文摘
口咽和泄殖腔拭子从117俘虏psittacine鸟类在兽医诊所(88)和从避难所/野生动物救援中心(29)收集确定的流行c . psittaci在捕鸟在哥斯达黎加。样品收集在2009年从共有19种不同种类的鹦鹉,Ara澳门(33),Amazona autumnalis(24),Amazona ochrocephala(21)Ara ararauna(8)是最具代表性的物种样本。c . psittaci中检测出4个(3.4%)鸟类使用分子检测(PCR)。正样本属于鸟类在兽医诊所;他们三个都是Ara澳门和一个Amazona ochrocephala。三只鸟是成年人;所有积极的鸟类没有显示任何疾病症状与其他鸟类和住在家里,两个在圣何塞和两个在埃雷迪亚。测序被用来证实PCR阳性结果,表明两个样品c . psittaci属于基因型,代表第一个报告的存在基因型在哥斯达黎加。这种细菌的检测俘虏psittacine鸟类显示有潜在风险人们生活或有接触,有可能感染其他鸟类。
1。介绍
鸟类所造成的衣原体psittaci、革兰氏阴性细菌细胞内,与9个已知基因型(f E / B、M56和WC) (1]。c . psittaci中已经发现了465种鸟类(2),但最高的感染率在鹦鹉(鹦鹉科和鸽子鸽形目)。鹦鹉的患病率在16%和81%之间(不同3- - - - - -5]。临床感染的发展依赖于自然感染病毒和宿主物种。无致病力的菌株一般产生在成人无症状感染鸟类,这些可能排泄机体几个月。经常可以发现大量的代理或间歇性粪便,泪的液体,鼻排放,口咽的粘液,作物的牛奶受感染的鸟类(6]。
长期和亚急性临床形式是常见的。极端环境变化或并发感染可能会导致出现临床症状。鸟类所提出了从非特异性临床症状到严重系统性疾病,后者尤其是年轻的动物;嗜睡、厌食症、脱水、抑郁、高热、鼻和眼部放电,异常分泌物,绿色腹泻主要是报道(6,7]。
所有c . psittaci基因型可以传染给人类,他们也导致疾病叫做鹦鹉热或鹦鹉热(7]。这可能发生传播通过吸入或直接接触受感染的鸟类(8]。在人类疾病可能会有所不同从非特异性症状类似流感重症肺炎。心内膜炎和脑炎病例也被归因于这种细菌(9]。
使用一系列技术诊断:血清学技术包括免疫荧光、补体结合,immunoenzymatic化验。血清学技术的主要缺点是无症状的鸟类,它仍然排泄剂,一般低抗体滴度。此外,抗体的检测在鸟类只表明接触代理;不可能使用这种方法来确定鸟类的活动载体的细菌感染或清除前一个8]。之间的直接技术隔离细菌通过文化真品,水牛绿猴、或鸡肉细胞系所被认为是金标准诊断(10]的优势是它的敏感性,因为它可以检测少量的微生物后两个或三个段落(6]。缺点是它需要一个生物安全三级实验室。因为许多隐性携带者和鸟类衣原体有机体分泌断断续续在粪便和其他分泌物,单个样品分析可能产生错误结果(11,12]。
直接immunoenzymatic测试也很有用;他们报道高特异性;然而至少600小学的身体需要在示例中,为了避免假阴性结果(13,14]。聚合酶链反应(PCR)代表一个特定的,敏感的,和快速检测技术c . psittaci(15]。特别开发的嵌套PCR Kaltenbock et al。16)显示的灵敏度高于其他协议(17]。和之前一样,直接检测技术的缺点是,代理是排泄间歇性地(11]因此集合多个样品的建议两到三天。因此,只有一个积极的结果通过直接的技术是100%可靠的诊断c . psittaci。最后,小鸟,已经开始用抗生素治疗可能显示假阴性结果,因为感染水平低于检测的限制(18]。如果不进行治疗协议显示(4或6周取决于选择的抗生素和剂量)鸟又能排出的细菌。
在2001年进行的一项研究在哥斯达黎加检测到抗体c . psittaci129年12.39%的金刚鹦鹉(Ara澳门和Ara ambigua被囚禁)使用ELISA (19]。本研究的目的是检测和描述c . psittaci利用分子技术(PCR和测序)在哥斯达黎加psittacine鸟类被囚禁。
2。材料和方法
2.1。大小、类型的样本和数据收集与分析鸟类
大约140.200鹦鹉,鹦鹉估计非法囚禁在家庭生活在哥斯达黎加(20.]。确定的存在c . psittaci公式被韦恩[21),预期的患病率为7%(95%置信水平和5%的错误)。101只鸟的样本量进行分析确定。预期使用的患病率为7%,因为seroprevalence通常高估了真正的流行,因为测量当前和过去的感染,因为在人群中发现抗体的可能性高于找到抗原。
