文摘
鲜为人知的内部传播最初的皮肤病变和组织取向利什曼虫braziliensis (Viannia)人口自然感染的狗。本研究的目的是调查的遗传多态性l . braziliensis (v)种群在不同解剖网站自然感染的狗用聚合酶链反应(PCR)和low-stringency单一特定primer-PCR (LSSP-PCR)技术。放大产品分析LSSP-PCR调查寄生虫种群的遗传变异存在于不同解剖部位使用。二十三岁的52个样品给pcr阳性结果。的存在l . braziliensis (v)菌株仍局限于皮肤病变和其他人展示传播的特征观察内部器官和皮肤健康。LSSP-PCR和数值分析表明,不传播的寄生虫种群基因相似,属于一个单独的表现型分类法的集群。相比之下,人群显示蔓延到内部器官显示多态基因档案。尽管异质性,l . braziliensis (v)人口具有相同遗传资料观察颈在腘淋巴结相同的动物。狗可以体现我们的研究结果表明,感染的传播和组织趋向性遗传学上截然不同的族群l . braziliensis (v)。
1。介绍
利什曼病是一种原生动物的疾病造成的不同属的物种利什曼虫,这是由女性phlebotomine昆虫的叮咬传播的属Lutzomyia在新的世界。皮肤利什曼病(CL)和内脏利什曼病(六世)在大面积流行的热带,亚热带,和地中海盆地。在88个国家约有3.5亿人感染利什曼病的风险,这个数字被认为是由于不准确的缺陷检出率数据用于估计患病率在许多流行的国家(1]。
在里约热内卢利什曼虫braziliensis (Viannia)是最普遍的物种负责CL。传播主要发生在城郊地区,那里的原始雨林植被被人类占领取而代之的是杂乱无章的。适应的向量Lutzomyia媒介物户籍所在地和peridomiciliary环境,以及被感染的人类的存在,狗,马,一直在观察(2- - - - - -4]。犬的人口,l . braziliensis (v)感染是通过皮肤的病变,通常位于阴囊,耳朵,和枪口,这些通常不会影响动物的健康状况。
鲜为人知关于内部传播初期皮肤损伤和组织趋向性寄生虫种群自然感染的狗。尽管可以使用聚合酶链反应(PCR)检测的存在l . braziliensis (v)DNA在自然感染的狗的血液样本5),寻找一个更加敏感的分子技术能够检测这种寄生虫的多态特性是必需的。
本研究的目的是调查的遗传多态性l . braziliensis (v)自然感染的人群出现在不同的解剖网站狗流行地区的里约热内卢,巴西。使用PCR和low-stringency单一特定primer-PCR (LSSP-PCR)作为一个集成的方法使得同时诊断和遗传类型的特定人群l . braziliensis (v)在犬CL。
2。材料和方法
52临床样本9狗进行了分析。人畜共患病的动物被称为服务,Evandro恰加斯病临床研究所,奥斯瓦道·克鲁兹基金会,说明安乐死的建议巴西项目的控制利什曼病(6),后血清学评估。所有的动物都开始从六世在里约热内卢流行地区,他们被硫喷妥钠过量安乐死在临床样本收集。皮肤损伤的样品由活检片段,从肩胛区皮肤健康,脾脏,肝脏和颈和腘淋巴结。这些动物感染也证实的孤立l . braziliensis (v)片段的皮肤病变。这项研究是由动物伦理委员会的批准和授权用户(CEUA-FIOCRUZ)没有。L-23/06。
2.1。DNA隔离和特定的PCR检测
