文摘
本研究的目的是利用牛结核病可疑牛从密歇根州验证multiantigen打印免疫测定用于血清作为一种改进的补充,经测试,增加当前结核病测试方法的特异性。在27个月的时间内,234血清被MAPIA收集和测试方法,使用四个不同的解释标准进行评估。这些结果随后被最终分枝杆菌培养和PCR结果相比,由国家兽医服务实验室,艾姆斯,IA,作为真正的牛结核病感染状况的指标。本研究表明,一个解释准则包括3或更多积极反应11个不同分枝杆菌抗原利用提供了一个可接受的敏感性(69.39%)和高特异性(90.27%)。MAPIA技术显示了最终的应用程序作为补充,经潜在结核病血清学测试后的各种电流或soon-to-be-approved整个群筛选化验为根除结核病项目的一部分。
1。介绍
明尼苏达州以来重新归类为牛结核病认证免费10月,2011年,很少有美国州剩下的牛结核病流行在国内牛或自由放养野生动物储存宿主(1]。目前,只有密歇根和加利福尼亚并不属于全国性的牛结核病accredited-free状态。因此,这些州的逻辑位置进行试验新的或替代牛结核病化验。
牛结核病的持续下降在美国,再加上持续的经济衰退,导致美国农业部对牛结核病监测和评估当前的方法根除(2]。美国农业部现在将增加选项来管理tuberculosis-infected牛群,和其他开发替代性控制策略比骆驼群灭绝。作为这个过程的一部分,美国农业部也加速发展新牛前测试的诊断测试。快速测试或侧流试验是一种新的诊断测试使用牛血清目前在美国农业部许可前最后阶段的验证和市场介绍3]。这个新试验的需要之一,是发展上用作后续补充试验牛视为嫌疑人或反应堆最初的快速测试,就像比较颈试验使用了几十年的补充试验牛尾尾折叠测试反应。
在过去的三年里,我们实验室已经标准化,验证,应用multiantigen打印免疫测定(MAPIA),最初是由Lyashchenko等(4]。这是前免疫印迹分析利用的几个特定抗原将包含在快速测试,因此成为一个合乎逻辑的选择补充试验。所有当前批准,经牛结核病测试(颈尾折叠测试,比较测试,gamma-interferon化验)都是基于检测细胞免疫反应。MAPIA血清学试验,测试体液免疫反应(5]。目前,密歇根仍在处理的过程中牛结核病流行的野生白尾鹿,每年波及多个国内牲畜每年,所以密歇根是一种自然的位置,调查的具体功能分析在野外条件下,利用血清暴露怀疑和牛。此外,虽然目前的特异性的批准尾折叠测试和比较颈化验一直报道的高90百分位数,我们发现我们的诊断实验室处理10、20、30或更多补偿怀疑牛获得一个积极感染个体(5]。我们的目标在本研究试图开发一个补充,经测定,并对其可显著降低假阳性(即。,increase specificity) that current screening methods were producing, while still maintaining a high enough sensitivity to move the detection and eradication process for bovine tuberculosis forward.
