文摘

本研究的目的是评估的具体技术方面在体外卵母细胞成熟(IVM),包括容器材料和溶剂交付向量。卵母细胞成熟的无油、裸眼系统包含在塑料或玻璃盘子和控制卵母细胞成熟的媒体相比,水滴与矿物油塑料碗覆盖。裸眼实验重复与乙醇nonmiscible化合物的数量足够的交付。卵裂率显著降低玻璃器皿系统相比,控制。的plasticware裸眼系统没有不同于控制或玻璃器皿组。乳沟在玻璃器皿与乙醇明显低于控制或plasticware乙醇。囊胚率只有减少glassware-ethanol治疗相比plasticware-ethanol治疗。细胞计数和百分比TUNEL-positive细胞没有显著差异。但出乎意料的是,性别比例显著下降(34%的男性)的预期值50%男性在玻璃器皿组添加乙醇。目前的研究表明IVM微妙的技术变化的敏感性,导致重大发展后果。

1。介绍

适当的核和胞质成熟的卵母细胞准备是至关重要的受精和发育成胚胎1]。胚胎生产在体外利用复杂的媒体,同时在卵母细胞每一步发展:成熟、受精和文化。常见的在体外实践暴露了积云卵母细胞复合体在成熟许多基质包括激素。常促黄体激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、雌二醇和添加到IVM媒体;然而,其他像雄激素类固醇激素(2,3)或甲状腺激素(4)一直在探索在生理学、因为他们的经典作用诱导的增长。其他因素的贡献已经探索在体外包括源自生物添加剂(5,6丙酮酸或葡萄糖等),能源7,8),也完全定义媒体没有任何未知的生物提取像血清6,9,10]。此外,向量的影响像乙醇(EtOH) [2)和二甲亚砜(DMSO) [11)可用于水溶性差的类固醇的交付了。它已经表明,小卷EtOH和DMSO(≤1%)不影响卵母细胞的成熟,但0.3%或更高水平可以产生负面影响胚泡生产(11]。

文化媒体和组件,包括在适当的成熟发挥不可或缺的作用,但剩下的系统同样重要。无菌条件孵化器在适当的温度和气体平衡所需卵母细胞成熟、受精和胚胎培养。石油覆盖的媒体液滴在媒体上也会导致不育,减少蒸发,和极限应力在卵母细胞或胚胎(12,13]。随后,选择的材料的容器在体外媒体可能有不同的物理性质可能影响卵母细胞的成熟。在类似的方式,添加剂像雌二醇通常需要在一个细胞毒性溶剂,而这也可能产生负面影响卵母细胞成熟。

先前的报道表明,类固醇激素是由一些组件隔离被认为必要的卵母细胞成熟石油和塑料等。两个实验室塑料制品(14)和石油覆盖(15)已被证明从生理样品明显吸附类固醇或媒体从而减少生物利用度。显著的吸附等医学相关背景的化验结果玻璃和塑料免费三碘甲状腺氨酸、孕激素、催乳素,前列腺特异性抗原,乳素与血浆蛋白质a也被描述(16]。例如,40%的甲状腺激素被发现吸附远离文化媒体的一项研究[4]。等报告显示,生物活性化合物杀菌剂从塑料生产或雌激素异型生物质p-Nonyl-phenol,可以从容器中浸出到媒体(17,18]。这些问题促使研究人员把石油从在体外培养系统(19]。一个挑战依然存在,然而,也就是说,确定媒体的交互作用和影响,石油、溶剂和容器。

本研究的目的是评估细微变化胚胎成熟条件通过比较玻璃器皿和我们实验室的标准IVM plasticware作为卵母细胞成熟的容器和乙醇的添加体积小,看是否有对胚胎生长发育的影响。人们相信物质的变化以及添加EtOH会产生负面影响的能力适当卵母细胞成熟,随后限制增长和发展。

2。材料和方法

2.1。实验设计

治疗是在成熟的一步。标准成熟协议(媒体滴满油)进行了控制复制,这都比较裸眼plasticware成熟和裸眼玻璃器皿成熟。添加乙醇是探索在IVM只有在裸眼玻璃器皿和plasticware系统。EtOH出席0.1%在控制和添加0.2% EtOH治疗。八个复制IVM生产组织,在不同的日子里完成,导致了对照组。每个治疗组由七个复制IVM天。治疗复制恰逢控制复制;然而,由于有限的可用卵母细胞的所有五个治疗并不总是在每一天。

