文摘

系统发育分析表明,犬流感病毒(文明)(H3N8)是从当代马流感病毒(EIV)。尽管EIV的遗传相似度和文明,最近的证据表明,文明是无法传染,复制和传播受到马。确定马H3N8病毒是否具有同样失去了感染的能力,导致疾病,和狗之间的传播,我们评估的传染性和遗传性最近佛罗里达州sublineage EIV隔离在狗。临床症状,鼻病毒血清学反应监测在狗接种后21天。实时一和红细胞凝集抑制试验表明,病毒保持能够感染和复制在狗和导致血清转化。从感染传播EIV哨兵狗,然而,受到限制。此外,文明和EIV表现出类似的唾液酸-α2,3-gal受体结合化验偏好在固相绑定。的结果在活的有机体内实验报告表明狗是容易EIV和先前的报道我们实验室成员表现出一定的文明感染马已经反映在文明和EIV感染研究主要的狗和马呼吸道上皮细胞。

1。介绍

由于部分甲型流感病毒的宿主范围限制,传播的流感病毒从一个物种转移到另一个相对少见。然而,这样的跨物种传播事件确实发生了,在新宿主物种产生严重的疾病暴发。1918年“西班牙流感”是一个典型的跨物种传播与毁灭性的结果,当参与大流行流感病毒可能是直接由禽类传染人类[1]。因此,了解这些病毒的分子机制,允许跨越物种障碍和适应新的主机识别是至关重要的流感病毒都可能威胁到人类和动物的健康。尽管证据积累了多年来指示贡献通过所有八个基因片断(2- - - - - -10),检查个人病毒蛋白质的影响宿主范围限制是由几个因素复杂。例如,突变过程中经常发生在多个基因片段病毒适应一个新物种5,11- - - - - -13),虽然其中一些突变可能确实反映病毒的适应到新的主机,其他人可能被引入宿主免疫反应的压力,或者他们可能只是代表的突变。此外,跨物种传播的流感是之前经常交换两个病毒之间的基因片段,“基因重组,导致更大的遗传变异性(14- - - - - -16]。

从历史上看,狗流感并不认为是自然宿主,尽管偶尔从人类传播病毒的狗17,18)、鸟类(19),和马20.,21]。虽然,马事件(EIV)传播H3N8狗流感病毒在欧洲已报告(21),没有的EIV传染给狗在美国直到2004年的突变菌株EIV隔绝赛车灰(22,23一直保持和我们狗的数量。氨基酸序列分析表明,文明隔离始终不同于当代equine-lineage H3病毒(例如,肯塔基州/马/ / 1/1981 /马/威斯康辛/ 1/2003,科罗拉多/马/ / 10/2007)5个氨基酸残基的血凝素蛋白(HA),包括色氨酸(W)亮氨酸(L)替换在222附近残留受体结合口袋里(22,23)和7个氨基酸突变在内部基因(22- - - - - -24]。

有趣的是,最近的两项研究结果表明,文明隔离无法感染,复制和传播感染马(25,26]。此外,接种的马犬流感并没有导致临床疾病研究中,表明马遗传差异的存在,导致了“全有或全无”感染时接种EIV或文明,分别。确定当代马病毒也同样限制狗,我们评估最近EIV隔离的传染性和传输狗。此外,我们试图确定最近的受体亲和力文明隔离检查是否HA W222L突变导致受体结合的亲和力犬隔离的变更。

2。材料/方法

2.1。流感病毒

绑定化验,科罗拉多/马/ / 10/07 (Eq / CO) (H3N8) /犬/科罗拉多/ 224986/06 (Ca / CO-1) (H3N8) /犬/怀俄明/ 86033/07 (Ca /王寅)(H3N8) /犬/科罗拉多/ 2025974/07 (Ca /二氧化碳)(H3N8) /马/肯塔基州/ 1/81 (H3N8) (Eq /肯塔基州;作为尿囊液提供股票从威斯康星大学麦迪逊分校的流感病毒库)(H3N8),和一个/悉尼/ 05/97 (A /悉德;从疾病预防控制中心作为尿囊液提供股票)(H3N2)在受孕的鸡蛋或MDCK细胞培养(如前所述27,28]。Eq / CO和Ca /王寅隔绝马和狗,分别在最近的临床暴发的流感病毒在科罗拉多州,怀俄明州地区中使用在活的有机体内当代循环分离研究代表EIV和文明。

