幼马鹿的纵向发病机制研究(Cervus elaphus实验挑战鸟型分支杆菌无性系种群。副结核(地图)

摘要

副结核在小马鹿身上的发展速度比在羊或牛身上快。本研究描述了14只4个月大的马鹿在50周内的临床、免疫和病理变化鸟型分支杆菌无性系种群。副结核(地图)。在攻毒后4周和12周，他们被麻醉，手术切除空肠淋巴结进行培养、组织病理学和遗传学研究。14只鹿全部感染，无临床感染，在第50周被杀时出现不同程度的亚临床疾病。第4周活检显示无结核旁病变，但对所有动物进行了MAP培养。第12周和第50周，组织病理学病变由轻到重，抗体滴度由低到高，在12 - 24周达到高峰。干扰素-γ反应在8-15周达到高峰，轻度感染动物的反应高于严重病变动物。

1.导言

副结核(约翰氏病)，由鸟型分支杆菌无性系种群。副结核（MAP），可导致马鹿生产的重大损失(Cervus elaphus)。[1，2］.幼鹿特别容易受到感染[3.]临床疾病通常发生在8-27个月大的动物身上[1]，而羊和牛的寿命为2-4年。临床感染的小鹿通常有腹泻、体重减轻、小肠增厚和肠系膜淋巴结肿大，常伴有结核样干酪样病变[2］.

虽然牛的早期免疫反应已经被研究过[4，5在sheep中[6]，关于马鹿MAP挑战后12个月的疾病进展和免疫反应的出版信息很少。早期先天和后天免疫反应被认为在决定疾病的发病机制和严重程度方面发挥重要作用。

马鹿的实验性副结核挑战模型已经被开发出来，以再现从轻度亚临床感染到临床疾病的一系列典型疾病结果[7]该激发模型已用于研究鹿对绵羊和牛MAP菌株的剂量反应和敏感性差异[8]，疫苗的保护效力[9，以及年龄易感性[3.］.

本研究的两个主要目的是监测一年期间的临床、免疫学和病理变化，并在三个时间点收集空肠淋巴结活检样本，以便未来研究与耐药/易感MAP相关的基因表达。

2.材料和方法

２.１.动物

17马鹿小牛出生22随机选择混龄血清反应阴性的希德,受精与冷冻精液从两个无关的红鹿(7陛下1,10陛下2)的一个农场,没有以前的历史牛结核病的临床副结核和被测试免费30年了。这些犊牛于2月下旬断奶，那时它们大约3个月大。在3月初，他们被注射了莫西克素(Cydectin;Fort Dodge动物健康有限公司，奥克兰，新西兰)，加入氧化铜丝颗粒(4克铜胶囊;拜耳新西兰有限公司，奥克兰，新西兰)，并接种yersiavax (AgVax Developments Ltd，上赫特，新西兰)。本研究得到了AgResearch Invermay伦理委员会(AEC 11425)的批准。

２.２.挑战

2008年3月下旬，17头Paralisa试验均为阴性的鹿接受了MAP测试，测试采用了前面描述的标准感染模型[7，8］.简单地说，每只动物每天口服给药剂量，连续4天，每次10次⁹从临床感染鹿的空肠淋巴结(JJLNs)中直接收获的MAP牛毒株的cfu。估计的数字是基于BACTEC 12B连续稀释液体培养。

2．3.临床监测

在整个50周的研究中，鹿群在牧场一起放牧，冬季在饲粮中添加干草和大麦。他们每天监测身体状况，4月、5月和6月每月称体重，7月每周称两次，8月至3月初每周称一次。该方案要求任何出现副结核病早期临床症状的鹿(在两周内体重下降5-10%，肌肉量减少，±腹泻)将被安乐死。

