文摘

本研究评估的影响进行牛磺酸在精子的运动性,生存能力,总精子异常,acrosomal和质膜完整、酶等资料减少谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)、生化资料如胆固醇流出和丙二醛(MDA)的生产。共有50个射精收集每周两次从8 mithun公牛,和精液是分成4整除和稀释TEYC extender相等。组1:精液没有添加剂(控制);组2到4:精液稀释了25毫米,50毫米,分别和100毫米的牛磺酸。重要参数和酶和生化资料评估在5°C。包含牛磺酸为稀释剂导致显著()减少的百分比死精子,精子异常,acrosomal异常后液体存储与对照组相比。此外,牛磺酸在50 mM mithun精液质量的显著改善比存储在牛磺酸在25岁或100毫米在体外在5°C。得出结论,牛磺酸的保护作用可能对精子从增强抗氧化酶的功能参数,防止胆固醇流出细胞膜MDA和减少生产。

1。介绍

Mithun (Bos额的)是一个semiwild自由放养,罕见的牛物种现在希尔(NEH)东北部地区的印度。它被认为是起源于8000多年前的印度野生白肢野牛(Bos gaurus)[1]。动物具有重要的社会、文化、宗教、部落人口的经济生活,尤其是在美国的* *,那加兰邦,曼尼普尔邦、米佐拉姆邦2]。最近的统计数据表明,mithun人口逐渐减少由于缺乏合适的饲养牛,密集的近亲繁殖增加实践,减少放牧的土地面积,缺乏合适的繁殖和饲养管理。需要更大的努力从四面八方保留mithun人口提高本地区的社会经济地位。mithuns以来还没有完全驯化的自然繁殖与陪同练习在这个物种局限性如成本和疾病传播。因此,使用改进的人工授精是至关重要的。

冷藏的精液是用来减少代谢和维持精子生存一段时间。extender发展研究都集中在膜稳定化合物,抗氧化剂,冷冻保护剂。据报道,新鲜mithun精液可以成功保存在5°C 3天使用tris-egg yolk-based extender没有甘油(3]。但在这个扩展存储精液质量的恶化。这种下降的一个原因是由于行动的活性氧(ROS)生成的细胞组成部分精液,即超氧化物阴离子自由基和过氧化氢(H₂O₂)[4,5]。此外,牛精子膜容易损坏是由于多不饱和脂肪酸含量高的精子膜和缺乏一个重要的抗氧化系统在细胞质中6]。这使得牛精子特别容易受到脂质过氧化(法律流程外包)的ROS (7]。邦萨尔和Bilaspuri8]最近审阅的氧化应激和抗氧化剂对精子功能的影响,并解释了各类抗氧化剂的影响。脂质过氧化的影响包括不可逆损失的能动性,精子DNA损伤,降低生育率(4,9]。近年来,研究也一直在进行牛精液稀释剂,包括添加剂,如牛磺酸、海藻糖、硒、谷胱甘肽,猫,SOD、GPX,和表面活性剂的化合物,以改善运动性,可行性,精子膜完整性(10,11]。

添加抗氧化剂如牛磺酸绵羊的精子(12],猫科动物精子[13),和兔精子14)已被证明保护精子免受活性氧的有害影响和提高精子的运动性和精子膜完整性在液体存储。氨基磺酸氨基酸和非酶的清道夫,扮演着一个很重要的角色,对活性氧保护精子,如果暴露在有氧条件和储存在4°C下冰箱(12- - - - - -14]。近年来,牛磺酸作为抗氧化剂在精液中使用的填充剂,低温贮藏的野猪15,牛16,人类17),ram (18),和山羊精子19改善运动性,可行性,膜完整性和生育能力的精子通过抑制脂质过氧化作用,保护细胞免受活性氧的积累20.,21]。此外,精读文献透露任何信息的添加牛磺酸对维护精子活力的影响在低温液体储存mithun精液。因此,本研究的目的是评估此添加剂的重要参数的影响,MDA生产、胆固醇流出,和抗氧化剂谷胱甘肽等,SOD、GPX猫,和总抗氧化能力(TAC) mithun精液。