共有117个样本收集鸟类在2009年从中央山谷(兽医诊所)和从避难所/救援中心(不同省份的哥斯达黎加(表)1)。这些鸟在私人家庭和非法了未知的时间提出了为常规检查兽医诊所或保持一段时间在避难所/救援中心。泄殖腔和咽拭子样本取自鸟儿和保存在4°C最多五天;一旦在实验室这些样本被保存在−20°C到DNA提取和分子分析。此外,进行了临床调查,收集鸟类的以下数据:物种,省的起源、年龄、症状与所(食欲不振、体重减轻、眼鼻分泌物、绿色/黄色水样粪便,和神经问题)。调查也包括健康状况的问题,尤其是关于呼吸道症状之前的抽样数据所有者,他们的家人,或者工人。的分布psittacines物种的分析在目前的研究提出了表2。
2.2。聚合酶链反应(PCR)c . psittaci
DNA提取DNeasy血液和组织工具包的试剂盒,按照制造商的说明。的检测c . psittaci一个嵌套PCR被Kaltenbock et al。16)和修改Theegarten et al。22使用,放大部分基因ompA(外膜蛋白)来识别属衣原体spp。191 chomp使用的引物(5′GCI YTI TGG雀鳝TGY GGI TGY GCI AC-3′)和CHOMP371 (5′-TTA棉酚IC (GT)棉酚TTG IGC [AG] [TC] IA GTG IGC IGC TT-3′)。反应为18.9μL梦想Taq PCR大师混合2 x (Fermentas), 1.0μ每个引物(0.1 Lμ0.5米),μL DNA (~ 20μ4.6 g),μL水(分子生物学年级,Fermentas)准备最后一卷25μl .放大协议由最初的变性在95°C 30年代,紧随其后的是35周期的变性30年代(95°C),对齐(50°C 30年代),扩展30年代(72°C),和最后一个在72°C扩展7分钟。PCR产品可视化通过琼脂糖凝胶电泳(1.4%)在此种(三基地、硼酸、EDTA、pH8 0.5米),与溴化乙锭染色(0.5μg / mL)。GeneRuler DNA梯加100个基点(Sm0321 Fermentas)作为标记。样本显示乐队重量576 - 597 pb被认为是积极的。所有放大产品受到第二次PCR鉴定c . psittaci336年代,使用引物CHOMP (5′ccr CAA TTT CTR同性恋TTC带走TTG在竞技场队伍GMT-3′)和218年psitt (5′gta ATT TCI AGC CCA GCA CAA TTY GTG-3′),与反应物的比例反应如上所述,不同的条件周期计:95°C 30年代紧随其后20年周期95°C的30年代,60°C 30年代,30年代72°C, 72°C 7分钟。第二个PCR产品被琼脂糖凝胶电泳显示如上所述。样本显示乐队重量389 - 404 bp被认为是积极的。DNA的c . psittaci捐赠诊所的鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类,李比希大学吉森,德国,是作为积极的控制;水(分子生物学年级,Fermentas)作为消极的控制。
2.3。测序、基因分型和系统发育树
样品积极通过嵌套PCR是基因分型分析ompA基因序列(23]。使用的引物是CPsittGenoFor (5′-GCTACGGGTTCCGCTCT-3′)和CPsittGenoRev (5′-TTTGTTGATYTGAATCGAAGC-3′),放大的保守区域ompA基因覆盖四个变量域(23]。的体积反应(25μ12.5 L)包括μL梦想TaqTM PCR大师混合2 x (Fermentas), 1.0μ每个引物(20 pmol / LμL), 5μL DNA (~ 20μ5.5 g),μL的水(分子生物学年级,Fermentas)。步骤放大由最初的变性在95°C 10分钟,35周期为1分钟95°C, 55°C 1分钟,1分钟72°C,最终在72°C扩展了10分钟。扩增片段的大小是1041个基点,可视化在电泳如上所述。PCR产品纯化使用QIAquick(试剂盒)工具,按照制造商的说明。
积极的样本被送往Macrogen(首尔,韩国)测序。部分序列与BioEdit序列比对编辑器(24),而使用BLASTn算法与NCBI数据库(国家生物技术信息中心)。后来他们在大型进口5 (25)设计的系统发育树。进化历史推断使用UPGMA方法(26]。的比例复制的树分类群聚集在一起,引导相关测试(10000)复制了旁边的树枝(27]。树是按比例绘制,分支长度在同一单位的进化距离用来推断系统发育树。进化距离的计算使用Jukes-Cantor方法(28)所示,单位的数量基本替换/网站。分析涉及12个核苷酸序列。九的参考序列c . psittaci基因库的基因型可以在数据库(加入AY762608数量)、B (AF269265), C (L25436)、D (AF269266), E (X12647), F (AF269259)、E / B (AY762613), M56 (AF269268)和WC (AF269269),包括在分析(29日]。系统发育树与ompA序列衣原体caviae(GPIC基因库AF269282) [30.]。