2。材料和方法
2.1。牛
从活牛血清收集提交诊断中心人口和动物健康,密歇根州立大学,密西根州农业部结核病测试作为正在进行的根除结核病项目的一部分。使用美国农业部统一的方法和规则,这些牛被归类为尾折叠测试嫌疑人或反应堆(客运嫌疑人),比较颈测试嫌疑人(有条件现金援助嫌疑人),gamma-interferon化验(IFN -嫌疑人γ嫌疑人)、γ干扰素(IFN -试验失败了γ失败),反应堆牛不指定初始试验利用反应堆(NS),回溯来自牛结核病正群(回溯),或牛接触到另一个已知的阳性动物(暴露)6]。牛通常是现场测试使用结核菌素3至6周之前提交诊断中心,尽管一些牛我只要2到4个月后实地测试之前提交。根据目前的方法,回溯和暴露的牛都不需要进行任何经结核病测试前清除和尸体剖检/屠杀。采血后,牛被人道安乐死和接受完整的尸体剖检包括收集所有主要淋巴结从他们的头部,胸部,腹部,常规组织病理学,抗酸的染色,和分枝杆菌文化、国家兽医服务和PCR实验室,艾姆斯,IA (7]。所提供的文化和PCR结果NVSL担任的黄金标准是否牛感染了牛结核分枝杆菌与否。这些牛都是采样之间2009年7月1日,9月30日,2011年。例外包括两个牛之前采样4月30日,2001年,在一个先进国家的肺结核和担任首次试验阳性标准化;从其他州20已知阳性血清(内布拉斯加、得克萨斯、南达科塔州、科罗拉多州和印第安纳州)从美国农业部结核病血清购买银行增加积极研究中样本的数量;和11个肉牛有重大病变来自密歇根直接去屠宰,但收集的血清和相同的淋巴结组织病理学,NVSL文化,进行PCR检测。
2.2。MAPIA
MAPIA化验是以前描述的技术(略有修改4,8]。简而言之,血清存储冻结在−20°C,解冻,并稀释1:20。十一个抗原稀释50μ在PBS g / mL,然后用一种半自动的airbrush-printing设备(Linomat 5 Camag科学Inc .威尔明顿数控、美国)在硝化纤维膜Protran硝化纤维素膜(绘画纸、Dassel、德国)十一12厘米长平行带。蓝色污点(Coomassie蓝色R350,通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)也应用于膜作为指标的正确的膜的一面,表明膜的底端,作为标准参考每个膜上的抗原抗体反应的强度进行比较。干燥后,膜被垂直于抗原条约4毫米宽,创建测试条和11个不同抗原车道+ Coomassie蓝带。条被封锁的1小时1%的脱脂牛奶磷酸缓冲盐(PBS)与0.05%渐变(马里兰州盖瑟斯堡科克加德和佩里实验室Inc .,,美国),孵化与每个血清样本稀释1:20 PBS(科克加德和佩里实验室)2小时,洗了三次与PBS反应蛋白G (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)为1小时,洗了三次,最后对3 3′,5、5′-tetramethylbenzidine过氧化物酶(三甲一养分膜过氧化物酶底物,科克加德和佩里实验室)为5分钟。条是用冷水冲洗3次停止反应,然后风干一夜之前阅读的结果。条结果被肉眼看是消极的,积极的反应是不是薄疲软和强度弱于控制群Coomassie蓝色污点,或者强阳性反应的线是一样厚,类似的强度Coomassie蓝着色乐队。
2.3。抗原
抗原选择使用先前报道作为经常发生牛结核分枝杆菌或结核分枝杆菌,或者诱导牛牛结核病感染显著抗体反应(9]。这些重组抗原包括ESAT-6 [10,11)(staten血清研究所,哥本哈根,丹麦);ESAT-6 / CFP10融合蛋白(12]和MPB83 [13,14](由国家动物疾病中心的合作者,艾姆斯,IA);Acr1 [15],38 kDa [16],45 kDa [17],Ag85B [18],gro [19](所有从结核病疫苗测试和研究材料合同,科罗拉多州立大学,柯林斯堡有限公司,美国),和MPB59 MPB64, MPB70 [20.](由合作者提供食品和生物科学研究所贝尔法斯特北爱尔兰)。
2.4。统计分析
MAPIA结果解释使用NVSL分枝杆菌培养和PCR结果真正的牛结核病的状态测试。开发了四种不同的标准分析解释如下。标准是任何单一抗原阳性反应;标准两个任意两个抗原是积极的反应;标准三个积极的反应任何3或更多的抗原;标准四是任何单一抗原强阳性反应。这些计算的敏感性,特异性,阳性或阴性预测值。此外,每一个抗原是评估敏感性,特异性,阳性和阴性预测值。
3所示。结果
测试的234头牛在这项研究中,49是真阳性牛分枝杆菌的基础上积极的文化和PCR阳性结果牛分枝杆菌IA NVSL,艾姆斯。作者承认一些积极的牛在感染的早期阶段可能没有表现出毛或肺结核和组织学病变可能没有被检测到当前文化的方法;然而,对于本研究真阳性牛必须积极的分枝杆菌培养或PCR结果。剩下的185头牛是真的否定基于- PCR和文化的结果。
四个标准用来评估MAPIA结果如前所述的方法。这些标准的1、2和3都提供了良好的敏感性比个人的真阳性状态牛测试(见表1)。但是标准3提供了迄今为止最好的特异性为90.27%,明显优于标准1或2。此外,使用阳性预测值,则3是最好的标准,正确地识别近三分之二的真阳性动物看作是积极的,而标准的1和2的阳性预测值有显著降低。因此,对于我们目前的情况在密歇根,则3证明是使用MAPIA测定的最佳方法。
