文摘
芽生菌病的系统性真菌感染,感染人类和动物提出了多年的临床医生的诊断挑战。本研究的目的是评估的诊断敏感性皮炎芽生菌酵母溶解产物抗原对抗体检测与芽生菌病狗。溶菌产物抗原准备b .皮炎隔离T-58和t - 66(狗,田纳西州)和WI-R WI-J(狗,威斯康辛州)。基于从初步比较研究结果,这些孤立的五个组合和一个个体隔离测试92血清标本狗culture-proven或组织学证实芽生菌病,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。从血清获得平均吸光度值介于0.905与1.760个人T-58抗原用抗原组合(T-58 + t - 66 + WI-R)。所有的6抗原准备能够检测抗体的血清标本,但检测到抗体抗原组合程度高于单个抗原。本研究提供的证据表明,酵母溶解产物试剂的组合似乎更有效的在犬血清抗体检测,但我们实验室继续评估抗原溶解产物组合在芽生菌病检测的抗体。
1。介绍
芽生菌病,人类和动物的系统性真菌感染,是由双晶的真菌生物皮炎芽生菌。吸入的感染是由孢子产生的丝状真菌的阶段。生物体在自然界中存在于这个阶段或在实验室25°C和有能力转化为酵母相在37°C的肺部受感染的主机。这种疾病可能是self-resolving或者它可能作为一种急性或慢性状态存在的肺组织。如果未经治疗的疾病在肺部,可能成为入侵和传播到其他器官,可能致命的脑膜炎可能发展的中枢神经系统(1- - - - - -5]。芽生菌病,以及其他系统性真菌病,称为“新兴真菌的威胁”,因为他们不仅感染免疫系统正常的人,也引起关注在免疫力低下的个人3,4]。
芽生菌病的地理分布与东南和中南部各州有关边境俄亥俄河和密西西比河和中西部各州包括上部区域在威斯康辛州和明尼苏达州,非常流行的疾病(6,7]。
由于增加系统性真菌疾病,研究人员已经开始投入更多精力开发诊断的方法,预防和治疗这些真菌病(8- - - - - -17]。过去几年的研究在我们的实验室已经与各种品种的相关研究b .皮炎从人类、动物或环境标本许多地理位置,以更好地理解生物体的免疫生物学(18- - - - - -27]。疾病的诊断提出了主要问题。在某些情况下,培养或组织病理学检查可能是有益的,但在一些病人这些方法可能不会产生预期的结果。这导致了更多,做更多的研究来提高免疫分析倾向于提供更快速诊断,但我们,以及许多其他调查人员,认识到问题仍然存在对免疫测定的敏感性和特异性。
我们目前的研究目的是评估的各种组合b .皮炎酵母溶解产物的检测抗原抗体血清标本和芽生菌病狗。
2。材料和方法
2.1。抗原
酵母相溶菌产物试剂(田纳西州T-58、狗;t - 66,田纳西州的狗;威斯康辛WI-R,狗;WI-J,狗威斯康辛州)准备的方法类似于一个以前用于抗原的生产荚膜组织胞浆菌(28- - - - - -30.在我们的实验室和修改b .皮炎溶菌产物生产抗原(23]。酵母细胞阶段增长了7天在定义的化学介质(37°C葡萄糖,10.0克;磷酸氢钾,1.5克;氯化钙脱水,0.15克;硫酸镁,0.5克;硫酸铵,2.0克;L-asparagine, 2.0克;半胱氨酸,0.2克;和pH值调整到6.2 5 N氢氧化钠)在一个孵化器瓶,由离心收获(700×g;5分钟)后用蒸馏水洗涤,resuspended在蒸馏水中,然后为7天可以溶解在水用颤抖的37°C。 The preparations were centrifuged, filter sterilized, merthiolate added (1 : 10,000), and stored at 4°C. Protein determinations were performed on the lysates using the BCA protein assay kit (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA), and dilutions of the antigenic reagents used in the ELISA assays were based on protein concentration. Combinations of the above four antigenic reagents as well as T-58 (not combined with others) were used for antibody detection. A previous preliminary comparative evaluation was performed [27)使用一个以上的个体数量和组合溶解产物准备评估他们的能力在24血清抗体检测与芽生菌病狗。