2.2。卵母细胞的收集和在体外成熟

卵巢收集从当地屠宰场(Cargill肉制品,圭尔夫,安大略省)在温暖的第35 - 37 (°C)磷酸盐(PBS)解决方案(表达载体,伯灵顿,安大略省)。屠杀四到五小时后,卵母细胞、颗粒细胞、积云细胞和卵泡液真空收集的愿望从卵泡直径1到8毫米到火腿的不会(表达载体,伯灵顿,安大略省)解决方案在50毫升离心管(费舍尔科学、渥太华、安大略省)和允许定居。大量的液体被删除,剩下的沉积物与新鲜不会混合解决方案在培养皿中,与同质优质卵母细胞细胞质中,一个完整的积雨云没有闭锁的迹象,和成年大小大于120μm,排序在立体显微镜(日本尼康)。卵母细胞在补充中药洗- 199 (S-IVM)解决方案然后洗两次过滤(22μ米)S-IVM解决方案添加了激素。激素添加到5毫升的过滤S-IVM如下:10μL促卵泡激素(FSH) (Bioniche Bellville,安大略省)在82年NIH单位/ mg稀释250 ug /毫升,5μL促黄体激素(LH)国家卫生研究院(NIH)一个Parlow博士2.3户/ mg稀释1毫克/毫升,和5μL雌二醇(E₂)(兽医。安大略省圭尔夫凯龙星有限公司)在10毫克/毫升溶解在5μL的乙醇。激素后洗的控制组卵母细胞被放置20每80人μL与油滴覆盖35毫米的塑料盘(Nunc,渥太华(费舍尔))。卵母细胞成熟在治疗组80年塑料四级菜(Nunc,安大略省渥太华(费舍尔))(plasticware组)或玻璃容器(Yves Savoret规范的玻璃车间,圭尔夫大学)(玻璃器皿组)的类似大小的钱伯斯四级板,在500年μL S-IVM +激素。另外,乙醇向量剂量的5μL被添加到另一组玻璃器皿和plasticware组。所有治疗都孵化22小时38.5°C, 5%的湿润环境有限公司₂。

2.3。在体外受精

后在体外卵母细胞成熟(IVM)卵母细胞被洗两次sperm-hepes TALP (tyrode白蛋白乳酸丙酮酸)(内部消息灵通的股票,表达载体,伯灵顿,安大略省)添加了牛血清白蛋白(BSA) (Cansera Rexdale,安大略省),然后两次试管受精TALP包含BSA(内部),和肝素(表达载体,伯灵顿,安大略省)精子激活。80年20卵母细胞被放置μL滴下试管受精TALP油在35毫米培养皿。同时,牛精液冷冻保存(Gencore圭尔夫,安大略省)解冻从液氮存储,用移液器吸取到的底部4毫升管1.25毫升sperm-hepes TALP。管是孵化为38.5°C,精子被允许“游泳”的精子管允许达到的最高部分液体,而不能移动的和死精子仍在底部。精子是孵化60分钟的描述方式。60分钟后,顶部部分的“游”是收集并添加到15毫升康宁管包含10毫升sperm-HEPES TALP (pH值7.3 - -7.4),然后在低速离心机(约200×g) 8分钟。上层清液被除去,300 - 400毫升的试管受精TALP添加到精子小球,激动和10μL TALP含有约1×10⁶精子用移液器吸取到每个下降。包含两个配子都孵化的下降为38.5°C公司5%₂大气18 - 20小时。

2.4。在体外文化

在体外文化是在完成受精如前所述[3在合成oviductal流体(SOF) (Chemicon-Millipore Billerica,马萨诸塞州)富含BSA (1.8%) (Cansera Rexdale,安大略省),不必要的氨基酸(表达载体,伯灵顿,安大略省),必需氨基酸(表达载体,伯灵顿,安大略省),丙酮酸钠(表达载体,伯灵顿,安大略省),庆大霉素(表达载体,伯灵顿,安大略省),和孵化隔夜之前使用。假定受精卵从受精滴,取出放入15毫升康宁管包含2毫升sperm-HEPES TALP。这个管是90秒然后涡带的积云复杂的受精卵。裸露的假定的受精卵被洗两次sperm-HEPES TALP和两次SOF媒体和加载到SOF滴。30的受精卵被置于30μL滴在一个tri-gas孵化器孵化为8天,提供一个低氧环境(5%啊₂,5% C0₂90% N₂)。胚胎受精后48小时内进行评估(hpi)卵裂率。受精后胚胎数量在第八天。