2.4.空肠淋巴结取样

在激发后4周和12周，每只鹿用静脉注射柠檬酸芬太尼、氧嗪和阿扎哌酮麻醉(芬太嗪5;博马克实验室有限公司，Manukau)，气管插管和维持氟烷(卤烷兽医;Merial care, Manukau)和氧气。动物背部平卧，腹部夹紧、准备和覆盖。行15cm中线剖腹探查，大体可见肠系膜淋巴结和肠系膜。切除40-50 mm后侧JJLN片，切成5片;3片置于低温管中，立即液氮冷冻，用于后续基因表达研究，1片固定在10%缓冲福尔马林中进行组织病理学检查，1片进行MAP培养。用Maxon线(Davis & Geck，美国)和Vicryl线(Ethicon，美国)缝合切口。注射长效青霉素(Norocillin LA;Norbrook NZ Ltd.， Rangiora)用于预防术后感染，并与美洛昔康(Metacam 20; Boeringer Ingelheim NZ Ltd., Auckland) for postoperative pain relief. The anaesthetic was reversed with yohimbine and naloxone (Contran H; Bomac Laboratories Ltd., Manukau). The deer were monitored closely for two weeks following each biopsy session.

所有幸存的鹿在50周后安乐死，尸体解剖，从空肠(JJ)前、中、后、回盲瓣(ICV)和相关淋巴结取样，并进行活检。活检和尸检时，对JJ、ICV、JJLN、回肠盲肠淋巴结(ICLN)和肠系膜内任何肉眼可见的副结核病变进行描述，并根据以下肉眼病变评分进行分级:0，无可见病变(NVLs);1、略放大JJLN/ICLN;2、适度放大JJLN/ICLN;3、非常放大的JJLN/ICLN;4、增大伴单例肉芽肿性JJLN或ICLN病变;5、多发JJLN、ICLN病变。

2．5．免疫监视

在试验期间，定期抽取血液样本，并进行parisa试验和γ干扰素(IFN-)检测γ)，并在屠宰前两周进行宫颈结核菌素对比试验(CCT)。parisa测试是一种IgG抗体₁抗体类特异性ELISA检测，采用两种抗原，即MAP原浆抗原(PPA)和MAP纯化蛋白衍生物(PPDJ)，并使用一种内部抗马鹿抗体[10，11］.结果用(OD)计算的ELISA单位(EUs)表示_样本−OD_负的控制) × 100，如果动物对任一抗原的滴度为>50 EU，则认为阳性。干扰素-γ检测采用内部ELISA检测[12]来测量干扰素-γ用PPDj刺激肝素化血样的反应。简而言之，96个平底微量滴定板涂有干扰素-γ捕获抗体(Serotec)。仅加入洗涤缓冲液作为阴性对照，并加入重组鹿IFN-γ作为阳性对照。检测系统使用生物素化抗体(Serotec)和链霉亲和素-辣根过氧化物酶结合物。酶联免疫吸附测定仪在450nm处读取板，在650nm处读取参考板。结果在ELISA单位中表达为(PPDj−阴性对照)。在CCT中，在颈部两个紧密剪切部位皮下注射0.1 mL禽结核菌素(2500 IU)和牛结核菌素(5000 IU)。在注射前和注射后72小时测量皮肤厚度，并计算皮肤厚度的增加。

2.6。文化

使用含有蛋黄和分枝杆菌蛋白的BACTEC 12B液体培养基对所有组织和粪便样本(5 g)进行MAP培养[13，14]，根据样品呈阳性的速度进行半定量;即阳性天数(dtp)，培养物每5-7天读取一次。

在第4周和第12周采集的JJLN活检标本在采集后48小时内冷冻并培养。在第50周，每只动物死亡后立即收集4份肠道样本(JJ和ICV的前、中、后)和4份相应的淋巴结样本(JJLN和ICLN)，冷藏过夜，第二天培养。在第50周从直肠收集的粪便样本冷藏过夜，采用双重孵育法处理[15]，然后是培养。

2.7。组织病理学

每个动物固定标本的切片用H&E和Ziehl-Neelsen (ZN)染色，采用改良的7点评分法对肠系膜淋巴结(MLN)和肠道病变进行组织病理学病变严重程度评分(LSSs)。在14分制量表中，将一周的50 MLN和肠道评分相加，得到LSS评分[16，17］.在不了解动物饲养或肉眼病变的情况下检查切片。对于MLN和肠道病变，lss为1和2为非常轻微或非特异性，3为提示非常轻微副结核，4为轻微，5为中度，6为中度严重，7为严重副结核。LSS总分4 ~ 8分为轻度，9 ~ 11分为中度，12 ~ 14分为重度副结核。病变也被描述为无抗酸菌(AFOs)、少杆菌(PB)或多杆菌(MB) [16］.