2。材料和方法

2.1。动物和精液收集

八显然健康mithun公牛,大约4到6岁,选择从一群来自印度的各种NEH地区的丘陵地带。公牛的平均体重为501公斤(493到507公斤)在4年,增加到530公斤(523到538公斤)在6岁的时候有很好的身体条件(得分5 - 6)保持统一喂养下,住房,和照明条件在国家研究中心在Mithun Jharnapani,那加兰邦,印度位于25°54′30′′北纬15和93°44′′′东经海拔范围250 - 300实验室。每个实验动物随意提供饮用水和30公斤混合丛林饲料(18.4%干物质和粗蛋白10.2%)和4公斤集中(87.1%的干物质和粗蛋白14.5%)富含矿物质的混合物和盐。精液被直肠按摩收集的动物。催产素(5 IU,肌内)注射前直肠触诊。短暂,精囊集中和落后地按摩5分钟之后温和的挤奶的壶腹3 - 5分钟,导致勃起和射精。在收集过程中,最初的透明分泌物被丢弃,整洁收集精液滴在试管中毕业的帮助下一个漏斗。在研究过程中,所有实验协议满足机构的动物保健和使用委员会制度。

2.2。精液处理和评价

共有50射精收集通过直肠按摩从mithun每周两次的实验动物,和精液池消除个体差异。后立即收集、样本保存在一个浴缸在37°C和评估体积,颜色、一致性、质量活动,并获得初步评估后,受到初始样本稀释与prewarmed (37°C)柠檬酸三羟甲基氨基甲烷蛋黄液extender (TEYC) (tris-hydroxymethyl甲胺3.028% ()、柠檬酸钠1.655% (w / v)、果糖1.250% (),蛋黄20% ();100000 IU青霉素G(钠盐)和100毫克双氢链霉素被添加在100毫升的缓冲区)。部分稀释样本然后带到实验室在一个绝缘瓶包含温水(37°C)进行进一步处理。射精是评估和接受评估如果下列条件得到满足:浓度:> 5亿/毫升,质量活动:> 2.5 +,个人能动性:> 70%,和总形态异常:< 10%。

每个池射精分成4个相等整除与牛磺酸和稀释TEYC extender。组1:精液没有添加剂(控制);组2到4:精液,25毫米,50毫米和100毫米的牛磺酸,分别在最后一个25×10的浓度⁶精子每毫升。然而,pH值调整到6.8 - -7.0稀释剂的使用磷酸缓冲溶液。精子浓度测定的帮助下一个血球计22]。稀释精液样本保存在玻璃管和冷却从37到5°C, 0.2 - -0.3°C /分钟的速度在寒冷的内阁和维持在5°C在液体储存的实验。精子的运动性的百分比、可行性、总精子异常,acrosomal完整性和质膜完整性通过hypo-osmotic肿胀试验(主机)决心按标准程序在存储精液样品在5°C。精子的运动性是评估通过分析四到五个领域的样品放在prewarmed幻灯片(37°C)下prewarmed盖玻片(37°C)使用亮场光学(尼康,Eclipse 80我;放大400倍)。进步的能动性,决心之前存储的样本在37°C水浴加热5分钟。

活精子的数量是决定使用eosin-nigrosin污点5% ()nigrosin水溶性,0.6% ()伊红黄水溶性、3%柠檬酸钠脱水、过滤和pH值调整到7.0 0.1不通过添加几滴₂阿宝₄或0.1 Na₂HPO₄根据先前所描述的方法(23)使用亮场光学(尼康,Eclipse 80我;放大1000倍)。精子(eosin-nigrosin染色;200 /样本)也被评估在亮场光学(尼康,Eclipse 80我;放大1000倍)形态学异常。Acrosomal完整性评估染色染色所描述沃森(24]。

主机被用作补充测试可行性评估协议评估精子质膜的功能完整性。主机依赖于膜的阻力损失的渗透率应力条件下的肿胀hypo-osmotic介质(25]。精子细胞和抗膜表现出肿胀在尾部鞭毛变得卷曲,并维持膜肿胀泡沫卷鞭毛。试验是由混合30μL 300年的精液μL 100 mOsm /公斤hypo-osmotic解决方案(9 g果糖+柠檬酸钠4.9克每升蒸馏水)(26]。这个混合物是孵化(37°C) 1 h,和0.2毫升的混合物被放在显微镜幻灯片和安装用盖玻片和立即评估(尼康,Eclipse 80我;在相差显微镜下400×放大)。总共有200个精子在至少五个不同的微观领域的计算。精子的比例与肿胀和卷曲的尾巴被记录下来。

抗氧化剂资料如谷胱甘肽、GPX,猫,SOD, TAC,和生化资料如总胆固醇、glucose-6-phosphate脱氢酶(G6PD或G6PDH)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转氨酶(ALT)被商用诊断包估计,而法律流程外包的精子和精浆测定MDA通过确定生产,使用硫代巴比土酸(稍后通知)按照Buege和欧斯特法27)由苏莱曼和修改等。28]。

2.3。统计分析

结果统计分析和表达为均值±SEM。意味着被单向方差分析分析,其次是图基的事后测试来确定四个实验组,每组之间的显著差异,也就是说,与添加剂或精子参数没有添加剂使用SPSS / PC计算机程序(15.0版本;SPSS,芝加哥,IL)。价值观的差异后被认为是统计上显著的反正弦转换比例的数据用SPSS 15。

