文摘
獾(梅莱斯梅莱斯)涉及的传播牛结核分枝杆菌感染牛在爱尔兰和英国。爱尔兰最近的研究表明,尽管在獾疾病流行,疾病的流行并不是全国统一的和不同的亚种。獾的患病率水平在多大程度上影响牛的患病率是未知的。以前,DNA指纹分析表明牛分枝杆菌应变类型之间共享獾和牛,有大量的应变循环两种类型。在这项研究中,我们进行spoligotyping和可变数目串联重复序列(VNTR)的分析牛分枝杆菌隔离的两组獾,代表一个广泛的地理区域,有不同的结核病患病率水平。输入的结果表明,没有地理集群应变类型与流行有关。两个VNTR配置文件被识别,似乎与高和低流行率有关牛分枝杆菌分别感染水平。此外,spoligotyping和VNTR分析提供了证据,第一次个人獾的多重感染的不同牛分枝杆菌菌株。
1。介绍
在爱尔兰共和国(RoI)和英国结核病(TB)存在于獾人口(1];被感染的獾视为维护主机和直接涉及的传播牛结核分枝杆菌牛(2]。在RoI,作为中期战略的一部分,在牛结核病的控制,獾被删除(焦扑杀)当一个流行病学调查将牛羊群结核病崩溃与感染獾的存在。研究使用全面的尸检和细菌培养的组织已经发现感染患病率在这些扑杀獾(36 - 50%3)(角落,未发表)。
在最近的一次比较研究我们确定感染的患病率在獾地区的历史和持续感染牛患病率低(4]。獾从地理上分散的站点,所有检查使用详细的尸检和细菌学的过程。患病率显著降低牛分枝杆菌感染被发现在这些獾獾在焦扑杀。虽然牛的结果验证了使用作为结核病在獾的哨兵,他们也提出了问题的本质牛分枝杆菌感染高发病率和低患病率人群的獾。一种可能为不同的患病率的菌株牛分枝杆菌循环在这些人群不同毒性和传输从獾到獾,潜力和獾牛。虽然很少有人了解现场隔离的潜在毒性牛分枝杆菌菌株的DNA指纹图谱用于结核病的动力学研究动物和调查感染养殖和野生物种之间的联系(5,6]。这些研究揭示了许多不同的特性在牛群体传播在RoI和英国虽然详细的分析显示,99%以上的菌株源自一个克隆复杂命名Eu1 [7]。在以前的研究中,452例孤立的基因分型牛分枝杆菌通过限制片段长度多态性(RFLP)分析在RoI透露,最普遍的RFLP类型的广泛分布和现在在牛和獾(8]。菌株之间的关系与牛和獾在大面积显示,獾和牛往往有相似的菌株,与共享一致牛分枝杆菌菌株在一个区域并提供跨物种传播的证据(9]。
分子应变输入技术的发展的分化牛分枝杆菌压力大大增强的能力进行流行病学调查野生动物和家畜的疾病传播10]。在RoI spoligotyping和MIRU-VNTR打字是优于单独测试在揭示的多样性牛分枝杆菌在牛和獾流传的菌株11]。在目前的研究中我们应用spoligotyping和MIRU-VNTR打字的牛分枝杆菌隔离的獾的高位低流行率地区牛结核病;目的是调查是否相同或不同的应变类型与感染有关这些人群的患病率水平。
2。材料和方法
2.1。选择从不同的人群患病率獾
低流行率集团(LP)。详细的选择过程来识别领域的獾洞穴牛结核病群发病率最低的国家被描述在别处(4]。简单地说,这个过程利用了爱尔兰国家牛疾病数据库(动物卫生计算机系统,AHCSI),地块识别系统(这一)地理数据库,和地理信息系统(GIS)分析软件。獾被确定在历史上有一个低的地区群牛结核病患病率(< 2标准反应堆在前5年)。因为獾是一个受保护的物种在爱尔兰,宰杀动物的机会是严格限制在缺乏强有力的迹象存在的疾病。LP领域不符合常规獾扑杀,我们只授权访问LP区域獾在非常有限的基础上,我们限制收集每个网站一个獾洞穴与活跃。