2.2。序列分析

所有基因片段培养情商/ CO和Ca /王寅隔离用于接种使用Clustal W(测序和比较http://www.genome.jp/tools/clustalw/),各自父母的病毒序列。确认氨基酸的存在差异的马和狗H3病毒,HA基因的全长蛋白质编码区域的Eq / CO, Ca / CO-1, Ca /王寅,和Ca /二氧化碳被放大逆转录pcr (RT),如前所述[29日]。这些病毒的序列比较,以及出版的马和狗流感病毒H3序列(从爆炸获得数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov),是使用Clustal W氨基酸残基的排列。此外,系统发育的比较文明和H3 EIV氨基酸序列与1000年根据最大吝啬引导使用大型5.2.2进行复制。

2.3。马和狗流感的挑战

20从商业实验室动物获得12个月大的小猎犬的狗被供应商和分配给五组之一:两个接种组(5只宠物狗/组),一个mock-inoculation对照组(四条狗/组),或两个哨兵组(三只狗/组)。学习小组分别被安置在附近的研究设施。从每个狗血清样本被证实是文明,EIV-negative接种前使用血凝抑制(HI)试验。动物接种前检查,发现临床健康良好的身体状况。狗保持依照科罗拉多州立大学研究和动物资源委员会的指导方针。一条狗从Ca /王寅接种组撤回由于与其他狗的行为问题。狗从接种组镇静dexmedetomidine然后感染经鼻气管内的直接沉积的Ca /王寅或情商/ 107组织培养感染剂量(TCID 50%50)在鼻腔和气管呼吸道上皮细胞。哨兵组介绍了和住两天后接种感染组。启动之前,本研究回顾和批准由科罗拉多州立大学机构进行动物保健和使用委员会。

2.4。临床评分

后14天挑战,21天后介绍,每个接种和哨兵狗,分别观察了20分钟为临床感染的迹象。临床评分,人数分配基于观察的嗜睡,厌食,打喷嚏或咳嗽,呼吸速率,眼部和鼻涕,如前所述26]。简单、参数评估包括总体态度昏睡(0为正常,1),食欲(0为正常,1对厌食症患者),咳嗽或打喷嚏(0没有咳嗽、打喷嚏、1不到3咳嗽或打喷嚏,和2超过3咳嗽或打喷嚏),和呼吸速率(0指示正常呼吸,1表示tachypneic, 2表示呼吸困难的)。放电被列为浆液(0)轻中度黏脓性的(1),或严重黏脓性的(2)。最低分数表明健康的动物是0,和最大的分数表明重症动物是8。直肠温度记录每天意味着挑战组之间比较。

2.5。评估病毒传染

鼻拭子采集日常一天前和接种后21天。样本被放置在1毫升的病毒传输介质和储存在−80°C,直到他们可以为流感病毒隔离处理。从140年RNA提取μL使用QIAamp病毒RNA病毒传输介质的迷你包(试剂盒、希尔登,德国)。使用先前建立实时rt - pcr检测进行循环条件(30.]。简单地说,流感病毒量化,净化全身一个矩阵(M)基因RNA被用作标准校准M基因的拷贝数。每个鼻拭子样本在重复运行。消极的控制包括整洁的运输介质处理鼻拭子标本。积极的控制由101到106TCID50Ca / CO-1蒸馏水。

2.6。血清学分析

血清从采集的血液样本接种狗在天7日,12日和19日从前哨狗接种后第7天,12日和19日引入受体破坏酶处理后准备霍乱弧菌之前通过嗨了血凝抑制抗体检测试验(27]。简而言之,两个系列稀释血清混合四红血球凝聚Eq / CO和Ca /王寅单位。化验由添加0.5%(卷/期)鸡红细胞,和HI抗体滴度读的倒数的最高稀释造成完整的红细胞凝集抑制。

