回顾性和前瞻性调查关于“四瓣花”在狗血涂片红细胞

文摘

不寻常的红细胞表面两个模式(所谓的“四瓣花红血球,”qRBCs)狗血涂片在光学显微镜(OM)在cbc的日常评价。两个连续的回顾性调查安排包括约7000 cbc,从狗显示qRBCs临床记录和实验室数据。几个样品qRBCs准备扫描电子显微镜(SEM)。qRBCs被发现在6.89%(139 2016)和8.47%(133 1569)的狗和3.89%(154 3958)和4.47%(138 3081)的cbc(有些狗不止一次)进行测试。统计分析是重要的年龄组(Chi的平方,),降低白细胞总数和中性粒细胞计数(方差分析,红细胞表面),红细胞大小不均、多色性和Howell-Jolly身体(方差分析,分别为< 0.005,< 0.003)。qRBCs分布领域的羽毛边缘,在血涂片body-feathered边缘地区的电影。SEM排除的可能性,一种光学错觉或偶然重叠。qRBCs与衰老有关的狗,总白细胞和中性粒细胞计数,红细胞和红细胞大小不均,多色性,Howell-Jolly尸体。讨论了一些假设来解释这个加拿大皇家银行安排的起源和意义。

1。介绍

评估血液电影每当CBC请求验证数据生成的红细胞表面血液学分析仪,并提供相关信息,白细胞和血小板(plt)。评价红细胞表面形态是一个关键的步骤,血涂片评价添加重要信息(1,2]。红细胞表面形态学评估从一个制作精良的血涂片可以敏感地检测异常的规模和血红蛋白浓度以及提供信息异常细胞形状(红细胞)和夹杂物的存在,即使最先进的分析仪器无法察觉。这个过程通常是由专业人员充分利用很大程度上是因为缺乏信心的准备制作精良的电影和血无法识别重要的异常。然而,没有其他血液学过程提供更多的有价值的信息却很少需要额外的时间和费用(2 - 3分钟)。事实上,一个好的经验是需要评估血涂片,特别是“不正常”细胞(3,4]。

有多种原因可以修改红细胞形状包括再生反应,改变代谢(铁和脂质最重要的是,而且电解液消耗),氧化损伤,immune-mediate损伤,机械破碎、败血症、毒素、药物,而且artifactual代理像温度、湿度、和涂片制备中的错误(如抗凝过量,干燥工件),所谓preanalytical错误(5,6]。这些原因并不是相互排斥的,有很多可能的中间形式和相同的形态学特征可能在各种生理或病理状态。真正的异常可能与许多非特异性和相关机制或非常具体和基本遗传或者后天疾病的诊断1,7]。

自2010年以来,我们记录的特定安排的出现两个红细胞发生在血涂片的狗。从那时起,我们准备了一些论文在兽医学位和三个短沟通关于这个主题。我们称之为异常“红细胞表面四瓣花”(qRBCs)或“Pisa交叉红血球”类似的外观四瓣花或比萨社区的国旗在中年时期(8- - - - - -12]。