地区(低流行网站)被确定在24个不同的县。地区调查了獾洞穴或獾活动的迹象,和138个地区被认为是积极的。捕获是在这些领域进行的,和一个獾被撤101网站与獾洞穴附近的活动。獾安乐死,然后进行一个详细的验尸的收集池细菌培养的组织。感染獾被确定在10个不同的县给感染这些獾人群的患病率为15.8%。
高发组(惠普)。为了比较,獾()从扑杀行动获得故障与牛群,来自地区16个不同的县RoI (3]。社会群体的大小范围从1到7平均值为1.62,平均为1。没有显著差异在大小不同的社会群体之间的感染率3]。的牛分枝杆菌在这一群体中感染患病率为36.3%。
2.2。尸体剖检
捕获的獾,曝露了盐酸氯胺酮(0.1毫升/公斤)和medetomidine (Domitor;0.1毫升/公斤),然后是安乐死注射了过量的钠pentabarbitone静脉。獾受到详细验尸包括考试咬或伤口。事后剖析考试,背躺着的尸体被气流表(Astec微流)。减少交叉污染的风险,独立的无菌工具被用来使淋巴结,打开腹部和胸腔蛀牙,揭露和剖析free-lymph节点从周围的脂肪和结缔组织,并收集部分内脏器官。从每个獾,20个独立淋巴结样本和样本的肾、脾脏和肝脏被培养为池(胸头,尸体和淋巴结,腹部淋巴结和器官,和肺)和任何咬的伤口,皮下脓肿或可疑病变总值是分开培养(3,4]。所有样本存储在−20°C之前文化。
2.3。的文化牛分枝杆菌、DNA提取和Spoligotyping
样本在选择性分枝杆菌培养媒体描述墨菲et al。3,4]。本研究的目的,獾被认为是感染时牛分枝杆菌被从任何样本细菌培养分离。多个殖民地产生每个组织样本从固体刮媒体和转移到一个包含500超小型电子管μL磷酸盐与渐变20 (PBS-Tw)(西格玛奥德里奇,威克洛郡,爱尔兰)。由热溶解细胞DNA提取所述McLernon et al。(2010) (11]。DNA模板存储在−20°C。Spoligotyping进行描述的方法显示Kamerbeek et al。12]除了digoxigenin标签和检测系统(罗氏诊断,西萨塞克斯郡)使用。Spoligotype模式中指定名称牛分枝杆菌spoligotyping数据库http://www.mbovis.org/。
2.4。VNTR打字
VNTR打字都使用了6个位点;2163(又名,QUB 11), 2163 b(又名,QUB 11 b), 2165(又名,ETR), 2996(又名,MIRU 26), 4052(又名QUB26)和1895年。六个基因位点被放大分别使用引物和聚合酶链反应(PCR)过程描述McLernon et al。11]。聚合酶链反应完成时,放大产品储存在−18°C到1000年分析使用MegaBACE(通用电气医疗集团生命科学)作为描述McLernon et al。11]。
2.5。统计分析
菌株的比较在獾是之间的领域,而不是个人的区域内。数据分析使用GraphPad棱镜(GraphPad软件、美国http://www.graphpad.com/)。卡方检验是用来分析spoligotypes的地理分布。
3所示。结果
3.1。獾的地理分布和分布在獾的感染
在两个高(HP)和低(LP)患病率人群,感染动物获得活跃的洞穴附近的在一个大的地理区域,为惠普集团和10个县16个县LP人口。这种地理集群效应的影响最小化的感染和特定应变类型。共有51隔离输入来自36个獾惠普人群(平均每獾1.4隔离,范围1 - 3)和42隔离来自16个獾LP人群(平均2.6隔离/獾,范围1 - 5)。两个或更多分离获得20獾:2组织池是积极的在11獾,三池2獾,≥4池7獾。五个獾合并感染两种不同的菌株,从HP组3和2的LP组。
3.2。Spoligotyping的牛分枝杆菌在惠普和LP獾隔离