2.7。病毒结合亲和力

占任何细胞培养诱导突变,唾液酸(SA)绑定MDCK细胞的亲和性,受孕的母鸡的Ca / CO-1 egg-grown股票,Ca /王寅,Ca /二氧化碳,和Eq /公司使用固相结合分析法测定(31日,32),轻微修改原来的协议来平衡病毒化验~ 20000矩阵基因副本(33,34]。的生物素化的包括Neu5Ac glycopolymers测试 2-3Gal 1-4Glc-PAA 毕奥(2,3 sl), Neu5Ac 2-3Gal 1-4GlcNAc paa 毕奥(2,3 sln), Neu5Ac 2-6Gal 1-4GlcN-PAA 毕奥(2,6 sl), Neu5Ac 2-6Gal 1-4GlcNAc paa 毕奥(2,6 sln) (Syntesome,莫斯科,俄罗斯)。所有聚合物的分子量1 megadalton,稀释1:500年前的实验。fetuin-coated和non-fetuin-coated盘子都使用,因为条件进行描述的固相结合测定尚未使用的文明和EIV隔离。每个试验在重复了四次,包括积极的情商(Eq /肯塔基州和SA / CO 2、3绑定和SA /悉德 2,6绑定)和负(工作缓冲区)控制。

2.8。唾液酸染色

调查是否犬病毒的受体结合特异性反映互补SA受体表达在呼吸道的狗,我们染色的部分捐赠犬鼻粘膜,喉、气管、支气管和肺组织获得健康的狗安乐死与SA非呼吸道相关问题 2,3-gal-specific和SA 2,6-gal特定凝集素(35,36]。异硫氰酸荧光素(FITC)标记Sambucus黑质植物血凝素(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)被用来表明SA的存在 2,6-gal,生物素化的Maackia amurensis植物血凝素(向量实验室)检测594 -链霉亲和素Alexa萤石复杂(分子探针/表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)被用来染色SA 2,3-gal受体。组织复染色了4、6 -diamidino-2-phenylindole (DAPI)。马气道组织收集从呼吸道健康马安乐死非呼吸道相关临床问题包含在染色过程作为控制,SA的模式表达式在马气管之前定义的(37]。

2.9。统计分析

分析总体平均水平的差异病毒鼻脱落,HI抗体滴度,临床分数,和感染组之间体温mock-inoculated控制,我们进行了广义估计方程,如前所述26]。简单,调整意味着差异聚集在重复措施对于每一个结果。其他结果变量(除了临床评分,排名前分析)是日志转化为满足线性和正常的主要假设。数据转换、HI抗体滴度和M基因复制与零值转换为一个数字。受体结合化验,离解常数( )病毒测定的线性回归分析Scatchard阴谋使用棱镜执行软件(美国GraphPad拉霍亚,CA)。

3所示。结果

回顾HA氨基酸序列表示五个氨基酸前所述尽可能狗适应突变(N54 K, N83S, W222L、I328T N483T) (22,23)守恒的犬类病毒培养,在这项研究中(表使用1)。相比之下,情商/公司共享前面描述的马H3共识序列(22]。系统发育分析HA基因(图1)表明,Ca / CO-1 Ca /王寅,和Ca /二氧化碳聚集与犬隔离和Eq /公司集群与当代马病毒,将他们放到前面描述不同的狗和马马H3 sublineages”佛罗里达血统。“Clustal W基因序列比对的Ca /王寅和Eq / CO隔离用于接种显示血凝素和神经氨酸酶基因的氨基酸残基之间没有差别的挑战和父母的病毒(数据没有显示)。

表1
氨基酸差异马和狗流感病毒的血凝素蛋白。五个氨基酸之前确认为EIV H3N8突变是粗体。

图1
系统发育比较H3狗和马流感病毒的基因。氨基酸分析基于最大的吝啬与引导分析(值> 50%的共识是如图所示)。挑战和受体结合分析病毒在括号中。

为在活的有机体内挑战,两个Ca /王寅和Eq / CO接种狗几乎没有临床疾病的迹象,尽管证据表明个人狗流感病毒(表2)。事实上,情商/ Co狗棚病毒感染鼻地天接种后1 - 7,而Ca /王寅狗棚病毒感染天接种(图2 - 7日2)。所有mock-inoculated狗的临床评分0,而最高的临床评分从Ca /王寅组3前哨狗6天后被介绍给接种狗和最高的临床评分从情商/ CO组2接种狗后6和13天的挑战。Ca /王寅哨兵狗的临床评分后3天6介绍和一个Ca / WY-inoculated狗观察咳嗽或打喷嚏,浆液性眼放电天介绍和后42天接种后8 - 10,分别。从情商/公司集团,狗临床评分最高的2天3和13之间有周期性的厌食症和打喷嚏接种后,和一个前哨的迹象昏睡后第三天介绍和临床评分为1。所有的狗有一个温度超过103°F的过程中学习。

