文摘
猫杯状病毒(流量控制阀)是一种常见的猫和一个潜在的病原体抗原多样性。本研究旨在评估和描述的防护功效FCV-F9化合价的四价疫苗,Leucofeligen,对挑战与压力无关。十9-week-old小猫接种疫苗,而10仍未接种疫苗的控制。接种疫苗的猫收到Leucofeligen两次皮下注射用三星期的时间间隔。四个星期第二次接种后,所有的猫都是挑战与毒性不同的流量控制阀和随访21天,监测他们的一般情况、临床症状和免疫学反应。在疫苗接种阶段,直肠温度和身体重量在两组之间是没有区别的。只接种猫显示FCV-specific血清转化(总和中和抗体)。第一周的挑战后,接种疫苗的猫有一个平均临床评分减少82.6%相比,控制。Leucofeligen因此显示提供一个重要的临床保护小猫挑战不同的毒性。这种保护是类似猫是否有中和抗体,表明细胞免疫的关键作用在整个保护。 This also suggests that previously reported seroneutralisation studies may underestimate the level of cross-protection against field strains obtained with this modified live FCV-F9 vaccine.
1。介绍
猫杯状病毒(流量控制阀)是一种常见的病原体的猫通常口腔和上呼吸道感染。最初的感染通常导致急性临床症状如发烧和舌或口腔溃疡,除了打喷嚏、鼻炎、结膜炎(1]。然而,猫感染流量控制阀时可能不表现出明显的临床疾病持续感染或感染时流量控制阀隔离,只是温和的致病性。其他历史流量控制阀感染也被观察到,生产各种残废或腹泻等临床症状和hypervirulent菌株引起致命的系统性疾病(VSD)诊断零星[2,3]。
流量控制阀的单链RNA基因组积极意义~ 7.7 kb。流量控制阀的复制,像其他RNA病毒,导致高比例的基因组以及抗原变异。的确整体流量控制阀的身份分离收集全球据报道,大约有80%的变量和immunodominant地区C E的衣壳基因(4,5]。这个基因组多样性产生抗原变异和主张的重要性可交叉反应的疫苗可以防止抗原不同的流量控制阀菌株。
Leucofeligen四价疫苗,是在我们实验室开发的含有减毒活疫苗流量控制阀,猫疱疹病毒(FHV-1,也称为猫鼻气管炎病毒)和作猫细小病毒(废票),以及猫白血病病毒的重组抗原下岗通知(FeLV)。
当开发这种疫苗,我们决定评估流量控制阀化合价的保护效果与一个不相关的毒性不同的挑战压力并试图描述保护性免疫反应的性质。
2。材料和方法
研究依法进行了良好的实验室实践指南,而且按照建议发表在欧洲药典(6]。
2.1。动物和研究协议
二十specific-pathogen-free (SPF)欧洲小猫,9周大,被随机分配到两组:控制(未接种疫苗,以下指定C组)和接种疫苗(以下指定组V)。猫是动物适应6天的住房条件(12 h光/暗周期,18±3°C,湿度55±10%,免费获取水)。每组被安置在一个单独的领空在动物住房设施。
集团V猫在抓捕接种两次间隔(0天21)通过皮下注射(1毫升)根据制造商的建议。为了更好地评估当地的宽容的注射,第一次注射的肩膀和臀部之间的一半在右边,左边是用于第二次注射。C组猫没有收到任何注射。
四个星期第二次接种后,49天,相当于postchallenge时间0 (= pct0),所有的猫都是挑战杯状病毒的毒性不同的应变(流量控制阀- 255)。猫第一次被麻醉,然后接种鼻内TCID50/流量控制阀的猫- 255暂停使用体积为0.25毫升/鼻孔。
2.2。测试疫苗
Leucofeligen被授予一个泛欧洲的市场营销授权(集中过程)在2009年。它提出了包含病毒减毒活疫苗冻干分数,也就是说,流量控制阀(F9) FHV-1 (F2)和废票(LR72)和液体部分包含FeLV-envelope重组抗原(来源于gp70 FeLV)下岗通知氢氧化铝和QA-21佐剂。冻干分数的calici化合价是制定至少接受了这种疫苗的滴定度。疫苗储存在瓶°C和立即重组之前使用补水冻干分数与液体分数。