2.8。统计分析

本研究没有足够的动物进行有意义的统计分析。

3.结果

３．１．临床结果

在整个研究过程中，没有动物显示出临床副结核病的迹象，所有鹿的体重都增加了，在50周的研究中，母鹿的体重平均增加了35公斤，公鹿的体重增加了56公斤，而且在Sire 1和Sire 2后代之间的体重增加没有显著差异。三只鹿死于与副肺结核无关的不幸。

３.２．总损伤分数

第4周时，JJLN中没有明显的肉眼损伤，但到第12周时，一半鹿的JJLN轻微或中度增大（表1）1）.第50周时，4只鹿的JJLN明显增大，其中1只鹿有多个干酪灶，其余10只鹿的JJLN无明显增大或略有增大。

３．３．组织病理学病变严重程度评分

第4周未见特异性病变，但第12周MLN lss从轻到重(4 - 7)1)，尽管这些评分是保守的，因为它们只是基于一小块后部的JJLN。在第50周，LSS从2到7，总LSS从2到14。1只动物没有可见的AFO, 3只动物没有AFO但属于PB, 1只为MB，其余为PB。

在第12周至第50周期间，MLN LSS发生了以下变化;14人中有11人减少，1人增加，2人保持不变。在病情变轻的患者中，一个从严重到非常轻微，两个从严重到轻微，三个从严重到中度，一个从严重到中度，一个从中度到轻微/非特异性，两个从中度到轻微，一个从轻微到非特异性。严重程度从轻微增加到中度。一个严重和一个中度严重保持不变。在第50周，MLN和小肠LSS评分一般相似。

有趣的是，根据Clark等人2010年描述的标准，在第50周时，其中两只动物钙化组织中AFO浓度的增加与PB有关[16］.同样的动物在第12周出现MB。

在整个研究过程中，两父系后代的LSS及LSS随时间或PB/MB比值的变化均无明显差异。

3．4．文化

在第4周和第12周从所有JJLN活检中分离MAP，并在第50周从所有14只鹿的集合LN中分离MAP（表1）2）.文化* JJLN 28-42 dtp在星期4显示少量的地图,但在第12周这降低了dtp,指示地图的数量的增加,这三个影响最小的动物平均19 dtp与13 dtp最严重的影响。到第50周，受影响最小的增加到31百日咳，受影响最严重的增加到18百日咳。第50周时，JJ + ICV组的dtp高于JJLN + ICLN组。屠宰时，只有4/14的粪便培养阳性(31-37 dtp)，表明MAP的数量相对较低。

3．5．血清学

在50周的研究过程中，4只动物(506、509、511和512)对Johnin的滴度始终较低，均在<60 EU时达到峰值(图)1(一))，其中3例有轻到中度病变(总lss2 - 8)。相比之下，有4只动物(508,513,510和507)有151-172 EU高滴度，在15-20周达到峰值，并趋于保持高滴度(图1(一))，有中重度病变(总LSS 8-12)。其余6只动物的EU滴度为99-146，在pc 12-26周达到峰值，并有下降到更低水平的趋势(图)1 (b))，轻度至重度病变(总LSS 6-12)。高滴度(504、508、510、514和517)的动物倾向于在第50周，即48周皮肤试验后的两周时上升，而低滴度(500、501、502、506、509、511、512)的动物没有上升。

3.6。干扰素γ

干扰素的γ在50周的研究中，受影响最少的动物(总LSS 2-7)比受影响更严重的动物(总LSS 11-12)上升更早，峰值更高(图)2）.干扰素的γ反应出现两次高峰，第一个高峰出现在12-15周，然后下降到24周的最低点，第二个高峰出现在30-36周。只有lss2 - 7组IFN增加γ第50周，皮试后2周。