表2说明标准3与每一个临死前的类别的牛(客运嫌疑犯,CTT嫌疑犯,IFN -γ怀疑,等等)。这一标准关联与钢管怀疑/反应堆和干扰素-最好γ犯罪嫌疑人,而它并不相关,有条件现金转移支付嫌疑犯。没有真阳性牛回溯和暴露的牛,所以其性能的方法不能有效地评估这些类别。牛在这项研究中也没有包括在表中2如果他们最初的现场测试方法(钢管,有条件现金援助,干扰素-γ)还不清楚。
表3比较了敏感性、特异性和阳性和阴性预测值为每个11特定抗原用于我们的MAPIA化验。而ESAT-6和ESTA-6 / CFP10融合蛋白的敏感性最高,职责(83.67%和87.76%),也证明了这两种抗原特异性最低resp(47.57%和70.27%)。剩下的其他9抗原测试表现出显著降低敏感性,而且均匀更高的特异性。
4所示。讨论
MAPIA分析在我们的实验室,与已知的正面和负面的牛结核病感染牛主要来自密西根州提供承诺作为补充测试。MAPIA化验需要一些专业设备,一些比较昂贵的试剂,大约4.5小时的时间来运行。时间、设备成本都低于最优分析整个群体筛查。但作为后续或补充测试,特别是客运,分析当解释使用标准3提供高灵敏度(84.62%)和特异性(92.31%)高。这反过来会导致巨额货币储蓄州和联邦机构通过显著减少牛的总数补偿,运送尸体剖检设施,接受广泛的事后测试。
例如在节约成本和使用234头牛包括在这项研究作为一个例子,如果我们以前运行MAPIA牺牲这些牛,只有78会被认为是犯罪嫌疑人和送去验尸使用标准3。MAPIA成本100美元和150美元之间运行包括试剂、技术员的时间,等等。234头牛血清乘以150美元导致额外的补充测试成本为35100美元。现在我们计算的成本牺牲其他的156头牛MAPIA会列为嫌疑犯。目前在密歇根最高赔偿3500美元每头牛;我们将1750美元平均赔偿成本的估计一头奶牛。添加在密歇根州支付4结核病流行地区的运输费用到实验室,估计为150美元每头牛,诊断实验室的250美元每头牛结核病监测检查,和额外的费用由美国农业部分枝杆菌培养、PCR和组织病理学上的收获淋巴结每头牛估计为450美元。这个总数平均每头牛的成本2600美元。156头牛乘以2600美元的平均成本我们得到一个额外的405600美元的成本。的额外成本35100美元额外MAPIA测试,超过405600美元的额外的牛成本所抵消,导致净储蓄370500美元。 This is not a perfect result as 12 true positive cattle would have remained on their farms since MAPIA criterion 3 did not call them positive. However, this assay can be interpreted by various criteria. Criterion 1 would have only missed one positive cattle, and criterion 2 would have only missed three positive cattle; but both criteria would have required the sacrifice of additional cattle, resulting in lower total monetary savings. Remember that each state could select the MAPIA interpretation which makes the most sense for their situation. In Michigan, you might reasonably select criterion 1 to miss the lowest number of positive cattle since tuberculosis is present in both the cattle and wildlife populations. Most of the US states are free of tuberculosis and could select a more specific interpretation criterion by which to use the MAPIA. The interpretation could also be adjusted depending on the area the cattle were in (accredited free, modified accredited free, etc.), or if the farm was known to have other currently infected animals or if the farm had previously contained infected animals then more sensitive criterion could be used.