2.3。监控
在疫苗接种阶段,是猫每天监测的一般健康状况(食物摄入量、粪便的外观和行为/抑郁)。动物们每周称重。在postchallenge阶段,临床检查日报和临床状态评估根据评分系统是基于药典专著中指定的(6)(见表1)。为对比组,使用两种方法:最大的临床评分(以最高得分记录为每个参数在每个猫)被用来评估临床情况的严重程度的差异,以及累积分数(添加分数记录每一天为每一个参数在每个猫)被用来评估每个信号的持续时间的影响。这两种比较,得分直肠温度、溃疡,鼻涕,包括眼部分泌物,减肥。作为减肥代表一个单一的分数pct7天(代表损失,比上周)它有相同的影响最大和累积分数。
收集血液样本从裸管的动物血清学评估天0,21岁,35岁,49 (= pct0), 56 (= pct7), 63 (= pct14)和70 (= pct21)。
2.4。血清学评估
涉及的血清学评估分析免疫球蛋白anticalicivirus抗体(Ab)和anti-calicivirus中和抗体滴定度(NAb)。
2.4.1。免疫球蛋白Ab
滴定度对杯状病毒免疫球蛋白进行评估使用immunofluorescent抗体测定。短暂,50µL双倍稀释血清(1/64至1/8192)添加到96孔板包含acetone-fixed CRFK FCV-F9感染细胞。50µL阴性血清的阳性血清和50µL稀释以同样的方式,作为控制。他们孵化1小时37°C和揭示fluorescein-conjugated antifeline IgG抗体和伊文思蓝的一个解决方案。积极的阈值是1/128。
2.4.2。中和Ab
同源FCV-F9 NAb的滴定度测定。短暂,50µL每个血清稀释了课时/本人的媒介提供6倍稀释步骤之间的1/8和1/256。每稀释200µL孵化1小时200µL FCV-F9悬挂的浓度大约100 TCID50允许病毒中和。50µL的混合物被添加到6盘的一个96孔板含有70%汇合的CRFK细胞。6天的潜伏期后,细胞病变效应特征评估。滴定度是由斯皮尔曼和Karber方法(7),视为消极当不如0.9检测阈值。
2.5。统计测试
所有统计分析软件包使用s + 6.2(有见地,巴黎)。直肠温度的比较,身体重量,和临床V C组和组之间的成绩,学生的测试,片面Wilcoxon等级和测试,和/或片面Dunnett方法应用。一个值< 0.05被认为是重要的。
2.6。伦理批准
这项工作进行的监督下Virbac伦理委员会,依照官方欧洲药典的要求(6]。
3所示。结果
3.1。接种阶段
3.1.1。一般健康参数
在疫苗接种阶段(0到49天),所有的猫仍在正常健康与身体重量增加稳定和正常的身体(直肠)温度。没有指出异常的总体或局部反应的疫苗接种。
3.1.2。临床症状
没有任何猫显示两组临床症状在疫苗接种阶段。
3.1.3。免疫反应
时间的Ab FCV-F9疫苗接种引起的反应(天0-49,疫苗接种阶段)如图1(anti-FCV-NAb)和图2(anti-FCV-IgG抗体)。关于anti-FCV-NAb反应(图1白天猫),所有接种疫苗有35。在49天(pct = 0),然而,与滴定度小于或等于5猫回到Nab负面。所有控制猫仍严格Nab -在同一时期。
NAb反应相比,anti-FCV-IgG反应引起统一和强大的方式在所有接种猫白天35和他们保持高49天(图2)。
3.2。Postchallenge阶段
3.2.1之上。一般健康参数
在挑战的开始阶段(pct0),身体的重量没有区别的两组()。第一周的postchallenge (pct0 pct7)阶段,身体的重量9 C组的10个猫下降(平均体重的6.75%),与集团V猫保持正常的体重增加体重(平均4.66%)模式在此期间(图3)。体重增加或减少的百分比的差异后的第一个星期组之间的挑战是非常重要的()。