表2
鼻脱落的流感病毒M基因检测实时rt - pcr和红细胞凝集抑制试验滴度Eq / CO和Ca /王寅隔离12天后病毒接种或接种狗的介绍。

图2
M基因拷贝数均值±SEM的病毒在鼻腔mock-inoculated (◯), Ca / WY-inoculated (▲), Ca /王寅前哨(△),情商/ CO-inoculated(◆)和Eq / CO前哨(⋄)的狗。实时rt - pcr的最低检测水平是1000基因拷贝/反应相应的103TCID50Ca / CO-1和由虚线表示。

虽然小临床疾病明显,血清,4/4(100%)的Ca / WY-inoculated狗有接种后第12天(平均效价1: SEM), 2/3(67%)的哨兵暴露在CIV-infected狗正嗨化验(意思是效价1: SEM)介绍(表后第12天2)。情商/ CO接种的狗,80%(4/5)有(意思是效价1: SEM)接种后第12天(表2),没有一个哨兵正嗨测定7,12日,或者介绍后19天接种狗。实时rt - pcr数据类似于嗨接种狗从两组数据,除了一个情商/ CO-inoculated狗鼻地摆脱病毒但从未有和两个哨兵狗从Ca /王寅组有谁没有脱落病毒(表的证据2)。有趣的是,流感病毒并没有检测到实时rt - pcr在Ca /王寅或情商/公司sentinel组。消极的控制没有检测到病毒,如预期。广义估计方程表明,而消极的控制,只有鼻脱落和抗体滴度均明显高于Ca /王寅和Eq / CO-inoculated狗(表3)相比mock-inoculated消极的控制。

表3
统计分析Ca /王寅和Eq /公司挑战组相比mock-inoculated消极的控制。

受体结合亲和力的实验中,除了一个/悉德,绑定只fetuin-coated板块(如前所述人类流感病毒(31日,32),所有的马和狗病毒只绑定non-fetuin-coated盘子。的2、3 sl聚合物表现出类似的绑定2、3 sln聚合物和2,6 sl聚合物不被认为是一个合适的模拟人类流感病毒受体(38),只有2、3 sln和2,6 sln数据在这里提出了适当的比较。基于近似计算 值(较低的值代表更高的亲和力),情商/ CO和情商对SA /肯塔基州证明预期绑定的偏好 2,3-gal (2、3 sln)与2相比,6 sln(图3(一个))。事实上,几乎没有绑定到SA 2,6-gal (2,6 sln)检测。同样,SA 2,6-gal控制(A /悉德)者优先2、6 sln如预期(图3 (b))。有趣的是,Ca / CO-1, Ca /王寅,和Ca /二氧化碳显示相同的绑定偏好马病毒,这是更高的亲和力SA的特征 2,3-gal (2、3 sln),只有最小的绑定,6 sln(图3 (c))。表4列出了 所有的病毒测试值与2,3 sln和2,6 sln聚合物。因为没有检测到绑定(NDB) 2、6 sln聚合物的狗和马分离线性回归Scatchard情节,我们无法确定他们 值。然而,病毒,绑定到2、3 sln聚合物表现出低 值,这表明它们有很高的绑定亲和力SA 2,3-gal。正如预期的那样,一个/悉德有一种人类受体结合偏好更高的相对亲和力SA 2,6-gal比SA 2,3-gal受体类似物。

表4
近似亲和力的马和狗流感病毒。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
α2、3 sln和α2,6 sln聚合物结合马流感(a),人类流感(b)和(c)犬流感分离测定使用固相结合分析和线性回归分析。

