搜索鸟型分支杆菌亚种副结核副结核的诊断抗原

文摘

本研究的目的是评估一个宽面板的抗原鸟型分支杆菌无性系种群。副结核(地图)来选择候选副结核的诊断(PTB)。共有54个重组蛋白在硝化纤维膜被发现和暴露到从动物血清与肺结核(),健康的动物(),和动物实验感染牛分枝杆菌()。这个初始筛选允许我们选择七抗原:2513年地图,地图上1693年,2020年地图,地图上0038年,1272年地图,地图0209 c,和地图0210 c的反应与动物血清与肺结核并显示小大从健康的动物和实验动物感染血清牛分枝杆菌。第二步是评估这七个由ELISA抗原的抗原的鸡尾酒。对于这个评价,我们利用动物的血清与肺结核(),健康的动物(),和动物实验感染牛分枝杆菌()。使用ELISA,鸡尾酒的七个选择地图抗原与血清发生反应从18岁的25动物与肺结核并没有表现出大健康的动物,只有低反应性与动物牛结核病。这些抗原可能形式的组合应用程序的一部分测试可能有助于在肺结核的诊断。

1。介绍

肺结核是一种普遍和经济上重要的疾病,影响牛,因此对牛行业的影响。它是由地图。

有关肺结核临床特点是慢性肉芽肿性肠炎的临床症状腹泻、体重减轻、牛奶产量下降和死亡率。然而,大多数感染牛没有在长期孵化阶段临床症状的感染(1]。

另一方面,大量的理论提出了克罗恩病的主要病原感染,慢性肠病在人类,是地图2- - - - - -4]。克罗恩病的经济影响和可能的链接突出控制程序的开发的重要性在群体水平。为此,有必要提高肺结核的诊断方法。

牛是最常见的感染是年轻的小腿,之前6个月的年龄,但是一些研究已经表明,感染也可能出现在成年牛。粪便脱落的地图通常开始后2年,和临床症状出现后的潜伏期2 - 10年。此外,消除剂通过凳子是非常变量(5]。

细胞介导免疫反应减弱与疾病的进展,当这种情况发生时,体液免疫反应变得可测量的。它已经表明,牛更可能有一个结合抗体和细胞反应,而不是一个从细胞抗体反应(6- - - - - -8]。在测试来检测血清抗体地图,elisa是使用最广泛的。几个商业ELISA试剂盒牛PTB目前可用的和多个研究相比他们的准确性(9,10]。比较研究不同抗原的elisa显示差异的能力这些测试来识别所有被感染的动物(11]。一些作者认为这可能是由于缺乏表示整个地图的immunodominant抗原范围在一个给定的ELISA试验(12]。然后,这个测试的关键组件之一是用于制备的抗原的ELISA测试。抗原的血清学诊断肺结核最广泛使用的是PPA-3,即m . avium应变18原浆抗原。目前,antigen-based测试来检测地图包括全细胞蛋白质的混合物用提取、包裹纯化抗原,原浆抗原。这些抗原变异性在效力和交叉反应。这种诊断方法有一些缺点与动物由于交叉反应敏感的或其他分枝杆菌病原体抗原相关地图(11]。因为整个地图基因组的测序和分析获得了(13),发现一些特定的蛋白质的基因组地图,这些蛋白的免疫反应性研究[14]。Bannantine et al。15)开发了一个首次抗原筛选蛋白质阵列。可用的诊断抗原映射了米凯尔森et al。16]。然而,单个抗原能够识别PTB-infected动物的一个子集。然后,混合抗原可能适合血清学诊断。

在目前的工作,从整个地图分馏后得到了抗原蛋白质细胞或膜分泌分数,解决与二维凝胶,在硝化纤维膜印刷线,分析血清与肺结核从动物。

地图识别的特定蛋白血清PTB-infected动物被用来开发一个鸡尾酒的选择评估ELISA抗原。

2。材料和方法

2.1。动物

从共有43个动物血清不同群体(a)牛来自PTB-free牛群和地图-粪便文化(负控制动物)(),(b)牛自然感染,MAP-positive粪便文化或ELISA-positive测试()和(c)动物实验感染牛分枝杆菌与病变()被用来评估54重组蛋白的地图。

7的最后筛选使用鸡尾酒选择抗原的血清进行了68头牛:25头牛与地图积极的文化或者ELISA-positive测试中,26个奶牛从负群没有疑似病例的肺结核和负面测试(粪便文化、血清学和INF-g),并从动物实验感染17牛分枝杆菌和病变验尸的时候。