3所示。结果

不同剂量的牛磺酸对精子的运动性,可行性,acrosomal和质膜完整性在液体存储(5°C)呈现在图1。结果显示,包含牛磺酸为稀释剂导致减少()的百分比死精子,精液精子异常,acrosomal异常样本检验在不同时间的存储时间与对照组相比。均随着时间的推移,意味着总精子畸形,,,分别控制,25毫米,50毫米和100毫米taurine-treated mithun精液。此外,牛磺酸在25和100毫米不如牛磺酸50 mM的治疗这些特征,并有显著(牛磺酸在25和100毫米)区别这些反应。抗氧化剂酶配置文件显示,最高意味着SOD和CAT,谷胱甘肽(图2TAC(图),GPX活性4),G6PDH(图5)被记录在牛磺酸治疗精液比对照组和不同(团体之间)。胞内酶如AST、ALT(图3)降低(牛磺酸治疗精液。同样胆固醇流出(图3生产(图)和MDA2)之间的差距显著牛磺酸治疗和控制和降低牛磺酸治疗组。很明显从这个实验的数据添加牛磺酸、特别是在50 mM,精液稀释剂导致的质量显著提高,抗氧化物酶活性,减少胆固醇流出和MDA mithun精液储存的生产在体外在5°C。

4所示。讨论

在目前的研究中,结果显示,添加牛磺酸精液参数有所提高,抗氧化剂和生化的mithun精液,因此有效地保护精子的结构和功能。因此,它可以提高质量的精液人工授精过程期间保持有效。我们所知,这是第一次报告的牛磺酸对重要参数的影响,抗氧化的酶和生化mithun精液的概要文件。分析各种重要参数如向前进步的能动性、宜居性、和acrosomal和质膜完整性是重要的广泛利用的精液人工授精,和这些参数显示治疗组之间的显著差异。牛磺酸在精液保存的有利影响是由于它是一种非常有效的抗氧化剂29日]。磺化氨基酸、牛磺酸、附睾的和输卵管液,是一种重要的保护细胞对抗活性氧的积累暴露在有氧条件下(14,30.]。在目前的研究中,牛磺酸对这些参数的影响是类似的其他研究人员获得的结果,观察补充牛磺酸的保护解冻兔(14),ram (12精子,frozen-thawed ram (11]。

因为哺乳动物精子膜具有较高的多不饱和脂肪酸,它呈现的精子很容易受到法律事务外包,因此发生的氧化膜的脂质部分减少氧气分子,如和H₂O₂。脂质过氧化物通过改变精子的运动性,损害精子功能膜完整性和精子DNA损伤和生育通过氧化应激和细胞毒性醛的生产(31日]。此外,精浆的抗氧化系统和精子精液处理期间被破坏(32]。因此,加入外源性抗氧化剂可能调节抗氧化系统的精液。

本研究的结果表明,添加50 mM牛磺酸改善mithun精液保存质量保持在5°C。精子的运动性是减少了存储和保持超过50%的时间长达30小时。相比之下,递减率能动性比例高的精液样本100毫米牛磺酸治疗或没有牛磺酸。据报道,冷冻精液质量下降随着时间的推移,适合使用30小时根据运动和形态(3,33]。精液质量的提高,添加外源牛磺酸记录在本研究之前报道的形式在公牛精液能动性和完整acrosomal膜(34]。此外,50 mM牛磺酸的百分比显著改善精子的生存和完整的质膜(29日]。

牛磺酸有助于维持正常的顶体的完整性(34)和稳定精子的质膜,所以增加的能动性。牛磺酸、精子细胞,能够与许多活性氧反应直接保护哺乳动物细胞免受氧化应激,从而维持精子的运动性(18]。因此,在这项研究中,试图提高精子细胞的能动性和可行性将牛磺酸在液体存储(13,14,27)和冷冻精液的形式(29日]。

此外,它保持等离子体,线粒体膜的完整性和细胞骨架结构的鞭毛的精子细胞保护效应。牛磺酸还保护精液extender (SOD和CAT水平18),这有助于保持精子的膜运输和生育能力。axosome和相关致密纤维的中间部分精子被线粒体覆盖,从细胞内的ATP生成能量。这些都是负责精子的运动性(35]。根据我们的结果,我们可以假设添加剂牛磺酸显示保护作用axosome和线粒体的功能完整性,提高精子的运动性mithun精液的液体存储。