DNA隔离,基因组准备细胞和组织DNA隔离设备(Amersham法玛西亚)根据协议所描述的使用奥利维拉et al。7]。这种寄生虫DNA检测到使用一对引物PCR扩增(B1: 5′-GGGGTTGGTGTAATATAGTGG-3′;B2: 5′-CTAATTGTGCACGGGGAGG-3′)放大的变量地区kDNA minicircles亚属的物种Viannia属于利什曼虫braziliensis复杂的(8]。反应了在最后一体积为25.0μL包含3.0μL样本的DNA, 10毫米的Tris-HCl缓冲溶液,MgCl 1.5毫米2,0.2毫米deoxynucleoside三磷酸(核苷酸),10 pmol的底漆,2.5 U的Taq DNA聚合酶。放大周期在95°C开始3分钟,其次是33周期在30年代,94°C 60.5°C 1分钟,1分钟72°C,最终在72°C扩展了10分钟。积极控制包含kDNA (5 ng /μL)的参考应变l . braziliensis (v)(MHOM / BR / 1975 / M2903)包含的所有组件和消极的控制,除了DNA。样品与负面结果重新受到抑制试验。分析了放大产品在1.5%琼脂糖凝胶,在紫外线的照射下,可视化和拍摄使用UVP GDS 7500设备(凝胶文档系统)。
2.2。Low-Stringency单一特定的引物PCR分析
l . braziliensis (v)kDNA 750 - bp碎片产生的特异性PCR与向导纯化PCR准备系统(WI Promega,麦迪逊,美国)根据制造商的指示。LSSP-PCRs被放大执行B2的纯化DNA片段引物:5′-CTAATTGTGCACGGGGAGG-3′。反应进行了40 pmol底漆,200μ10 moL / L核苷酸,更易与L Tris-HCl (pH值8.6),50 L更易与氯化钾,1.5 L MgCl更易24 U(聚合酶,和3μ60 ng / L (μL)的纯化750 - bp片段(最后体积,25岁μL)。放大了thermocycler如下:95°C 5分钟;95°C 1分钟,36°C 30年代和72°C 2分钟(45周期);在72°C和最终扩展10分钟。放大产品分析1.8%琼脂糖凝胶(高分辨率、σ)溴化乙锭染色后。
2.3。数值(表现型)分析
乐队从300年到750年不等的碱基对(bp)被选为表现型分类法的分析。LSSP-PCR配置文件使用比较简单的匹配(Sm)相似性系数确定的比例不匹配。相似矩阵转化为一个无关紧要的系统树图的两组算术平均法(UPGMA)算法(9)使用NTSYS程序(版本2.0;埃克塞特软件、Setauket美国纽约)。
3所示。结果
3.1。动物研究的临床条件和PCR检测
52样本9狗流行地区的里约热内卢,巴西,进行评估。这些动物血清反应阳性的利什曼虫,和间接免疫荧光抗体试验(IFAT)表明,他们有不同的血清浓度。皮肤病变主要出现在炮口,耳朵,和阴囊。IFAT的滴度、病变本地化和地理起源的动物如表所示1。具体进行了PCR检测52从动物获得临床样本的研究。二十三岁的52个样品PCR扩增后给了积极的结果。750 - bp诊断特定于寄生虫的乐队原虫复杂的检测在活检片段如下:100%(9/9)在皮肤病变,30%(3/9)在健康的皮肤,44.4%(4/9)在脾脏,22.2%(2/9)在肝脏,在腘42.9%(3/7),22.2%(2/9)在颈部淋巴结。两个样品的淋巴结中提取DNA。有趣的是,注意到l . braziliensis (v)菌株仍局限于皮肤病变的动物A3、A4、A5、A6,其他人(动物A1、A2、A7、A8和A9)显示的传播特征在内部器官和皮肤健康(表2)。
3.2。LSSP-PCR化验和表现型分类法的分析
pcr阳性产品(750 - bp乐队)受到LSSP-PCR。不同程度的遗传多态性在放大观察变量的区域l . braziliensis (v)kDNA minicircles。证实了该方法的重现性是相同的电泳概要文件时观察到的相同的条件下重复分析化验。