本研究表明,6显示灵敏度最大程度的准备。因此,本研究更大数量的血清标本,开始进一步评估6最佳溶解产物试剂(T-58 + t - 66 + WI-R;t - 66 + WI-R;T-58 + WI-J;t - 66 + WI-R + WI-J;T-58 + t - 66,个人抗原T-58)从早些时候的一项研究在92年抗体检测血清与芽生菌病诊断狗但有不同数量的抗体标本。
2.2。血清标本
九十二份血清样本与诊断狗芽生菌病是由a . m .勒让德博士(田纳西大学兽医学院、诺克斯维尔TN,美国)。阴性(正常)血清并不包括在这项研究因为我们比较感兴趣的反应为背景,而不是纠正消极的控制。
2.3。酶联免疫吸附试验(ELISA)
每个6的能力(个人或组合制剂)酵母溶解产物试剂检测血清抗体在上面的标本决心使用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)。每个溶菌产物抗原稀释的蛋白质(2000 ng / mL) carbonate-bicarbonate涂层缓冲区(pH值9.6;等量的每个溶菌产物混在准备蛋白质的组合和2000 ng / mL的个人T-58抗原导致200 ng总蛋白/ 100 uL),然后添加到一式三份井(100 uL) NUNC 96孔酶标(Fisher-Thermo)。盘子被孵化一夜之间在4°C潮湿室紧随其后洗涤三次磷酸缓冲盐含有0.15%渐变20 (PBS-T)。血清标本(1:2500稀释;100 uL)被添加到微型板块井和孵化为30分钟37°C在一个潮湿的室。这个孵化后上面的井被清洗和100 uL山羊发起免疫球蛋白(H & L)过氧化物酶共轭(美国科克加德和佩里,马里兰州)被添加到每个好,孵化为30分钟37°C。上面的盘子被再次洗和100 uL三甲过氧化物酶底物(皮尔斯/ Fisher-Thermo)被添加到每个好,在室温下孵化大约2分钟。反应是停止添加硫酸和吸光度读2550 450海里使用BIO-RAD环评读者。
3所示。结果/讨论
的平均吸光度值6b .皮炎溶菌产物抗原,用于检测抗体的ELISA 92年狗血清,如图所示1。五个试剂组合表现出平均吸光度值大于1,从1.158到1.760,而单一抗原试剂(T-58)表现出平均吸光度值为0.905。最反应试剂是T-58 + t - 66 + WI-R,北部两个南部隔离和一个分离的混合物。所有的试剂可以检测抗体芽生菌病的最佳试剂检测抗体在单一抗原的两倍。
6的敏感性溶解产物准备,评估能力检测抗体时平均吸光度值从0.400到2.800,如表所示1。最佳的溶解产物抗原的敏感性百分比(T-58 + t - 66 + WI-R) 0.400−0.800吸光度范围从100%至42%的最高吸光度值(2.101 - -2.800)。灵敏度与其他5百分比从25%到0%不等溶解产物在这个最高吸光度值水平。
大多数以前的研究已经评估只单一抗原抗体的检测在芽生菌病。然而,先前的一项研究测试了14抗原或抗原组合对24狗血清来确定敏感性使用ELISA [27]。在这项研究中,我们使用了6大部分活性试剂的研究进一步检验灵敏度的比较分析。
4所示。结论
这项研究表明,特定的抗原组合更可取的是immunodiagnostic抗体检测试剂b .皮炎血清的狗。T-58 + t - 66 + WI-R抗原结合是一种很有前途的候选人为未来的研究在此基础上比较研究。因此,我们实验室正在继续研究,以建立一个可靠的免疫诊断试剂,将援助的芽生菌病在人类和动物。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
承认
这项研究受到了美国生物科学,爱达荷州州立大学波卡特洛,不。83209 - 8007。