3.7。有条件现金转移支付

禽类和牛的皮肤厚度平均增加9.7 mm(1.8-13.4)和3.1 mm (0.6-8.4)在所有的动物;也就是说，牛结核病呈阴性受影响最严重的3只鹿的平均栖息地增加了8.2 mm(6.5-10)，而受影响最小的3只鹿的平均栖息地增加了3.5 mm(1.8-5)。

4.讨论

马鹿MAP感染模型允许多个变量的控制，从而可以有效地研究它们对挑战的免疫反应。它们的后代年龄相同，是在同一天通过人工授精的同步性母鹿产下的，它们的出生时间相差无几。这些动物从出生起就被聚集在一起，定期接受驱虫剂治疗，接种耶尔斯虫病疫苗，接受矿物质补充剂治疗，在牧场吃草，并在同一天服用相同剂量的MAP。唯一不受控制的常见变量是性别，但在结果中没有明显的性别偏见。在以前的研究中，有一部分受到MAP攻击的小马鹿出现了临床疾病[3.，8，9］.在本研究中，虽然动物年龄和MAP菌株与以前相同，但没有临床感染的动物，且很少有严重的疾病，说明两个父系的后代对MAP有中等抗性，或者接种物的MAP比以前少。

使用感染模型，并在pc期4、12和50周取样空肠淋巴结，定期进行血清学和IFN-γ这些实验使我们能够深入了解MAP感染的发病机制以及有关免疫反应的纵向信息。鹿似乎对副结核病相对易感，而且该病在易感鹿身上的发展速度比在羊和牛身上快得多。在自然农场条件下，临床病例通常发生在8至15个月大的马鹿[1]，而临床疾病多见于3-4岁的羊和牛，这使得自然疾病很难在合理的时间框架内进行研究。病变严重程度评分[16，17基于组织活检和尸检样本的组织病理学检查，以及MAP培养时间，能够客观纵向观察动物内部和动物之间随时间变化的疾病。损伤严重程度评分的活检样本在周4和12是保守的,因为它只是基于一段后JJLN,而采集的样本在验尸是基于四个样品前,中,后JJ ICV +相关淋巴结。

有一些在羊和牛身上的研究使用了小肠和肠系膜淋巴结的外科活组织检查来诊断副结核[18- - - - - -20.或跟踪感染过程，并试图将这些变化与免疫学测量联系起来[6，21，22］.吉尔摩等人检查5个实验感染切维厄特x萨福克羊4次5,11日,17日和23个月,在验尸27个月的电脑,而丹尼斯等人监控77自然感染美利奴绵羊和活检,这些在12日20 18和24个月大的时候。被临床感染的羊被安乐死并进行尸检，其余36个月大的羊也是如此。Gilmour等人也会时不时地杀死成群的羊，并对它们以及临床感染的动物进行尸检。这两组患者在27 - 36个月期间获得了广泛的疾病结果。Wu等人感染1个月大的犊牛，然后间隔1-2个月对小肠和肠系膜淋巴结进行活检，监测疾病进展，并在6-9个月大时宰杀犊牛。虽然他们检测到炎症反应和细胞因子水平的变化表明th1型相关的细胞反应，但没有th2型相关的体液反应，但没有临床疾病的迹象。相比之下，本研究中使用的鹿模型具有在一年的研究中重现一系列自然疾病结果的优势。