有9个不同的獾spoligotypes确认,7类型36惠普獾,4中16 LP獾。SB0140是最常见的spoligotype在獾的人群,只除了SB0130 spoligotype常见的两组(表1)。没有证据表明地理集群的SB0140被确认在所有地区每组的獾来源。没有显著差异(测试中,)的比例獾感染这种spoligotype之间的团体,它是存在于13日16(81.3%)獾的LP的人口,和24的36(66.7%)獾HP组。
3.3。VNTR分析牛分枝杆菌隔离
小组6 VNTR基因座细分93分离株对22株类型,有17个VNTR类型的獾HP组和9 VNTR LP组类型。集团的压力轴承spoligotype SB0140,总共有17个不同的VNTR类型识别(表2)。十三的VNTR概要文件被确定在24獾属于惠普集团7日出席在13 LP集团的獾。其中两个VNTR类型差异体现在惠普和LP组。VNTR类型11 3 7 5 4 4,被发现在8/13(61.5%)与SB0140獾LP,然而,它被发现在只有1/24(4.1%)獾SB0140感染HP组。VNTR类型11 4 7 5 4 4被确认在9/24(37.5%)的獾HP组SB0140感染,但在只有1/13(7.7%)的LP獾SB0140感染。剩下的VNTR类型属于SB0140和其他spoligotypes出现在低獾从每组的数量。没有证据表明两个主要地理集群的VNTR类型,都被发现在獾在广泛的地理区域。
3.4。獾与多个合并感染牛分枝杆菌应变类型
五个獾合并感染两种不同的菌株,3 HP组和LP的两组(表3)。在两个獾的菌株被spoligotyping分化,而其余三也感染菌株轴承spoligotype SB0140 VNTR分化的分析。没有任何感染的獾之间的空间关系,每个动物起源于不同的区域。獾属于LP组,co-infecting菌株之一是孤立的病变,称为“sub-mandibular淋巴结肿大。“co-infecting应变的分布受感染的组织是孤立的(表3)没有透露任何偏爱网站。
4所示。讨论
在RoI,獾患病率研究进行了使用一个详细的尸检和细菌学的检查表明,感染的发病率牛分枝杆菌,与盛行的地区感染牛、地区明显高于感染牛的患病率较低(3,4]。虽然可能有各种流行病学因素负责这些患病率的差异,其中大多数并不显而易见,可以解决的一个问题是,患病率的差异在獾流传的菌株相关的人口。在这项研究中牛分枝杆菌菌株的spoligotype SB0140被惠普和LP獾之间的主要组。在此前的一项研究中大约有50%的386株,主要来自牛和獾,这spoligotype [11]。在目前研究的比例压力轴承spoligotype SB0140高尤其是LP的獾,81.3%的菌株是这种类型的。然而,这些差异可能是由于采样因素和少数孤立的结果可用于打字。Spoligotype SB0140有着广泛的分布和长成立于RoI (11),被发现在同样高频率高和低流行地区,似乎不是一个感染的患病率在獾的决定性因素。
当VNTR分析被用来进一步区分菌株,最多的VNTR概要文件被发现在SB0140菌株,其次是SB0130。这是一致的分析更多的从牛隔离,獾,和鹿11]。最有趣的结果从当前研究的不平等表示两个VNTR配置文件之间的SB0140菌株惠普和LP獾组。观察这些概要文件有一个广泛的地理分布表明,发生的频率并不是因为最近的地方特定应变类型的克隆扩张。人们很容易推测,他们的群体在每组患病率表明毒性菌株的特性,对两种人群的感染发病率的影响。分析一个更大的样本容量应该帮助澄清的国家分布每个应变类型和可能解决他们的协会与感染的患病率在獾。牛隔离的VNTR概要文件从大样本显示VNTR类型都存在于牛,所以配置文件并不是唯一的被感染的獾(未发表的结果)。在西班牙,类似的应变进行类型化研究野生动物(鹿、野猪、伊比利亚猞猁和福克斯)和牛表明,虽然许多牛分枝杆菌spoligotypes野生动物和牛之间共享,有spoligotypes独特孤立从牛13]。