2.2。抗原的选择

目的是鉴别和描述免疫反应性的蛋白质可能用于诊断,我们的地图中提取蛋白质治疗的细胞与十二烷基硫酸钠在50°C (17]。蛋白质是由一或二维sds - page,解决在重复进行。两个副本都沾染了胶体Coomassie蓝色和另一个被转移到硝酸纤维素(Amersham Hybond-ECL,通用电气医疗集团生命科学、白金汉郡,英国)进行免疫印迹PTB-positive牛血清样本。6个蛋白与血清免疫反应性的从动物与肺结核和nonimmunoreactive动物感染的血清m . avium。这些蛋白质被削减的凝胶,MALDI TOF确认。本研究发现这些蛋白质编码的地图1962(谷氨酰胺合成酶),地图4143(延长因子图),地图0187 c(苏打水),3194年地图,地图上3205年,3206年和地图,作为潜在的诊断抗原。

这里的其他48个蛋白质评估来自CIDC-Lelystad,中央研究所动物疾病控制部门细菌学,和的传染性海绵状脑病,Lelystad、荷兰。

2.3。重组抗原

54蛋白生产重组。简单地说,他们克隆和纯化基本上如前所述18),所有蛋白质PCR-cloned使用5′和3′引物扩增DNA片段编码成熟蛋白除了分泌蛋白,克隆没有信号肽。DNA片段克隆到表达载体。抗原被克隆到pET33b (WI Novagen Inc .,麦迪逊,美国)和pRSET(英杰公司公司,卡尔斯巴德、钙、美国)向量,和表达是由生产T7 RNA聚合酶在BL21 (DE3)大肠杆菌。这些细胞也产生T7溶菌酶减少基底目标基因的表达。描述的分泌抗原Willemsem et al。18)(2609年地图,地图2942 c和地图0210 c)在pQE80克隆(试剂盒,日耳曼敦,医学博士,美国)。抗原纯化使用他们histidine-tagged氨基端地区Nickel-affinity列,(1毫升HisTrap惠普列)(英国通用电气医疗集团生命科学)。之前,增溶的重组抗原建立了一个缓冲区包含6 M胍,20毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0),液0.5 M氯化钠,或50 mM Imidazol, 0.25%的皮套裤,德勤1毫米,0.5毫米PMSF和1%质子性来解决从包涵体蛋白质(胍),减少非特异性结合(Imidazol),减少的数量有限合伙人(质子)或8 M尿素。affinity-purification后,抗原是透析(10 kDa截止,除了地图4000 c, 1 kDa截止使用)的缓冲区包含0 - 6 M尿素,10毫米三(pH值8.0),25%的甘油,德勤1毫米,0.5毫米PMSF,质子或0 - 7 M尿素1%,10毫米三(pH值8.0),10%的甘油,德勤1毫米,0.5毫米PMSF和质子性1%。尿素浓度所需的最小浓度保持可溶性蛋白质和经验决定的。

分析了重组蛋白Coomassie-stained sds - page检测纯度。

2.4。Coomassie蓝染色

包含六个纯化重组蛋白的凝胶包含在鸡尾酒如图1。蛋白质编码的地图0209 c (56.5 kDa)显示在第一车道但是是不可见的,因为它非常接近的前面。蛋白质是运行在15%的聚丙烯酰胺凝胶,然后孵化Coomassie蓝色溶液0.05%(考马斯亮蓝R250 0.05%,甲醇50%,酸醋10%)与搅拌1.5小时。Coomassie蓝色的解决方案被移除和漂白漂白溶液(50%甲醇,醋酸10%)。

2.5。评估的体液反应一行打印免疫测定

54蛋白质的面板是评估如下:20μL(每一个抗原用于硝化纤维膜在100的浓度μ使用半自动g / mL,毒素(特拉华州威尔明顿Camag科学Inc .)。50毫升的膜被封锁屏蔽解决方案(5%牛奶TBS) 1 h。膜被放置在一个“miniblotter”(等基因BioSolutions,荷兰)。这使得并行分析45血清。我们评估血清稀释1:100。1 h孵化后,血清样本吸气,洗了三次与TBS 1 x 10分钟。膜是培养1 h和G蛋白结合到过氧化物酶(1:1500)。10分钟的膜被三次TBS 1 x和揭示了化学发光(皮尔斯ECL西方墨点法,热科学、美国)。