本研究的目的是总结调查进行了关于qRBCs存在和发生的狗血电影和与他们特定的条件或障碍或其他异常在实验室结果。

2。材料和方法

qRBCs是偶尔血涂片中发现评估光学显微镜(OM)多年来,但具体箱报告他们经常在CBC结果添加了只有在2009年5月,为了这个信息存储在数据基础。

两个time-consecutive调查安排研究qRBCs的外观和一致性。

在3958年第一个调查cbc包括收集的2016只狗从2009年5月到2010年10月(18个月)。每个狗性(包括两性培养了狗),年龄和品种被报道。的类使用的年龄从4到12个月的小狗,成年人从13个月到6岁,7岁以上的老年人。血液样本被收集在K3-EDTA管。CBC参数评估使用兽医阻抗细胞计数器(HeCoVet、SEAC Calenzano,佛罗伦萨,意大利),包括红细胞计数、血红蛋白(Hgb)、红细胞比容(Hct),意思是血细胞比容(MCV),意味着corpuscolar血红蛋白(妇幼保健),意味着corpuscolar血红蛋白浓度(MCHC)、PLT计数、平均血小板体积(MPV)、plateletcrit (PCT)、红细胞分布宽度(RDW)、血小板分布宽度(血栓)和白细胞计数。血电影准备的幻灯片(楔)方法尽快从采血(通常在一个小时内)和快速风干减少形态学变化。涂片是沾Diff-Quik(戴德Behring、SpA、米兰、意大利)根据程序的制造商。血电影被用来执行WBC微分计算,红细胞表面的形态评价,白细胞,PLT、PLT估计。多孔性、细胞识别、染色和细胞分布进行评估20 x和100 x放大在该地区之间的身体和血的羽毛边缘电影。这个区域通常被称为大约50%的红细胞应彼此接触。 The CBC blood film scanning was performed by all authors, except Nicola Bernabo’.

154 cbc显示qRBCs和各自的狗的血液样本收集进一步研究在考虑他们的临床记录包括所有实验室数据同时进行(血清生化资料包括总蛋白、白蛋白、胆固醇、血糖、总钙、磷酸盐,总胆红素、尿素、肌酐、铁、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、伽马谷酰基转移酶和血清蛋白电泳分数)和他们的健康或疾病状态推断。狗不存在qRBCs作为对照组。

本研究一个特定的调查期间被安排与更高的放大,查看qRBCs使用扫描电子显微镜(SEM) (JEOL /地产- 5410扫描电镜,JEOL有限公司,东京,日本)。起初,据高尔et al ., 2006年,液体样本准备五个狗血的送给qRBCs不止一次3 - 5滴血液立即加入5毫升的戊二醛(2.5%磷酸缓冲盐或PBS。3小时后在4°C,样本离心机(10分钟2700 rpm)获得红细胞丸。红细胞颗粒在PBS洗两次,然后涂在载玻片cm以前对待赖氨酸。然后涂片与进步的酒精脱水方案(30 - 50 - 70 - 90 - 95%),最终两次绝对酒精。准备与一个关键point-dried进一步脱水,覆盖了一层薄薄的金。然后,下列程序从显示的三只狗血涂片qRBCs不止一次成立:加拿大皇家银行四瓣花被确定之前对血液涂片固定与甲醇(使用Diff-Quik固定剂的解决方案),并检查在OM 20 x放大。然后,感兴趣的领域是孤立的从血液涂片和玻片剪出适合SEM所需大小(厘米),直接覆盖了一层薄薄的金(避免脱水过程如上描述)处理与扫描电镜(13]。

3081年第二次调查,cbc包括收集从2010年12月- 2011年的1569只狗(13个月)。对于每个狗变量性别、年龄和品种收集之前的研究。血液样本被收集在K2-EDTA管。CBC参数评估使用兽医激光细胞计数器(Pro-Cyte、Idexx实验室、意大利),包括红细胞计数、血红蛋白、Hct、MCV、妇幼保健、MCHC, PLT统计,商务,PCT, RDW,血栓,白细胞计数,自动白细胞微分计算,和网织红细胞计数。血液电影之前准备的描述;只有染色法不同的是一个自动幻灯片使用色料(Wescor 7150 Aerospray Delcon,米兰,意大利)与May-Grundwald吉姆沙染色剂。

从所有血液涂片检查属于第二个调查,其他日常评价中红细胞形态异常检测(分级和认可根据1984年韦斯(14)收集、分析并与cbc没有qRBCs的存在作为对照组(1984)(14]。此外,一个样本的64 cbc qRBCs完全超过138,使用不同的狗,是本地化和计算qRBCs涂片检查(之前描述的扫描规则)。