一些研究人员指出,ESAT-6或ESAT-6 / CFP10的抗原用于经血清学的检测肺结核(9- - - - - -12,21]。我们的数据表明,这两种抗原做检测最高百分比的真阳性结核性牛和导致灵敏度最高。然而,我们的研究结果也显示了两个抗原的特异性较低,由于许多假阳性。这些抗原可能没有那么具体牛结核分枝杆菌正如前面。或者,他们这么早分泌的免疫反应,他们可能会增加迅速结核菌素皮内注射后的钢管或有条件现金转移支付测试,因此导致假阳性。最近的一项研究实际上记录显著提高总量作为分母牛这皮内注射结核菌素试验的使用后,导致增加八个不同的分枝杆菌抗原的免疫球蛋白水平衡量MAPIA时(9]。不管什么原因,其他的所有9抗原用于这项研究有显著较高的特异性(从88.65%到100%),而且还大大降低敏感性(从2.04%到48.98%不等)。有趣的是9抗原的评价除了ESAT-6和ESTA-6 / CFP10两抗原灵敏度最高的45 kDA, MPB70(敏感性为48.98%)。MPB70已被证明有高灵敏度检测结核性牛在在许多国家进行的调查21]。因此,通过使用一个标准MAPIA解释相结合多个抗原反应,一个收益增加特异性,同时保持整体灵敏度高。
寻找更强的积极反应的标准4 MAPIA没有增加灵敏度,但实际上减少敏感性(59.18%),最低的四个标准。这可能反映了抗体反应的不那么重要的角色相比,结核病感染细胞介导免疫;因此,受感染的牛不一定发展最高对分枝杆菌抗原抗体反应。不管是什么原因,antibody-antigen反应强度与真正的肺结核没有高度相关的地位。出于这个原因,作者选择了简化的阅读和报告分析三个简单的反应,消极,弱或强和不包括定量光密度测量中为每一个抗原抗体反应MAPIA试验在一些先前的研究4]。
一个有趣的边注是如何MAPIA试验是在牛为阴性牛分枝杆菌,但是从外环境分枝杆菌结核分枝杆菌集团被孤立。只有四个牛的234文化是积极的m . avium(2隔离)或非结核分枝杆菌组(2隔离),而不是另有规定。所以数字太低概括MAPIA分析如何执行。然而,这些4牛被统一解释- MAPIA测试通过标准2,3,4;虽然2 4牛(非结核分枝杆菌标准1组个人)解释是积极的。这强化了价值利用一个解释准则,其中包括超过一个积极的方法来增加测试特异性反应。
MAPIA将继续在理想情况下,我们的评估,测试更多的积极的和消极的牛。此外,如果有一天这个试验被农业部批准为补充测试,在理想情况下,我们宁愿跑我们所有库存血清样本的快速test-lateral流试验。assay-as之前是审批过程的验证和许可使用在美国(3]。以来,分析利用几个相同的抗原MAPIA,和是一个经血清学的检测,这将是重要的比较这两个相同的一组血清的检测性能。然而,由于快速测试还没有批准,所以不是商业化,我们无法完成这个重要的验证步骤。
MAPIA化验需要一些专业设备,一些比较昂贵的试剂,大约4.5小时的时间来运行。然而,适当的应用程序的方法,选择测试抗原,和正确的解释标准,它显示了非凡的承诺作为有限的补充测试后初始场前筛查。虽然MAPIA目前过于昂贵使用作为主要的筛检试验牛结核病,其使用增加灵敏度或特异性取决于国家的具体需求,区域或农场,当用作补充测试,可能是有价值的作为一个流行病学工具,并有可能带来巨大的成本节省国家根除结核病项目。
确认
作者感谢农产品和生物科学研究所的詹姆斯•麦克奈尔博士,北爱尔兰,贝尔法斯特慷慨地为他们提供MPB59, MPB64,和MPB70抗原在这项研究中,使用雷博士以及水域,牛结核病实验室,国家动物疾病中心,美国农业部,埃姆斯IA,慷慨地向他们提供ESAT-6 / CFP10融合蛋白和MPB83抗原。他们也要感谢很多密歇根农业部和美国农业部兽医帮助,经现场测试,运输和出血的牛组成的大部分在密歇根州动物测试。他们要感谢许多兽医病理学家,解剖病理学居民,和实验室技术人员协助最终的验尸和样本收集来自密歇根牛诊断中心的人口和动物健康,密歇根州立大学;没有他们的帮助作者不会有明确的信息为结核病牛是积极的和消极的。最后他们承认金融支持本研究得到了美国农业部帮助使这个研究成为可能。