行打印生成免疫测定macroarrays评估的重组蛋白与动物血清与肺结核。为了识别潜在的可交叉反应的蛋白质,macroarrays也用于探测器对血清来自健康的动物和动物实验感染牛分枝杆菌。macroarrays受到微密度分析提供量化的反应在每一个地方,报告为强度。

2.6。生物信息学和统计学分析

54重组蛋白的面板包含在本研究的特点在网上:分子量、位置预测,并与其他分枝杆菌同源蛋白质(表1)。PSORTb分析用于预测蛋白质定位基于很多因素,包括跨膜螺旋,信号肽,主题搜索和相似性与已知蛋白质亚细胞位置。(http://www.psort.org/psortb/)。根据PSORTb预测,重组蛋白的集合包含28个细胞质蛋白质,7细胞质膜蛋白质,6细胞外蛋白质,并与不确定的定位(表13的蛋白质1)。

爆炸进行相似性搜索上本地编码序列相比基因库nonredundant蛋白质数据库(表1)。

2.7。点强度测量

定量点强度是通过执行一个光密度扫描获得的膜。的分析结果,点测量的强度与ImageQuant TL数组7.0版本软件,(通用电气医疗集团,匹兹堡,PA)。

这对数组和量化软件过程点强度决定了像素的平均强度在一个位置以及周围的背景像素点。从原始信号中减去这些区域背景强度获取local-background-corrected水平。选择扫描的测量直径不同的数组的数组在这项研究是相一致的。调整强度归一化后得到的位置。五个蛋白质(1272年0038年地图,地图,地图1693年,地图0210 c,和地图0209 c)显示出更强的意思是强度与血清MAP-infected动物比non-MAP-infected动物的血清和因此选择抗原(表的鸡尾酒2)。

图2020和图2513也被选中,因为虽然他们并没有显示出强烈的强度与血清MAP-infected动物,分别与肺结核,他们认识到9和6个动物(表3),因为这些的蛋白质没有以前评估或文献中报道。

2.8。ELISA

使用的抗原ELISA试验PPA-3(美国盟军监视器,Inc .)和七个抗原的鸡尾酒选择(1693年2513年地图,地图,地图上2020年,0038年地图,地图1272年,地图0209 c,和地图0210 c)。鸡尾酒是用30μg的每一个抗原1毫升的混合物。微量滴定板涂层在4°C与100年在一夜之间μL 40μ20 g / mL PPA-3或μ鸡尾酒的g / mL碳酸盐缓冲(pH值:9.6)。然后,盘子与100年被饱和μL (PBS / w / v明胶0.5% 1 h在37°C,然后用PBS / 0.1%洗五次Tween20 (PBS / T)和孵化与100年1 h在37°CμL 100倍稀释血清的PBS / T含有0.5% (w / v)明胶。盘子被洗五次PBS / T和孵化为30分钟37°C和100μL 1500倍稀释peroxidase-conjugated蛋白质的PBS / T含有0.5% (w / v)明胶。盘子洗五次了PBS / T)和50μ过氧化物酶底物L是补充道。光密度(OD)为405 nm。

3所示。结果

54行打印与血清免疫测定蛋白质进行评估的健康动物,动物与肺结核,动物实验感染牛分枝杆菌。较强的强度值是列在表中2。血清样本密度值高于平均获得的控制(PBS)被认为是积极的和动物的数量与每个蛋白质反应如表所示3。

抗原是那些选择显示更强的强度与血清MAP-infected动物比non-MAP-infected动物血清。这些抗原0038年地图,地图0210 c, 1272年地图,地图1693 c, 0209年地图,以粗体显示在表中2和3。此外,我们选择两个抗原,地图2020年和2513年,因为他们承认与肺结核(表9和6个动物3),分别,因为他们没有被评估和报告文学。

这些结果有助于发展与七个抗原的抗原混合(1272年0210 c 0038年地图,地图,地图,地图1693 c, 2020年地图,地图2513年和地图0209 c)。

1272年地图ORF编码的一种蛋白质,具有一个NLP / P60领域发现的未知函数在几个脂蛋白。图0210码P36 / Erp的蛋白质牛分枝杆菌在我们实验室研究(19]。PSORTB分析软件预测地图2513是本地化在细胞质中,cytoplasm-membrane 0210 c的地图,地图1272和0209 c细胞外。剩余的蛋白质是未知的本地化。所有这七个蛋白先前没有被评估和报告文学,除了地图0210 c,已经研究了Willemsen et al。18]。