偶尔,qRBCs也出现在cbc从其他物种。在第一次调查676只猫、259匹马和8野猪被检查,而在第二个调查514只猫,20个牛犊,和两个熊进行评估。

为了欣赏的空间配置qRBCs SEM考试后,三维(3 d)画了画。

2.1。统计分析

的统计分析进行了以下测试:卡方对性别和年龄,确切概率法繁殖,单向方差分析(Mann-Whitney) CBC参数和血清生化所有红细胞异常记录和结果概要和血清蛋白电泳。

3所示。结果

在表1初步调查的结果包括2016只狗和3958 cbc报道。qRBCs被发现的139只狗(6.89%)和154年cbc (3.89%)。性不是一个统计上的显著变量,而年龄组的比较重要(Chi的平方,)。品种最代表喜忧参半,拉布拉多,德国牧羊犬和金毛猎犬(无统计学意义)。应该注意,同时被发现的还有qRBCs,同时记录在十猫(10/676),两匹马(2/259),和一个野猪(1/8)。

CBC的数量之间的差异表现和狗的数量包括在这项研究是由于多个CBC的重复相同的狗。同样的区别是发生在cbc qRBCs。实际上,样品与红细胞表面四瓣花154 139年139只狗,因为14狗(10.1%)不止一次提出了这个加拿大皇家银行模式(通常两次;一条狗显示qRBCs 3顺序cbc)。qRBCs没有观察到每一个血涂片的这些主题,但是5个连续14狗显示qRBCs涂片。

在表2第二次调查的结果包括1569只狗和3081 cbc报道。qRBCs被发现的133只狗(8.47%)和138年cbc (4.47%)。性不是一个统计上的显著变量,而年龄组的比较重要(Chi的平方,)。品种最代表喜忧参半,德国牧羊犬,金毛猎犬和拉布拉多(无统计学意义)。应该注意,同时被发现的还有qRBCs,同时记录在两只猫(2/514),一个小腿(1/20),和一个熊(1/2),虽然qRBCs被马。

在表3狗,基于临床记录和实验室数据呈现qRBCs第一调查任务,他们的健康状况十几或受到一个器官系统疾病或障碍是可能的。应该注意的是,9/139的狗病在多个系统或受到不止一个障碍。不幸的是,我们无法分配33/139狗健康或患病组。qRBCs检测主要是在狗受到肿瘤(主要是恶性淋巴瘤和肥大细胞瘤),其次是健康的动物和狗受到各种胃肠道疾病(主要是肠病不同的起源)。方差分析测试值上执行来自CBC,生化概要和血清蛋白电泳参数显示白细胞总数(qRBC组3.08 - -26.38,平均8.6×10⁹/ L;对照组4.10 - -31.9,平均10.2×10⁹/ L),绝对中性粒细胞计数(qRBC组2.19 - -23.48,平均6.58×10⁹/ L;对照组2.94 - -26.8,平均6.96×10⁹/ L)和中性粒细胞百分比(qRBC组42.6 - -88.1,平均71%;对照组45 - 94、中值76%)在统计学上()降低狗qRBCs相比对照组。

在表43081年发现的其他标准红细胞形态学特征没有qRBCs cbc(对照组)和138年cbc qRBCs (qRBC组)报告。方差分析统计评估指出一个重要结果红细胞大小不均,多色性和Howell-Jolly尸体的出现在两组之间。应该还指出,红细胞形态特征观察,有时单个或一般互相结合。

在表5调查关于64年qRBCs血液电影的位置进一步审查为此报道如下:(我)在大多数情况下只有一个qRBC观察(41/64)在所有涂片审查;(2)qRBCs也同样看到羽毛边缘区域和涂片毗邻body-feathered区域(见图1和2);(3)在一些情况下qRBCs先前被认为在两个引用;(iv)qRBCs看到的最大数量相同的高通滤波器(100 x) 3(见图3)。

最后,在23/64血电影qRBCs已经观察到的“中间形式”。中间形式的红细胞表面qRBCs是公认的两个部分重叠和形状仍圆(不尖锐,因为类似棘细胞)。血电影展示qRBCs qRBCs和中间形式之一是7/23(30.4%),而那些有多个qRBCs连同中间形式(参见图16/234)。