染色结果表明,SA 2,3-linked受体(红染色图4)气道上皮细胞上的受体主要表达了上呼吸道的马和狗。此外,SA 2,3-gal呼吸道上皮细胞上的受体主要表达了整个气管(上、中、低)和支气管的物种。这是最近发布的数据一致21]还发现SA的优势 2,3-gal犬气管。相比之下,肺泡演示了两个红色和绿色染色,表明SA 2,3-gal和SA 2,6-gal受体表达的呼吸道深处狗和马。


图4
马和狗呼吸道组织为上呼吸道(轨道交通)和下呼吸道(气管、肺)沾凝集素特有的唾液酸α2,6 -α2,3-linkages。绿色染色:反应与异硫氰酸荧光素(FITC)标记Sambucus黑质植物血凝素(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)表明唾液酸的存在与半乳糖alpha2,因素(SA)α2、6-gal)。红染色:与生物素化的反应Maackia amurensis植物血凝素(向量实验室)(检测到594 -链霉亲和素与Alexa萤石复杂;分子探针/表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国),表明SA的存在α2,3-gal。组织复染色了4、6 -diamidino-2-phenylindole (DAPI)。

4所示。讨论

我们的研究结果表明,最近EIV隔离能够感染和复制狗的主人。这是显示文明和EIV-inoculated狗在HI试验测试阳性抗体和脱落实时rt - pcr检测到病毒。相比之下,最近我们实验室的成员所做的研究26),以及其他(25),显示,文明已经几乎失去了感染的能力,复制和传播受到马。有趣的是,一个类似的传染性和复制的模式一直在观察主马和狗呼吸道上皮细胞(RECs)接种与文明和EIV隔离(26]。在这些实验中,文明和EIV同样能够感染隔离,随后在犬RECs复制,而EIV隔离在马推荐更好地感染和复制而文明隔离。具体地说,昆塔纳et al .(2011)实验表明,免疫细胞化学染色的Ca /王寅核蛋白演示了一个低传染性表型马RECs平行的显著降低M基因拷贝数相比,这些细胞Ca /王寅犬推荐(26]。综上所述,从最近的研究结果表明,有明显的宿主范围限制在马,文明没有被观察到的EIV狗。此外,马和狗推荐代表一个潜在的在体外决定宿主范围限制在EIV模型和文明的马和狗。这样的研究可能会首先阐明突变EIV隔离是如何能够感染,成为传播和维护之间的狗。

尽管狗传染性和复制的隔离在活的有机体内然而,有一些显著的差异在动力学EIV和文明的感染。所强调的表2,狗感染Eq /公司倾向于降低流感病毒基因拷贝数和摆脱病毒滴度最高的前2 - 3接种后(天)比狗感染了Ca /有限公司倾向于摆脱最高数量的病毒相对晚些时候(接种后第4 - 7天)。此外,一条狗棚EIV隔离从未有,虽然没有情商/ CO哨兵显示暴露于情商/ CO血清学的证据。相比之下,一些狗接触Ca /王寅有不显示感染病毒传染的证据。这些结果表明,尽管当代EIV狗的感染和复制实验,还有狗之间传播的障碍,这可能是由于EIV和文明的差异基因片段和/或半个早期的这些差异引起宿主免疫反应。再一次,在体外推荐的研究主要集中在细胞因子和趋化因子的响应(例如,TNF - 月初,1型干扰素和白细胞介素)EIV和文明感染可能有助于确定物种之间的壁垒两个病毒和帮助理解缺乏临床疾病接种组明显。

一个很好的描述行列式流感病毒种特异性可能解释文明宿主范围限制,并且我们希望检查在这些研究中,受体结合的偏好。尽管证据表明受体结合口袋的氨基酸序列(形成部分残留在H3病毒224年到228年)调节特定SA的流感病毒受体的亲和力39),氨基酸残基在其他网站HA蛋白也可能确定流感病毒的受体特异性。例如,最近的研究表明,人类和猪氨基酸残基222 H1,以及人类和鸟类H3病毒,可能作为关键因素结合人类受体类似物的HA蛋白(40]。的确,早期文明的研究假设,在狗,W222L文明替代流感可能在维护中发挥作用,通过调节受体结合功能(22,23]。