在同一时期,高热(> 39.4°C)观察每一只猫在C组的至少2天,4的10只猫呈现峰值至少40°C和其中一个维持直肠温度> 40°C为4天。相反,在集团V瞬态峰值,持久不超过1天,观察10只猫在7。3的只有39.5°C,没有一群V猫达到40°C。直肠平均气温明显不同的两组之间天挑战(后3到5在0.0002和0.0137之间),显示在图4。
3.2.2。的临床症状和比较分数
在第一周后流量控制阀的挑战(pct0 pct7)之间的显著差异是观察组关于临床症状的发展。
九的10 C组猫发达口头和/或鼻溃疡:4猫的最大比分3(对应于大型和/或无数ulcers-see表1)有一个保持这种最高得分12天,另5猫有分数1(对应于小溃疡,数量不多)。相比之下,只有一只猫在V组口腔溃疡发展得分3只(4天),另有4人开发的轻度溃疡得分为1。目镜观察放电在C组猫但从未接种疫苗的猫。鼻涕是更为常见,影响C组5只猫,但又没有集团V猫了鼻涕。
一般来说,猫群V发达大大减少临床体征和大大缩短持续时间与控制猫(图5)。最大的临床评分后的第一个星期的挑战在V组与C组相比显著减少:降低平均为80% ()。的减少值累积临床分数也是重要的82.6% ()(表2)。
后第一个星期后挑战,完全像预期的那样,大多数猫迅速改善。然而,累积分数溃疡pct8和pct21之间仍明显不同()在接种组降低95.0%。
3.2.3。免疫反应
后,不等的FCV-challenge 49天(= pct0),意思是同源NAb滴定度(图1大幅上涨(6.6倍)接种组。一只猫在这个集团有一个无法探测NAb滴定度挑战的时候,有一个延迟,只有适度的外观NAb滴定度pct14后才可检测到。然而,这只猫的唯一迹象指出在整个挑战时期是一个非常轻微的上升0.1°C以上的直肠温度阈值在一个场合。另4猫无法探测NAb滴定度挑战时对pct7 reseroconverted。控制猫仍Nab消极整个挑战时期除了一只猫引起Nab pct14和pct21的检测水平。
anti-FCV-IgG的刺激反应(图2组中)V猫是快速和大量增加了5倍的意思是滴定度后第一周的挑战。anti-FCV-IgG应对挑战C组猫开始,但随后迅速而强烈。从pct14,所有10只猫开发大量anti-FCV-IgG的滴定度一个非常统一的方式,在与虚拟没有逮捕。由anti-FCV-IgG pct21滴定度达到类似水平甚至高于接种疫苗的猫。
4所示。讨论
由于流量控制阀的变量性质,cross-protect对抗能力无关的一种有效疫苗株是一个关键的要求(1]。这项研究的目的是评估和描述最近批准的联合疫苗的保护效果,Leucofeligen,不等的致命的挑战。在本研究小组V猫也有(NAb)产生其他生活微妙(FHV和废票)疫苗接种后,与C组猫,其中没有一个有FHV或废票(数据没有显示)。的保护功效Leucofeligen关于FeLV价,这是之前评估和报告(其他地方8),没有在这个评估研究。
流量控制阀的选择- 255不等的挑战压力是合法由于不同的两个病毒株。看来,最大的不同在杯状病毒检测池在30%5),而一项研究表明,流量控制阀- 255和F9只有70%在地区E的衣壳蛋白同源性,这是一个类似的亲缘水平与其他高度多样化的菌株包括一些高毒性菌株进行研究[9]。seroneutralisation的一项研究进行血清提高流量控制阀- 255和F9,很明显,在田间菌株中和抗体稀释的滴定度最高的血清很少有相应的滴定度高的血清(10]。
临床水平的保护取得了在这个研究非常令人鼓舞。目前的指南(11)表明,在高风险的环境中,如救援避难所,我们可以合理地指望猫杯状病毒疫苗提供大约60 - 70%的保护由于较高的风险。在这项研究中暴露在高剂量保证直接鼻内政府的致病性病毒。因此实现一个分数中值减少82.6%在第一周后挑战在这种情况下是一个很好的结果。疾病是自限性的免疫活性的猫,猫和最开始愈合自发在7到10天疾病的发病后,第一周后的挑战是最合适的时间来评估由于接种疫苗获得的好处。