两种不同制剂在SEM观察qRBCs安排,前者从glutaraldehyde-treated血样,后者从血液已经抹载玻片上。这两种技术是成功的准备完整的红血球在SEM视图。不幸的是,血涂片检查在SEM准备从glutaraldehyde-treated血液样本观察任何qRBCs未果。因此,考试在血涂片的SEM qRBCs已经看到和本地化高倍镜观察qRBCs是最好的选择。这更紧密的观察排除一种光学错觉或意外的可能性(参见图重叠5,6,7,8)。看着两红细胞内边缘的印象“拥抱”证实,和空间安排在3 d(参见图绘制9)。

进一步分配给qRBCs名叫比萨交叉红血球这个修改非常类似于中世纪的比萨交叉(见图10)。

4所示。讨论

在正常红细胞表面扫描血液电影的四瓣花的发生在很大程度上是偶然的,单身,也只有在一些涂片的地区。当一个仔细检查了红细胞表面的四瓣花在这些幻灯片多个结果相当普遍。qRBCs结果可能低估了我们的结果,因为通常血涂片评估需要几分钟时间,并完成形态评价所需的所有信息包含在cbc收集只从几个领域。

安排两个连续的调查显示略有不同流行价值观考虑狗的数量(6.9%比133/1,569 139/2,016,8.5%)或数量的cbc(3.9%比138/3,081 154/3,958,4.5%)。这种差异可能与意识,注意,培训和经验的几个cytopathologists执行评估血液电影,增加每天的日常工作。

调查qRBCs外观的比较和变量性别、年龄、年龄和品种明显只有课程安排,这一修改更多的观察老年狗。应该注意到,在品种更多的两项调查中表示混合狗拉布拉多,德国牧羊犬,金毛猎犬和德国牧羊犬,金毛猎犬和拉布拉多。此外,样品处理两项调查中略有不同;此外,瓶收集血液抗凝剂是K3-EDTA与K2-EDTA和染色法血电影Diff-Quik与May-Grundwald染色,但这些条件看起来不起眼的qRBCs的外观。的确,qRBCs承认两项调查,即使在不同的数据大相径庭。如上所述,qRBCs也观察到血液样本和各自的血液收集的电影没有任何抗凝。

搜索一个特定的疾病或疾病相关的外观qRBCs是失败的;然而,应该注意的是,狗与癌症的影响(主要是淋巴瘤和肥大细胞瘤)和健康更代表子组安排在表中3。协会qRBCs狗较低的白细胞计数(绝对)和中性粒细胞计数(绝对和百分比)相比,控制人口的狗没有qRBCs很有趣,应该进一步证实了广泛的研究。

红细胞表面与其他变化的关系如体积、颜色和形状,通常扫描在血涂片评价在红细胞大小不均,多色性和统计上显著相关的外观Howell-Jolly身体qRBCs的外观。这些异常通常发生在有一个红色的刺激。

qRBCs安排也同样发现羽毛地区和涂片边地区毗邻的身体和羽毛区域,在该区域的最优厚度光显微镜检查,以及工件和畸变细胞被最小化。此外,评价的首选领域是那些红细胞中心苍白是观察和细胞圆(15]。从结果qRBCs通常是孤立的结果和很少有超过2 - 3 qRBCs样品,他们主要是位于涂片。qRBCs被发现的地点大部分是兼容的传播更大的细胞涂片。

SEM的制备血液是卓有成效的只使用涂片中qRBCs已经在OM本地化。这种技术是迄今为止一个新的过程从未描述狗,给了很好的结果。确实,我们能够文档qRBCs空间布置排除红细胞表面的光学错觉或意外的重叠两个由于涂片(剪切)部队在准备的幻灯片。qRBCs glutaraldehyde-treated血液样本可以是负数的搜索主要是因为qRBCs罕见的血液,因为没有任何血迹的整除qRBCs红细胞表面或否则glutaraldehyde-treatment分离两个参与qRBCs安排。

qRBCs代表两个红细胞之间的附着力,这不同于rouleaux(红细胞表面组织的线性数组或链)和单纯凝集(无组织的聚集或集群)。Rouleaux和凝集可以有共同的原因,也就是说,球蛋白的蛋白质浓度的增加,和物种差异也应考虑在如上所述的Windberger et al ., 2003,指出不同的粘度在整个血液和血浆和红细胞聚集16]。