这项研究的一个有趣的结果是，疾病严重程度的变化范围发生在一年的过程中。第4周，从所有动物的JJLN中培养MAP，但组织学上未见副结核特异性病变。第4 ~ 12周，所有鹿的MAP数均呈上升趋势，出现轻度至重度的JJLN病变。然而，在受影响更严重的动物中，MAP数量增加更多，这表明相对抗性/易感性的差异正在影响病变的发展和MAP增殖率。在第12周和第50周之间，一些动物仍然轻度受影响，一些仍然严重受影响，而一些有所改善，另一些恶化。大约有一半的动物成功地抑制了MAP的增殖，限制了疾病的范围，因此JJLN的LSS和MAP的数量都下降了，这可以从dtp的增加看出。相比之下，一些动物似乎无法抑制MAP的增殖，它们的LSS恶化，MAP的数量在这9个月期间增加或保持不变。第12周时为MB的2只动物在第50周时为PB，但在矿化组织中有少量高数量AFO灶。这种类型的病变以前曾在自然感染的动物中观察到[16这是一个新的发现，其发病机制似乎与MB以前的病变阶段有关。

受感染最严重的动物也有最高的抗体滴度，而两个受感染最少的动物在整个研究中保持血清阴性，早期IFN-较高γ水平高于受影响更严重的动物(LSS 5-7)。这些发现支持这样一种观点，即越有抵抗力的动物具有越有效的Th1细胞介导的免疫反应，而越敏感的动物更早地转换到Th2体液反应[23]结果表明，先天免疫可能在最初4周内对MAP增殖的杀灭或抑制作用不大，而获得性免疫在抵抗力更强的动物中起着主要作用。有趣的是，即使是相对抵抗的动物也需要数月的时间才能控制MAP增殖感染的巨噬细胞和树突状细胞从小肠向引流淋巴结的迁移可能是副结核患者有效局部T细胞活化的关键，正如树突状细胞从小肠向引流淋巴结的迁移一样肺到引流淋巴结被认为是结核患者T细胞活化的关键[24］.这似乎发生在鹿的MAP挑战的几周内。在本研究中，与JJLN同时对小肠进行活检是不实际的，但监测JJLN的变化有助于纵向了解50周内的免疫和病理变化。

最近，在自然感染的绵羊身上也有类似的观察报告，这些绵羊在36个月的时间里通过淋巴结和肠道活检进行监测[6]。发生严重多杆菌肠炎的绵羊从未随时间改善，受影响的绵羊在出现这些严重病变后的12个月内表现出临床症状。然而，46只绵羊中有6只（8.7%）在某个阶段MAP培养阳性活组织检查的绵羊，后来在尸检时出现阴性培养，表明感染已恢复。该研究还表明，在该群体中，40.3%的绵羊从未检测到感染，这些绵羊暴露于严重的自然挑战中，这表明一些动物对感染具有抵抗力。

在这项研究中，病变严重程度和MAP数量的纵向变化是相似的，尽管不像2009年进行的后续研究中看到的那样极端，这也表明，在对副结核表现出耐药性/易感性差异的两个父系的后代中，对实验性副结核挑战具有显著的遗传耐药性/易感性[25］.

5.结论

纵向监测空肠淋巴结的组织病理学和培养，以及血清学和IFN-γ对马鹿幼鹿亚临床副结核的发病机制有了一定的认识。严重的口腔挑战导致所有动物感染，但感染过程差异很大。到12周，所有动物的MAP数量都增加了，而MLN病变从轻到重。然而，在受影响更严重的动物中，MAP数量增加更多，这表明相对抗性的差异正在影响病变的发展和MAP增殖率。在第12周至第50周期间，有一半的动物成功地抑制了MAP的增殖，并限制了疾病的数量，而其他动物则无法抑制MAP的增殖，病变变得更加严重。受感染最严重的动物也有最高的抗体滴度，而两个受感染最少的动物在整个研究中保持血清阴性。再加上观察发现，受影响最少的动物IFN-出现的时间更早，也更高γ，支持这样一种观点，即抵抗力越强的动物具有更有效的Th1细胞介导的免疫应答。在这些动物中，先天免疫并不能防止感染。然而，在pc的12到50周期间，疾病严重程度的下降表明获得性免疫在抵抗力较强的动物中发挥了主要作用。

致谢

作者希望感谢奥塔哥大学疾病研究实验室和瓦拉塞维尔结核病实验室的工作人员为开展这项研究的实地工作和实验室工作提供的帮助。这项研究由约翰氏病研究协会资助。

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