2.5。细胞凋亡和细胞计数

收集胚胎立即安装在幻灯片和固定TUNEL (TUNEL荧光素包,罗氏,曼海姆,德国)染色和细胞计数(图1)。胚胎在SOF洗了三次接触前15秒0.01 N盐酸/ 0.1%渐变20(:,剑桥,英国)的解决方案。几毫升盐酸/ 20名包含胚胎渐变,然后放置在干净的玻璃Superfrost +幻灯片(费舍尔,渥太华,加拿大安大略省),被温柔的风潮从18-gauge针的尖端,并允许干燥。胚胎周围是用钻石笔得分。胚胎然后固定3:1甲醇醋酸固定剂,晾干了20分钟,然后在一夜之间固定剂。如果需要,固定样本暂时储存−20°C。开始TUNEL染色,幻灯片被加热到室温,Milli-Q水冲洗。积极的控制治疗2分钟0.5%胃蛋白酶(费舍尔,Nepean,安大略省)解决方案在10毫米盐酸(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)和PBS洗3次。负控制幻灯片服用50μL缓冲区的工具包。积极的控制和治疗幻灯片处理缓冲区和酶(45的混合物μL和5μL,分别地。,per slide) and covered with parafilm (Pechiny Plastic Packaging, Menasha, Wisconsin). All slides were then incubated for one hour in a humidified chamber at 37°C. After the incubation slides were rinsed twice with Milli-Q water. Propidium iodide (PI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) was added to the sample, then covered in parafilm, and incubated for 45 minutes at 37°C in a humidified chamber. Slides were rinsed, dried, covered with coverslips, and sealed for viewing under a Leica epifluorescent microscope. PI stained all DNA red, while the nick end labelled DNA was green via fluorescein isothiocyanate (FITC). Overlapping green and red signals produced a yellow signal.

2.6。通过聚合酶链反应胚胎性别检测

用于胚胎性别首次进行去除透明带。为此,胚胎从文化和洗一次在PBS 0.1% PVA,然后转移到0.2%链霉蛋白酶解(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)。接触链霉蛋白酶2 - 3分钟后,zonae pellucidae溶解,和胚胎在SOF洗了三次。胚胎玻璃化的分别,没有冷冻保护剂,在0.2毫升PCR管浸没在液态氮。

Zona-free冷冻胚胎最初裂解细胞溶解的溶液中含有10%的蛋白质激酶thermocycler在37°C,一个小时15分钟在95°C,最后在4°C。裂解产品被分成两半,一为睾丸特定蛋白质Y-encoded (TSPY)放大,第二个3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)放大(图2)。GAPDH放大使用下面的程序执行:94°C, 10分钟,45轮放大和变性、退火、和扩展每个在94°C, 1分钟60°C,分别和72°C。循环后,在72°C程序跑10分钟之前保持在4°C。GAPDH引物组(260个碱基对)是:反向“5′-ccctgttgctgtagccaaat-3′”和转发“5′-ctcccaacgtgtctgttgtg-3′”。TSPY放大程序如下:95°C 10分钟然后40轮放大,变性、退火45秒每个在94°C, 58°C,分别为72°C。这些周期完成后,程序运行在72°C 10分钟之前保持在4°C。1090 TSPY引物组(完全)是:反向“5′-tcttctggtcgctcgtcac-3′”和转发“5′-ccactgtggttctgggactttg-3′”。

2.7。统计分析

分对数变换应用到数据实现平等的方差的正态分布。使用混合线性回归模型进行了分析与SAS 9.2软件(SAS研究所有限公司北卡罗莱纳)。值作为中位数为95%置信区间(C.I.),包括(UL)上限和下限(LL)。细胞计数和TUNEL数据分析没有转换和被报道为平均标准误差。置信区间(95%)也报道上限和下限一致性。显著差异报告。

3所示。结果

卵裂率(表1)卵母细胞成熟的玻璃器皿组(69.22%)明显下降()从控制卵母细胞(84.60%)。plasticware组没有明显不同于控制或玻璃器皿组卵裂率为78.97%。之间的显著差异在卵裂率发现plasticware + EtOH治疗(81.15%)和玻璃器皿治疗添加了没有(68.22%)(69.10%)和乙醇(和、职责)。卵母细胞裂解的囊胚率()也评估(表2)。没有发现显著差异之间的控制(34.71%)、plasticware(25.77%),和玻璃器皿没有添加乙醇(25.62%)。plasticware和玻璃器皿组添加乙醇,玻璃器皿组与乙醇(69.10%)明显不同()从控制plasticware集团(84.60%)和乙醇(81.15%)()。卵母细胞裂解的囊胚率(百分比)没有显著不同控制(34.71%)和plasticware + EtOH(36.23%),但不同plasticware + EtOH和玻璃器皿+ EtOH (25.62%) (),不同于nonvector组的趋势。