四瓣花的形状与OM观察似乎是由两个红细胞在一种“拥抱。”安排的规模相比,一个加拿大皇家银行支持假说以及印象来源于观察内部边缘(如图3,4,6,7)。

几个假设是先进来解释这个特殊的加拿大皇家银行安排。

第一个假设是,qRBCs代表一个重叠的人工制品。在几个最初的观察血涂片与qRBCs artifactual dacryocytes(同一方向)羽毛边观察,重叠其他红血球(部分如图所示4)。这一假说很快就被拒绝了,因为它是没有证实有经验与qRBCs看到幻灯片。事实上,很明显,dacryocyte安排指出结束,展示形态不同于真正的qRBCs圆形形状。

由于EDTA被认为是另一个工件的假设。尽管EDTA不扭曲血液细胞,使其适合血液学应用程序中,有一些对细胞膜的影响,这可能会影响红细胞粘附性。使用EDTA作为抗凝剂的红细胞渗透脆性增加,反映了红细胞的细胞膜的功能(17]。与扫描电镜研究人类鬼膜,它是证明,在暴露于EDTA,整个膜表面覆盖着长,薄铝型材叫stromalitic形式每细胞(约460)仅用扫描电镜可见。这些铝型材似乎与螯合剂的特点(绑定)钙,因为暴露在电离钙废除了EDTA-induced stromalitic形式。钙在细胞活动中发挥作用,影响粘附性,赋予刚性和结构凝聚力膜组件。stromalitic形式的存在表明,膜表面不稳定或削弱它的表面张力,影响红细胞表面之间的附着力,改变了螯合剂(18]。因此,四瓣花红细胞可能artifactual安排由于EDTA螯合活动可能会导致一个功能失调的粘附性,加上部队在血涂片制备应用。EDTA的浓度与血液收集和EDTA在管的类型也可以发挥作用。在我们的研究中我们没有注意到任何影响使用K2或K3 EDTA实际上样品。

另一种假设artifactual问题被认为是物理的观点。

一般来说,红细胞表面显示discocyte外观(两面凹的),他们有一个更大的表面积比要求附上他们的体积(正常平衡);因此,它们可以弯曲和折叠不增加表面积。缺乏一个3 d细胞骨架,红细胞表面保持其形状和机械完整性通过spectrin-dominated三角2 d网络连接到质膜的胞质侧。这半柔性的纤维网络,随着双分子层的表面张力,导致复合膜的弹性模。特定的剪切流条件下(非平衡),红细胞表面可以下跌和辊,可以假设不同的形状,如延伸成一个椭球而接受tank-treading (TT)运动19,20.]。

从生物物理的角度来看加拿大皇家银行由一个细胞外弹性膜和内粘性流体和它的运动粘性剪切流影响膜弹性性质。事实上,加拿大皇家银行展览两个动作。TT运动的旋转膜内部,保持固定的形状,这发生在流体外力大于膜弹性阻力,因为缺乏细胞骨架元素在细胞质中允许细胞膜和细胞骨架围绕不同细胞质(20.,21]。另外,加拿大皇家银行运动(过渡)翻滚运动,整体旋转整个单元刚体。这种转变是整个加拿大皇家银行的振荡膜TT一起运动和发生在最大弹性阻力与外部流体分享力(7,20.]。