有趣的是,我们的试验结果表明,文明隔离固相绑定,如EIV隔离,对SA有更高的亲和力α2,3-gal相比SAα2,6-gal。这种偏好反映了SA的优势α2,3-linked受体上呼吸道和气管的狗。发现文明也有类似的受体结合整体偏好为马H3的祖先可能解释马流感病毒的自然传播的狗,发生在至少三次(20.- - - - - -22]。我们的在活的有机体内结果证实EIV仍有能力感染和复制的狗。传播EIV从感染到哨兵狗将进一步表明EIV保持在狗的能力。然而,我们的研究结果显示没有流感感染哨兵介绍EIV-inoculated集团,虽然类似的研究发现,狗可能是亚临床感染EIV当引入EIV-infected马(41]。尽管这些矛盾的报告,目前仍不清楚为什么只有前面的传输事件和所有的实验研究流感病毒导致的形成一个稳定的血统在狗的数量。

缺乏dog-to-dog EIV传播可能解释为SA受体的生化结构本身。例如,呼吸道上皮细胞的表达主要是发现了马气管α2,3-linkedN-glycolylneuraminic Neu5Gc SA受体而不是N-acetylneuraminic (Neu5Ac) SA受体(17]。另一个最近的研究由山中et al。25),固相结合进行了化验使用Neu5Gc和Neu5Ac类似物,表明有一个EIV绑定偏爱Neu5Gc SA受体相比Neu5Ac SA受体一半。然而,在相同的研究中,文明隔离测试没有偏爱Neu5Ac或Neu5Gc模拟(25],让文明的宿主范围限制在马回答的问题,因此,美国主要提出其他文明的物种特异性的决定因素。

这些潜在的宿主范围的决定因素,HA蛋白质必须被视为还调节融合病毒囊膜的膜的宿主细胞(42]。协调融合,HA进行复杂的茎部分重折叠(42]。虽然N83S替换的具体作用还有待确定,剩余83是一个扩展的一部分从中央条琥珀卷曲螺旋(由H3公顷残留76 - 105),复位和暴露了HA蛋白融合蛋白时受到低pH值(43]。正电氨基酸的替换(天冬酰胺),亲水渣(丝氨酸)可能改变蛋白质结构,可能改变哈重折叠。同样,苏氨酸的替换(极地残渣)异亮氨酸残(非极性)HA裂解位点(剩余328)(43)可能影响宿主protease-viral蛋白质相互作用,从而调节功效的膜融合和病毒进入宿主细胞。

除了HA基因,突变可能在其他RNA片段可以解释病毒适应狗。在这方面,有趣的是,序列比对发现三个突变PA(残留33、388和675)和一个突变PB2(剩余374)蛋白质不断分化的狗马共识序列。由于这些突变之前定义位于宾夕法尼亚州的功能网站(PB1结合位点、蛋白酶和帽依赖核糖核酸酶区域)和PB2 (PB1结合位点)44),很可能这些替换对文明的有效复制很重要尤其是在犬的主人。进一步的反向遗传学和定点诱变的研究是必要的,解决角色每个基因片段在文明的物种特异性。

5。结论

这里描述的研究结果有助于我们EIV的总体知识和文明的物种特异性。我们已经证明EIV仍有能力感染狗,虽然我们不能显示EIV狗在实验环境下传播。相反,正如先前报道的,文明的相反马(25,26]。另外,我们的在活的有机体内类似的结果从先前的研究细节在体外实验,文明和EIV能够感染和复制在初级犬推荐(26]。结合数据显示偏好的马RECs EIV文明相比,我们相信,我们已经开发了一个在体外模型使用主狗和马RECs未来宿主范围限制的研究可以为基础。这个模型检测可能有助于阐明宿主与病原体相互作用导致了狗流感病毒在美国人口的维护。

利益冲突

作者声明没有利益冲突的研究,本文的作者,和/或出版和没有直接金融与商业的关系本文提到的身份。

确认

作者感谢Drs。克里斯托弗·奥尔森,亚历山大Karasin、马克·布希和威斯康星-麦迪逊大学的艾伦·贝特曼与固相绑定化验技术援助和迈克尔博士这边技术援助和琥珀爱抚在实验犬的挑战。本研究是莫里斯动物基金会赠款支持于d06ca - 305)和科罗拉多州立大学研究委员会。