AST和ALT是必不可少的对于生存提供能量的代谢过程,能动性,和生育精子,精液的转氨酶活动好的精液质量的指标,因为他们测量精子膜的稳定性36]。因此,提高异常精子液体存储导致高浓度的氨基转移酶酶在细胞外液由于精子膜损伤和减轻酶泄漏从精子37]。此外,减少AST和ALT活动精浆和精液的牛磺酸治疗精液可能是由于它保持结构稳定的精子38]。在目前的研究中,AST和ALT水平低牛磺酸治疗精液回稳,顶体精子膜完整性,等离子体,线粒体和鞭毛的精子。

谷胱甘肽(L-g-glutamyl-L-cysteinylglycine;谷胱甘肽)是最丰富的非蛋白硫醇在哺乳动物细胞和存在主要在简化型(谷胱甘肽),只有少量的氧化形式(GSSG)。谷胱甘肽抗氧化系统包括减少谷胱甘肽氧化GSSG,谷胱甘肽还原酶(研磨),GPX, glutathione-s-transferase。接地的刺激减少GSSG谷胱甘肽。这样可以确保稳定供应的还原GPX衬底(NADPH)。G6PD的转换需要辅酶ii NADPH,叫做精子和精浆的谷胱甘肽氧化还原循环。在目前的研究中,谷胱甘肽和GPX更高的精浆中牛磺酸添加精液(9,18,34),因为他们保持mithun的抗氧化系统在液体存储精液。

过氧化氢酶是4多肽链的四聚物抗氧化中发现几乎所有生物体暴露在氧气。它来源于附睾、精囊和解毒作用内部和细胞外的H₂O₂通过减少H₂O, O₂(39),它还可以防止运动性的损失造成的精液中白细胞产生的ROS (40]。同样,SOD催化超氧化物歧化作用为氧气和过氧化氢。它生长细胞外和细胞内超氧化物阴离子和防止质膜的脂质过氧化作用。SOD自发歧化酶阴离子形成O₂和H₂O₂。草皮也防止过早hyperactivation和精子获能超氧化物自由基引起的射精前(41]。在目前的研究中,浓度较高的SOD和CAT的牛磺酸治疗精液。但通常情况下,精浆是一种强有力的抗氧化剂来源,SOD (42]。高水平的容易peroxidizable多不饱和物质使精子过多的氧化应激,以及精子的SOD活性样品是一个很好的预测出他们的存活时间。牛磺酸,当应用于50 mM的剂量,改善精子的运动性期间保存并显示抗氧化性能,提升猫级别,与SOD浓度,类似于兔进行的一项研究[14和公牛精液34]。此外,牛磺酸、渗透性冷冻保护剂,作为一种抗氧化剂,引起膜脂质和蛋白质重排,从而导致膜流动性增加,更大的在较低温度下脱水,因此增加精子的生存能力在这保存(43]。这可能是原因之一改善运动性,可行性,精子膜完整性,稀释精液extender牛磺酸的存在。

G6PD或G6PDH胞质酶磷酸戊糖途径的代谢途径,减少能源供应细胞通过维护辅酶的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。NADPH反过来维持这些细胞谷胱甘肽水平,帮助保护细胞免受氧化损伤。在目前的研究中,G6PDH水平更高的牛磺酸治疗精液中表明它增加抗氧化剂谷胱甘肽的功能和葡萄糖/果糖利用率的精子细胞会导致精子质量高(44和对sperm-fertilizing能力至关重要45]。

牛磺酸可以防止胆固醇流出精子膜和MDA在稀释剂生产这表明它可以防止过早精子获能和acrosomal反应作为一种抗氧化剂。随着磷脂、胆固醇是细胞所必需的物理完整性,确保细胞膜的流动性。在精子膜胆固醇扮演着特殊的角色,因为它释放精子膜启动过程中的关键步骤精子获能和顶体反应,对施肥是至关重要的46]。此外,稀释剂添加胆固醇解冻之前增加精子freezing-defreezing过程造成的抗压力,保护精子能动性和施肥潜力(47]。在目前的研究中,胆固醇和MDA的流出生产减少治疗组相比,控制治疗组(18,29日,34,48]。所以,精液样本用牛磺酸治疗会有高cryoresistance比未经处理的对照组。在目前的研究中,观察到精子参数,在50 mM的牛磺酸明显高于对照组。

在这项研究中,观察到精子质量改进可能归因于防止过度生成自由基,产生的精子本身,通过抗氧化牛磺酸的属性。认为可能的保护作用的补充牛磺酸增强抗氧化酶含量和防止胆固醇和磷脂的流出细胞膜和MDA生产。因此,它可以保护你的精子在这个物种保护和提高生育率。未来的精子保存/证实目前发现冷冻保存的研究是必要的。