一些论文在实验模型显示不同的阈值的存在剪切的加拿大皇家银行改变其运动(TT或暴跌)与介质的粘度在哪里暂停。所发挥的积极作用,红细胞细胞骨架及其周期性变形反映在势能振荡,红细胞膜上的每个点的结果是独一无二的,也称为“形状记忆属性。“细胞骨架是本质上附着在膜和这些振荡是由于交替收缩和细胞骨架的应力松弛。然而,TT运动中观察到的流态理论模型只能预测暴跌。这种明显违反了理论预测可能归因于这样一个事实:形态学改变导致工作和耗散是不同的,表明TT运动无处不在,甚至在折叠和畸形红细胞等条件发生在红细胞流经毛细血管狭窄(20.,22,23]。

最后,细胞粘附是一个有趣的过程,在很多情况下起着关键作用的生物和医学的兴趣,但是红细胞相当光滑在亚微米级,有核细胞镶嵌着各种各样的突起,气泡,褶边,微绒毛或板状伪足和复杂的力学行为和一个明显影响胶粘剂互动。血管的血液循环是伴随着信息和细胞壁的碰撞,这可能导致附着力。血液细胞粘附分子间作用力是短程力来自如静电、水化、立体,范德瓦尔斯,和具体的化学成键。表面张力影响红细胞表面之间的附着力和粘附分子的数量有关,其中大多数是跨膜蛋白与细胞骨架(24]。

红细胞表面聚合始于小骨料(通常是对比),可以被布朗碰撞,导致粘附的细胞移动,但新的聚合也形成一个动态平衡。更强的粘附红细胞表面应该取代这个平衡更高浓度的聚合物。聚合的程度是由反对力量:聚合诱导的大分子和崩溃引发的负表面电荷和剪切应力流。红血球的血浆蛋白或其他大分子可能形成聚合物,通常在rouleaux阵型,分散与增加血流量(25,26]。

在我们的研究结果,rouleaux在控制人口(14.5%)高于与qRBCs狗(9.0%)(见表4)。因此,假设粘附在qRBCs可能已经被发现为rouleaux和凝集形成机制不同,所以不同于大分子的存在。血液流动,信息接触时间很短,当红细胞的“凹凸”到对方,但如果联系足够缓慢,排斥分子预计离开接触区或收集进入限制区域,作为预测的理论问题和建议通过电子显微镜证据导致粘连(24,27]。

应该在考虑,因微循环的剪切率低和担保和cell-blood交流,促进红血球结束之间缓慢的方法假设当地的附着力。从“形状记忆”众所周知,每个点的红细胞膜是独一无二的,它仍然可以认为循环红血球坚持由一个小区域(接触力或特定的粘附分子)的影响下tank-treading运动和剪切流的力量可能会导致一个“滑”的细胞膜,细胞变形和biconcavity损失,并形成一个不寻常的循环qRBCs。多个发现相同的狗(14狗,10.1%)可能表明个体易感性qRBCs形成(23,24,27]。

液体的阴性结果发现qRBCs扫描电镜样品不否定这个理论,因为戊二醛影响红细胞膜蛋白的合成即使在小浓度(0.0005%),蛋白质聚集的形成,当浓度增加平行。血影蛋白和其他蛋白质的细胞骨架网络的变化可能会导致红细胞的形状和大小的变化以及释放两个红细胞(之间的附着力28,29日]。

5。结论

根据获得的结果和讨论是不可能认同确定性的起源和“四瓣花”修改的意义,尽管它的有效发生血涂片检查确认。一些有趣的统计数据记录等相关的老化,总白细胞和中性粒细胞计数,红细胞和其他一些特性(红细胞大小不均、多色性和Howell-Jolly机构)。在一些非正式的访谈与其他兽医cytopathologists和/或血液学家我们有确认qRBCs狗血电影偶尔观察到的好奇心。相同的人类cytopathologist采访和/或血液学家没有给出相同的结果,因为他们从未见过这样的红血球构象。此外,这将是有趣的跟踪、监督狗显示血液中qRBCs特别是高浓度的qRBCs为了避免丢失的认可的加拿大皇家银行模式,因为它发生在狗只是偶尔发现在哪里。

利益冲突

本文的作者都没有财务或个人与他人关系或组织不当影响或偏见的内容。

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