总量,和(c)意味着卵泡体积对照组,孕马血清促性腺激素(PMSG)组,移植(14和21 d),和PMSG /移植(14和21 d)组织自体卵巢移植后和superovulatory PMSG的效果。 不同的上标字母显示不同群体之间的显著差异( )。

卵巢体积PMSG /移植(21 d)组比控制和移植(14 d)组( ,图6(一))。卵巢间质体积PMSG组超过移植(14和21 d)组( ,图6 (b))。

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图6
平均值和标准误差histomorphometric分析卵巢体积(a)和(b)的基质体积对照组,孕马血清促性腺激素(PMSG)组,移植(14和21 d),和PMSG /移植(14和21 d)组织自体卵巢移植后和superovulatory PMSG的效果。 不同的上标字母显示不同群体之间的显著差异( )。

4所示。讨论

在目前的研究中,移植缺血的影响在生存和发展不同的滤泡阶段后整个卵巢异位自体是histomorphometrically 14和21 d后评估。结果表明,不同的滤泡类型的生存和发展受缺血的影响。减少数量的初级和次级毛囊移植和PMSG /移植组14和21 d显示缺血的影响在这些卵泡阶段。然而,移植后这些毛囊的数量和体积减少,但估计这两种类型的个体大小增加后14天,又减少21天。同时,在同一时期,三级卵泡的数量和体积的增加显示卵泡持续增长,增强后异位移植。与我们的研究结果一致,谢et al。3]最近表明,健康的毛囊,毛囊的数量与积极的增殖细胞核抗原在初级卵泡减少1个月后原位兔自体卵巢。卵泡早期发育是由卵巢自分泌/旁分泌监管者和oocyte-granulosa细胞之间的相互作用,卵巢间质细胞,外壁细胞影响这个过程(14]。嫁接可以诱导原始卵泡的失活15]。因此,初级卵泡数量可以减少受到停止原始卵泡生长的影响。我们的发现间接和直接可能表明卵泡生长和发育早期(原始和初级毛囊)更受缺血影响相比,晚期(二、三级卵泡),和在原始卵泡水库和初级阶段不能取代移植后缺血。

在这项研究中,我们发现卵巢组织存活和卵泡在肌肉增长空间的背部肌肉。快速血液供应可以防止滤泡池和停止folliculogenesis卵巢移植后可能减少激素卵泡质量和响应变化。因此,在本研究的影响腹腔内注射PMSG对卵泡增长卵巢移植后被评为指数存在卵巢血供,血管生成,folliculogenesis特别是在原始卵泡阶段。显著差异的小学,中学,和三级卵泡数量和体积移植和超数排卵后,这表明尽管积极作用在卵泡生存和更好的血管生成,产生重大影响应对超数排卵的卵泡生长和成熟。在啮齿动物解剖、初级卵泡小和子房非常接近的表面16]。另一方面,在初级卵泡卵母细胞的新陈代谢是高于任何后续阶段(17]。因此,减少初级毛囊比次要的一个星期后(时间2个样品之间)可能的结果的影响posttransplantation缺血早期卵泡的减少。

完整切除卵巢脂肪组织移植前增强通过促进血管再生的细胞渗透高血液供给肌肉组织。新血管的形成是由伸长,发芽,肠套叠,或既存的脉管系统的整合循环内皮细胞(18]。这些过程可以参与卵巢的血管生成19]。缺血性损伤卵巢组织postgrafting期间是不可避免的,其效果是减少后neo -和血管再生。血管移植小鼠卵巢和站点之间的连接观察移植后5天(20.]。

一群原始卵泡在10到12 d达到次级卵泡期和6 - 12 d开发大鼠窦的阶段(21]。考虑posttransplantation血管生成的5 d,在第一个抽样14 d,评估三级卵泡从初等和中等发达卵泡卵泡遭受posttransplantation缺血,而第二采样21 d分段三级卵泡是发达的毛囊血管生成后中小学毛囊。因此,数量的增加意味着或三级卵泡的体积相比21 d后14 d采样移植组可以解释道。

5。结论

主要和次要毛囊可以自体移植后生存但水库逐渐被增加移植的时间减少。然而,三级卵泡数量和移植后随着时间的推移,他们对超数排卵的反应增加。因此,看来,早期的集合或超排卵技术移植卵巢可能导致更多的三级卵泡。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。