七抗原的鸡尾酒是印刷在硝化纤维膜和评估行打印与血清免疫测定与肺结核和健康对照组动物和动物实验感染牛分枝杆菌(图2)。行打印联用,14的25从动物血清与肺结核发达抗体反应的鸡尾酒。这种鸡尾酒并不承认与实验动物感染的血清牛分枝杆菌这里评估和两个健康动物的血清样本给一个非常弱的信号(图2)。

此外,elisa PPA-3和鸡尾酒和七个抗原与血清进行评估与肺结核从动物(),健康的动物(),和动物实验感染牛分枝杆菌()。

ELISA-PPA-3测试确认16的25个动物肺结核(64%)还12 17实验动物感染牛分枝杆菌25,而ELISA-cocktail发现18只动物肺结核(72%)和3的17个实验动物感染牛分枝杆菌(图3)。都与血清elisa没有反应未受感染的控制;然而,当使用血清牛分枝杆菌来华,ELISA-PPA-3测试认可(12/17)70年,5%的这些动物和ELISA-cocktail(3/17) 17日,这些动物的6%。

这个新的ELISA对牛PTB显示72%的敏感性和特异性高于ELISA与PPA-3抗原,用动物实验感染牛分枝杆菌。

4所示。讨论

肺结核的早期和特定的诊断仍然是一个挑战。人们普遍认为早期免疫反应感染地图包括细胞免疫反应的主要特点是干扰素γ生产,这反应后会被抗体生产所取代。然而,一些研究表明,抗体出现更早,因此ELISA可以作为早期诊断工具(6- - - - - -8]。然后有必要描述地图增加的敏感性和特异性抗原ELISA检测肺结核诊断。基因组测序的地图代表一个重大进步,很可能会造成新的诊断工具。特定的抗原,如小组的评价研究在当下工作的第一步是选择的候选人与肺结核的研究在不同的牛群。这是一个重要的领域,因为小说抗原,可以改善MAP-infected牛的诊断是必要的。

蛋白质组学的方法已被用于定义特定抗原地图蛋白质的2 d分数几位研究人员20.- - - - - -24]。另一种方法来获得特定的抗原表达重组蛋白的克隆MAP-coding序列和使用它们来构造一个蛋白质阵列(15]。这里我们选择1 d和2 d地图蛋白质电泳和发达macroarrays行打印这些蛋白质。这些macroarrays探测与动物血清与肺结核和健康对照组和动物实验感染牛分枝杆菌。

后评价从PTB-infected 54与血清蛋白的地图,实验感染牛分枝杆菌和健康的动物,我们选择了七个蛋白质,合并在一个开发antigen-based ELISA诊断测试(ELISA-cocktail)。这个新的ELISA对牛PTB显示72%的敏感性和特异性高于ELISA与PPA-3抗原(图3)。这种敏感性是基于25动物从地图粪便培养阳性或ELISA-positive牛,因为自然感染牛感染可能代表地图的不同阶段和血清样本只从培养阳性动物可以分化抗原表达模式(25]。此外,只有培养阳性动物的使用来评估ELISA的敏感性可能会增加测试的值,因为大多数培养阳性动物也ELISA-positive [11]。

这里给出的结果表明,几种特定抗原可以提高地图感染的检测。事实上,抗体反应差异的资料然后单一抗原的抗体反应并不突出,而同时使用几个重组抗原能够认识到持续感染的抗体反应过程中随着时间的推移。

总之,我们发现小说抗原的地图使用多个抗原免疫测定。这些知识的基础上,我们开发了一个抗原的鸡尾酒,这增加了正确的诊断MAP-infected动物相比,ELISA-PPA-3的结果。这项研究提出了一种抗原鸡尾酒,可以诊断的意义进行进一步的研究。然而,鸡尾酒需要评估通过大样本大小来估计其敏感性和特异性。此外,结果显示有54个蛋白质,表明其他蛋白质不包括也好的候选人。然后,新的鸡尾酒应该整合和评估提高ELISA检测的敏感性和特异性诊断的肺结核。

承认

这项研究由FONARSEC财务支持,皮克特人的通讯社的记者Nacional de Promocion Cientifica y Tecnologica阿根廷。

引用

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