獾合并感染不同菌株的发现牛分枝杆菌没有前面描述的感染和发病机理提出了问题和感染的来源。一种可能性是,感染后的菌株是在獾单一菌株。然而,在只有两个獾(HP108 HP212,表3)这可能是可能的,在只有一个VNTR轨迹是有区别的。的spoligotypes HP95不可能是来源于彼此由单个基因变化,VNTR概要文件也在四个位点不同。此外,VNTRs LP240不同在两个位点有差异spoligotypes和VNTRs LP307。强烈的证据指向合并感染,最可能的解释多种菌株。
合并感染与人口有关的不同的应变类型可能不流行,因为它在每个流行组被发现。獾窝藏多个菌株可能是多个传输事件的结果作为气溶胶感染是由于单一细菌克隆(14]。动物的观察也表明,合并提供免疫感染原有限应变这并不阻止随后的感染。因此,重复接触通过常见的感染途径的感染可能导致启动额外的压力。我们只能确定多重感染通过应变类型上的差异,和多个感染可能是更普遍比我们报道,因为菌株可能无法区分,和獾可能被感染的菌株相同spoligotype或VNTR形象最初的感染。此外,作为文化的最初样本集中,任何co-infecting应变出现在非常低的水平在一个池可能没有被发现。
多重感染的来源可能是传输从相同的社会团体或其他獾从移民獾。地区獾在连续几年被扑杀,它已被观察到,RFLP应变的概要牛分枝杆菌在每年特定的洞穴可以改变和最可能的结果向内迁移新獾。LP集团获得了从历史低位的区域结核病牛,是最有可能感染导致獾獾传播如RoI有很少的报道牛分枝杆菌感染其他野生动物,只有在野生鹿(15,16]。鉴于感染的患病率在流行团体,最合理的解释是,多重感染来自接触来自不同地区的獾由于领土之间的运动。虽然VNTR分析揭示了人口大品种的多样性,发现多个菌株在个人獾可能反映了大量的獾之间的交互。合并感染的野生动物(马鹿、小鹿和野猪)与多个菌株牛分枝杆菌已经记录在西班牙,突出multihost交互的复杂性和多个菌株的传播17]。感染牛分枝杆菌中最常见的是其潜在的形式在獾3),这种形式的感染会影响最小獾的行为,获得新感染的风险之前不太可能会受到感染。
獾的感染,肺部感染的高患病率强烈支持肺部原发感染的主要网站和吸入的感染性气溶胶粒子是主要的传播方式。然而,其他航线包括传播通过被感染的咬伤发生(3]。不同的VNTR类型的分布在每个合并獾没有提供信息来推断可能的感染途径。的传播和维护牛分枝杆菌在獾的人群是一个复杂的过程,许多因素影响群体内的患病率和传播。可能每个菌株的感染剂量可能体内的传播水平决定的。
这项研究的结果提供进一步证据的跨境流动的獾和菌株的歧视spoligotyping, VNTR分析表明,獾会导致病毒的个体之间的交互獾有不同的菌株。识别不同的VNTR资料也表明,不同菌株感染可能与当地流行有关。一个字段与卡介苗接种试验獾正在进行中(18]。虽然它已经证明了波士顿咨询集团是有效地防止俘虏獾实验牛分枝杆菌感染,还有待确定,如果疫苗对许多同样有效牛分枝杆菌应变类型中发现獾(19]。
确认
这项工作是由欧盟第七框架项目拨款,没有。TB-Step kbbe - 2007 - 1),从农业部门的协助下,食品和海洋食品ERAD计划。作者希望承认提供的支持埃尔韦拉Ramovic和员工从中央兽医研究实验室(CVRL) Backweston有限公司基尔代尔、爱尔兰。