胚胎质量评估在胚泡阶段通过观察性别比例(表3),细胞计数(表4),TUNEL-positive细胞(表的百分比5)。治疗之间没有发现显著差异,控制收益率报48.75%男性,plasticware男性有55.67%,玻璃器皿有男性44.23%,玻璃器皿+ EtOH拥有34.39%,plasticware + EtOH男性有47.81%。有,不过理论上预期的重大转变1:1男:男女比例在玻璃器皿组(95% C.I. = 23.38 - -47.37)有额外的乙醇(表3)。,细胞计数(表4(表)和TUNEL结果5显示组之间没有显著差异。控制平均为99.75,3.81%是TUNEL阳性细胞,plasticware组胚泡有118,6.03%是TUNEL阳性细胞,和玻璃器皿组97.23的5.32%是TUNEL阳性细胞。plasticware + EtOH组每胚泡细胞计数,分别为88.33 4.65%的细胞标记TUNEL阳性细胞。最后,在玻璃器皿集团与额外的乙醇每胚泡细胞计数平均96.92细胞和7.30%的细胞TUNEL阳性。

4所示。讨论

这项研究的结果概述的敏感性在体外发展环境。显著降低卵裂率玻璃器皿组与对照组,观察与plasticware组下降。玻璃器皿的乙醇治疗导致性能降低+ EtOH系统乳沟明显低于控制和plasticware + EtOH。胚泡形成的唯一显著差异被发现之间的玻璃器皿+ EtOH和plasticware + EtOH组。剩下的组没有差异囊胚率(裂解卵母细胞的百分比)。然而,卵裂率下降,但囊胚率不变,胚泡的百分比总数的收集卵母细胞放入成熟系统显示为胚胎生产效率下降。另一个发现是,性别比例(即下降。,decrease in percentage of males) was observed in the glassware groups with an additional ethanol dose. The developmental rates and indicators of embryo quality for the control group in the present study were consistent with control results previously published by our lab [4]。控制胚胎生产系统没有明显优于裸眼plasticware系统建议修改后的系统没有容器材料变化的影响是最小的。这说明,只需把石油从成熟系统不足以导致postfertilization明显差异发展。然而,它似乎改变培养容器材料玻璃在卵母细胞成熟足以显著降低卵母细胞的分裂能力。修改后的玻璃器皿之间也可能有一个互动系统和水平的提高乙醇限制的男性比例系统中发展。

乙醇通常是作为媒体添加剂有限细胞毒性的原因(11];然而,如果在少量,它可能只产生卵母细胞发育的挑战。一些研究显示轻微的挑战成熟像静水压力的变化或氧化应激可能有积极影响卵母细胞或胚胎(20.),可以解释上的卵裂率和囊胚形成plasticware + EtOH集团虽然玻璃器皿+ EtOH集团可能仅仅遭受了太多的压力,可能已经被物质传播的区别。在成熟过程中,乙醇可能限制的能力的卵母细胞成熟,受精,并开发一个胚胎。根据胚胎的性别,处理机制成熟的乙醇的挑战可能是不同的。男性受精卵往往在文化和发展更快更好的响应葡萄糖除了媒体(8,21]。代谢的差异被认为是基于X失活(22],许多参与代谢调节的基因被发现在X染色体上。的一个好例子是X基因灭活是葡萄糖6-phosphate脱氢酶(G6PDH)。COCs成熟有G6PDH活性(23,灿烂甲酚蓝(BCB)染色24- - - - - -26)是用来确定COCs高代谢活动。不代谢BCB的牛卵母细胞被认为是质量好,他们更有可能受精胚泡和发展。如果受精卵受到压力的影响在成熟的乙醇(或其直接衍生品),G6PDH活性可能援助或限制受精卵的潜力和囊胚率低导致偏向性。在女性胚胎早期,其中X失活并没有完成,这两个活跃的X染色体可能提供更多的能力来表达G6PDH改善胚胎生存,而男性只有一个X染色体可能处理代谢压力的能力有限。