3所示。结果
总共四个(3.4%)的117个分析psittacines被发现是积极的c . psittaci。所有积极的鸟类都参加了兽医诊所的例行检查,其中三个属于物种Ara澳门和一个答:ochrocephala;没有显示症状与疾病有关。两只鸟的DNAc . psittaci口咽拭子检测,和其他两只鸟在泄殖腔拭子,没有一个人提出的DNA在两种类型的拭子代理。两只鸟都来自圣何塞和另外两个Heredia;只有其中一个少年,而其他三个成年人。在所有情况下,鸟儿生活在家庭和其他鸟类,没有在这项研究中(表采样3)。
只有四个样本取得积极的结果在第一个PCR(图1(一))和放大之后的具体乐队在嵌套PCR (389 - 304);然而,剩下的产品从第一个DNA PCR(图中也检测到1 (b))。测序是只有两个阳性样品(1和2)确认和识别这些结果c . psittaci基因型(图2)。BLASTn分析导致100%的核苷酸之间的身份两种样品,100%的序列同源性90/1051应变(基因库AY762608),和99%与其它基因型菌株(公元前84 - 55 (Y16561), 6 (X56980),和张VS1 MN (AF269281)]。DNA从其他两只鸟(3和4)不足以进行sequentiation分析。
(一)
(b)
4所示。讨论
本研究首次报道的细菌的存在c . psittaci哥斯达黎加的鹦鹉被囚禁。虽然以前曾有报道称12.4%的血清阳性Ara澳门和Ara ambigua,用间接ELISA技术(19),使用分子技术检测和代理的PCR (PCR和测序)没有进行到目前为止,无论是动物还是人类在哥斯达黎加和中美洲。
低积极性决定使用这个pcr检测(3.4%)没有预期,考虑的结果Herrera et al。19)和其他(3- - - - - -5]。这可以解释为不同的技术和更高的可能性比直接找到抗体检测致病生物体在一个人口,这是众所周知的,只能间歇性地通过粪便排泄在受感染的鸟类或口咽分泌物进入环境。是可能的,如果在本研究样本已经连续2到3天,一个更高比例的正面的鸟类将被发现(31日]。
压力是很重要的,然而,鸟儿发现积极的提出为常规检查兽医诊所,没有表现出临床症状,这是符合报告Gerlach [6),他们发现,鸟类可能无症状感染由于种种原因,他们是否感染低毒性菌株或由于抵抗一些鸟类。因此,无毒菌株产生一般成人无症状感染鸟类,这些可能排泄机体几个月。因素影响临床症状的发展条件,鸟类的保持;良好的管理条件减少压力,而极端环境变化或并发感染可引起临床疾病的发作。最后,长期亚急性形式没有临床症状也很普遍(6]。
阳性样品的测序证实了分子诊断从两个鹦鹉。此外,确定的存在c . psittaci基因型在囚禁psittacines哥斯达黎加同意广泛的文献报道基因型通常是发现在鹦鹉,这也是最常见的人类基因型鉴定(32- - - - - -34]。
结果表明诊断的重要性c . psittaciPCR的鸟类,当他们被介绍给一个避难所,救援中心、动物园、或其他人工饲养条件,来确定他们是否运营商和其他鸟类和可能的感染源,另一方面,风险是否在接触这些鸟人(老板和兽医等)。在这方面,没有一个所有者的c . psittaci积极的鸟类和他们的家人或工人呼吸道症状的调查报告。据德鲁(20.],鹦鹉代表80%的野生动物被囚禁在哥斯达黎加。基于这一研究获得的结果是很重要的提醒当局和一般人群。拥有野生鸟类在哥斯达黎加根据守恒定律是非法的野生动物35];也代表了公共卫生风险,因为所有样品确认为阳性c . psittaci来自鹦鹉住在家里。
我们建议包括分子诊断c . psittaci在人类,尤其是那些与鹦鹉接触或居住,以及执行其他鸟类患病率研究等鸽形目特别是psittacines自由生活,决定是否给哥斯达黎加野生动物带来一个严重的问题。道德准则是应用在这个调查,因为生活的野生动物被操纵。
利益冲突
没有利益冲突声明。
确认
特别感谢博士马歇尔·实习,奥斯卡博士罗伯特,和毛博士吉梅内斯积极参与本研究;Kinndle布兰科博士对她的帮助和宝贵的建议;和德国学术交流服务(德意志)奖学金颁发给杰西卡Sheleby-Elias。本研究是在项目的框架进行“检测野生鸟类传染性病原体的哥斯达黎加,“项目没有。NFEG05所。