LSSP-PCR生成的基因资料提交给表现型分类法的分析,和乐队矩阵转换成系统树图。第一个生成的系统树图(图1)分组的人群出现在八狗的皮肤病变。l . braziliensis (v)人口没有传播属性被发现基因相似,显示Sm相似系数从0.9到1.00不等,他们被放置在一个单独的集群。另一方面,人口显示蔓延到内部器官显示更多的多态基因图谱的相似性系数从0.36到0.9不等。六个不同的遗传图谱确定了皮肤病变。第二个系统树图(图2)分组传播人群,被发现在不同的内部器官,皮肤损伤,完整的皮肤。尽管观测到的异质性,人口具有相同遗传图谱出现在腘(PL-A1)和颈部淋巴结(CL-A1)相同的动物是杰出的。此外,不同的遗传资料在同一解剖部位,但在不同的狗(S-A7和S-A8)和相同的概要文件在不同的动物在不同的网站(HS-A9和PL-A8)也被观察到。11个基因相异的l . braziliensis (v)人群中发现了这个群体。然而,寄生虫种群呈现相同的基因档案,发现皮肤病变中,并未观察到相同的动物的内脏器官(图3)。
(一)
(b)
(一)
(b)
4所示。讨论
在这项研究中,使用多态的分子标记,证明了遗传异质性kDNA minicircles片段l . braziliensis (v)菌株,是由不同的人群组成传播倾向内部器官。再现性的基因档案让我们确认,观测到的异质性并不是由于放大产品的装载量凝胶或工件。
在流行地区不同利什曼虫物种或变异传播,这种疾病可以异构感染性培养液的结果,可能由于多个独立的累积感染(10]。事实上,存在明显的寄生虫种群在流行地区流传的CL,和multiclonal起源利什曼虫菌株已经显示(11]。
研究取向的传播和组织的能力l . braziliensis (v)狗是稀缺的文学。根据研究结果提出了在这项研究中,病原体传播的内部器官,甚至健康的皮肤似乎是相关的特定人群的存在l . braziliensis (v)。这是观察到的寄生虫的种群扩散到其他解剖网站是寄生虫的基因不同于那些仅限于皮肤病变。
观察到的遗传多态性是否反映遗传可塑性(12]或表明,菌株检测到的皮肤病变是由多个人口不能明确确定从我们的数据。进一步克隆分析这样的压力可能会解决这个问题。另一方面,这种变化可能反映了特定类的minicircles变化(13)或者内生一代新多态性(14]。寄生虫传播特定的基因档案以来,恢复皮肤病变并不在同一种动物的内脏,内生代的多态性是一个合理的解释。
这些种群的遗传多态性观察也可以被视为一种赋予选择性寄生虫。支持这个观点最近报告的某些遗传模式的存在l . braziliensis (v)在艾滋病毒阳性患者15]。此外,另一项研究[16)的可变性l . infantum (l)在人类和狗已经解决的可能性,免疫系统可以选择毒性无毒利什曼虫人群。循环的遗传多样性l . braziliensis (v)压力可以使一个特定的基因档案之间的关系和组织取向非常困难。虽然在不同的解剖网站相同的遗传资料相同的动物(PL-A1和CL-A1)和在不同动物(HS-A9和PL-A8)曾被观察到在目前的研究中,特定的传播寄生虫基因档案从皮肤病变内部器官并不明显。先前的研究结果证实了这一发现,没有观察到协会之间的基因档案和患者的临床状况17]。然而,相比之下,基因不同的概要文件被发现在患者的病变活检,在不同的时间在一年(18]。
据我们所知,这是第一个研究报告的遗传异质性l . braziliensis (v)人群出现在解剖网站以外的皮肤病变在自然感染狗流行地区的里约热内卢,巴西。这一发现的l . braziliensis (v)菌株仍局限于皮肤病变和其他菌株传播内部器官显示不同的遗传图谱,可能由于kDNA突变,显示传播寄生虫的可能性是可行的。我们组和其他人的报告显示,持久性的利什曼虫(Viannia)寄生虫可能是规则,而不是例外。激活皮肤病变(10)的PCR检测l . braziliensis (v)DNA,其次是可行的寄生虫的隔离后11年的临床治愈CL (19),加强了这一主张。进一步的研究与大量的临床样本自然感染的狗需要为了绘制遗传资料之间的相关性和致病性。
5。结论
感染我们的结果支持这一观点,狗可以被传播和组织取向体现的遗传学上截然不同的族群l . braziliensis (v)。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。