最明显的迹象的宠物所有者(鼻涕、眼分泌物和减肥)完全阻止了在此期间。同样严重的发热可能导致明显的嗜睡和不适也完全预防。在这种情况下,它可以指出,在FHV的专著,严重的高热(40°C或更高)给出更高的分数,让这个标志的严重程度是反映在最终的分数12]。我们仍在本研究中使用的流量控制阀得分专论,但最近FHV专著中使用修改后的分数被使用,群体之间的差异会更大因为疫苗完全阻止严重的高热。
溃疡是明显的主人只有当普遍和严重。因此减少持续时间和严重程度的溃疡也意味着一个所有者不太可能会意识到这些溃疡在绝大多数情况下接种疫苗的猫。完成预防溃疡预计不会在这样一个研究与高剂量的致病性病毒的直接管理。事实上我们可以假设粘膜IgA的水平需要阻止这样的剂量的病毒不太可能实现,这意味着一些细胞病变效应是不可避免的。然而,减少溃疡和发烧的严重程度和持续时间可能是两个参数的最有利于动物的福利,使用流量控制阀疫苗的主要原因之一。
血清学反应后除了临床反应也是非常有趣的在这个研究。免疫球蛋白抗体滴定度上升到高水平在挑战阶段在这项研究中,所有的猫无论临床症状的严重程度,因此似乎是一个简单的标志暴露于病毒和不显示有用信息的保护级别。
在疫苗接种阶段(天0-49)的研究中,接种疫苗产生的anti-FCV-NAb猫的滴定度既不高也不长久的。这是非常符合先前发表的工作,在研究基于seroneutralisation所需使用的改变和强烈的协议的接触疫苗株诱导足够高滴定度允许cross-neutralisation化验(执行9,10,13- - - - - -15]。这就提出了一个可能性,一些中和反应在这些研究中也可能是由于其他非特异性,在通常接种疫苗免疫机制未见猫(10]。
不等的挑战的时候,猫在我们的研究水平检测的逮捕是防止严重的疾病。然而,相比之下,半数的接种疫苗的猫没有被逮捕,而缺乏NAb不是与对感染的易感性。
结果,我们可以得出结论,高NAb滴定度似乎函数作为一个标记,一个活跃的免疫反应已经产生,但可能不是保护剂对这种病毒的关键。缺乏NAb滴定度愈合(大概因此免疫)控制猫强烈支持这一结论。
这样的结果或许并不完全出人意料。事实上抗体保护而言,循环抗体有最小的利益提供保护粘膜病毒而言,那里的IgA粘膜抗体水平也许会更有趣如果可以准确测定这些。更重要的是,使用修改后的活疫苗时,人们普遍认为细胞免疫可能是一个主要因素在疫苗引发的保护16]。
在一项研究中关注二价灭活疫苗(9),作者发现没有中和抗体滴定度之间的相关性及临床保护,尽管高抗体滴定度预测的临床保护。然而,当一个阻断ELISA试验,他们发现,在这种情况下,有明显的滴定度两个灭活流量控制阀菌株出现在疫苗中,有89%的预测价值减少的临床评分至少50%。使用的灭活疫苗不太可能引起强烈的细胞反应。综上所述,我们的结果和波利特et al。9)可能表明,尽管抗体水平可以预测跟踪使用灭活疫苗时,他们大大低估了跟踪使用修改住F9疫苗时,可能由于细胞介导的免疫反应中发挥更大的作用。
NAb滴定度的相关性这一发现也证实了需要执行确认挑战研究才能得出有用的结论流量控制阀的疫苗的功效。有趣的也会在将来的研究中进一步观察特定细胞介导免疫参数。
5。结论
疫苗,我们的研究表明,组合Leucofeligen,可以提供一个保护效力(减少临床评分)的82.6%在接种疫苗后的第一个星期挑战小猫与毒性不同的挑战。宠物主人最明显的迹象(鼻涕、眼分泌物和减肥)完全避免在这段时间里,就像严重的发烧可能导致明显的嗜睡或不适。高的中和抗体滴定度似乎表明保护,但NAb的缺席并不表明磁化率,表明这种疫苗细胞介导免疫的作用。因此出现,当修改住F9疫苗使用,在体外seroneutralisation研究可能低估了跟踪的水平,可以实现对菌株在活的有机体内。
利益冲突
本文涉及到的性能由Virbac制造疫苗。本文的作者都是受雇于Virbac,也资助了这项研究。