性别比例通常是研究作为人口健康的指标虽然出生后通常报道(27,28]。显著的性别比例的变化在应对环境毒物已报告28,29日]。许多研究已经报道哺乳动物和nonmammal性别比例变化,并有猜测称,这种变化可能与雄性激素(30.- - - - - -33)以及雌激素(34]。几个畜牧产业非常感兴趣性别比例的调整,特别是乳制品因为高比例的女性是可取的牛奶产量和替换群成员。媒体一项研究发现,发展中胚胎的性别比例的影响(35),这样有更多的女性。虽然没有明显的机制,可能与代谢之间的区别男性和女性胚胎早期可能是负责生产的转变(22]。在这项研究中,有可能是卵母细胞成熟的尖端未能满足他们的潜力和被淘汰的压力非最优培养条件。

替换材料和去除油,IVM的属性系统会改变。在一个开放的系统会有担忧蒸发导致底物的浓度和代谢物在媒体上。蒸发可以受到不同的材料的热性能影响与环境热交换。的可用性类固醇可能已经增加了一个物质的变化。不再会有吸附大量的类固醇激素塑料或石油在先前观察到的系统14- - - - - -16]。有人建议,发展中胚胎管理压力的机制获得后来的发展(36];因此,改变IVM的潜在压力诱导条件在这个研究可能产生不利影响卵母细胞和早期胚胎。未来的研究文化材料和向量的影响及其机制的行动(即。,steroid assays, evaporation dynamics, transcriptional analyses) would be valuable and could provide further insight into optimal在体外文化条件。

在过去的二十年里,科学家参与在体外胚胎生产考虑许多不同的系统实现高质量的胚胎可能这样会导致健康的后代。一些实验室使用的一个或多个的复杂系统来维持生长和发育的卵母细胞和胚胎通过添加其他支持细胞和成纤维细胞,(37维洛细胞(从非洲绿猴肾上皮细胞),(12)和水牛鼠肝脏(BRL)细胞(38)等生物提取血清,或基底膜基质,基底膜蛋白质的混合物(39,40]。不幸的是,这些专业系统的使用使我们的理解其功能通过未知产品cocultured细胞的释放。也有担心这些细胞类型之间的疾病传播和父母/子女参与胚胎移植(41]。随后,系统完全定义(这意味着所有添加剂和组件是已知的)正在探索和优化。大部分的媒体在这方面是关注组件。使用高纯度基质,生物提取消除。话虽这么说,在1990年代早期,它是科学界的注意,抗氧化剂用于塑料行业作为雌激素类似物和浸出等塑料细胞增殖刺激,显著影响细胞培养系统(18),概述了需要找到管理这些因素的方法。在玻璃器皿系统可能现在那么好,显示低卵裂率,并减少胚胎发展,添加乙醇,它不会很难修改媒体和添加剂以满足高效生产这种材料的成熟卵母细胞或胚胎。加上媒体的定义,不吸附玻璃器皿将有助于控制媒体条件和更好的理解如何控制的媒体添加剂会影响到期oocyt es。

5。结论

损害发展潜力演示了通过明显降低在假定的受精卵的卵裂玻璃器皿治疗组。结果可以解释这样一个贫穷的材料替换了,玻璃器皿不适合有效IVM媒体没有进一步的修改。系统,EtOH向量,显示下降的一个重要趋势相比,玻璃器皿+ EtOH乳沟plasticware + EtOH和控制,表明主要影响解理是使用玻璃作为材料的结果。在大多数情况下,胚胎的正常发育,裂解接踵而来,异常胚胎的玻璃器皿+ EtOH组。胚泡的玻璃器皿系统,然而,似乎是相同的质量的其他团体基于TUNEL检测和细胞计数。性别比例的一个非常有趣的转变从预期1:1男:男女比例出现在了玻璃器皿集团与EtOH向量只有34.39% (95% C.I. 23.38 -47.37%)的胚胎是男性。我们表明,改变材料可能有负面影响卵母细胞成熟和随后限制胚胎的数量产生的在体外系统。可能还有一个glass-ethanol-linked机制限制男性发展,发现如果确认和优化会对行业产生重大影响。我们演示了IVM的敏感性材料和技术效果。的潜在仍然使用玻璃器皿作为定义更理想的惰性物质在体外胚胎生产系统。

利益冲突

特约作者认为没有利益冲突。

确认

作者致以感谢Liz圣约翰,卵母细胞的收集和媒体准备的援助,林和露西在胚胎性别对她的帮助。他们也要感谢安妮太太强悍和威廉先生西尔斯的援助与统计分析。这个项目收到了来自加拿大研究主席项目的资金和NSERC EmbryoGENE战略网络。