肺部疾病结核分枝杆菌马:人畜共患疾病的担忧和死前检测的局限性

摘要

一例由结核分枝杆菌是在一匹马身上确诊的。在安乐死前进行的临床评估不提示肺结核，但死后检查提供了分枝杆菌病的病理学和细菌学证据。在肺部，多发性结核性肉芽肿与细支气管管腔相通，胸腔积液，累及纵隔和气管支气管淋巴结的肉芽肿性淋巴结炎。血清学反应结核分枝杆菌在受感染的马中检测到了抗原，但在42只可能暴露于病毒的动物(18匹马、14只羊驼、6头驴和4只狗)中没有发现抗原，这些动物没有显示出疾病的迹象。在活马中诊断结核病仍然非常困难。在该农场的20名动物饲养员中，有4人在干扰素释放试验的后续检测中结核菌感染呈阳性，表明可能存在种间传播结核分枝杆菌．

1.介绍

肺结核(TB)是一种由人兽共患病引起的疾病结核分枝杆菌，牛分枝杆菌，或其他成员结核分枝杆菌复杂的哺乳动物宿主[1，2］.尽管人类和动物对感染的自然易感性可能有所不同，但物种间传播并不罕见，特别是在已报告有多宿主结核病暴发的圈养野生动物种群中[3.，4］.马被认为比其他牲畜更能抵抗分枝杆菌感染[5- - - - - -8］.目前马的结核病发病率极低，特别是在已有控制规划的国家[9］.然而，马的临床病例由于疾病牛分枝杆菌，m . avium,或结核分枝杆菌已被描述[7，10- - - - - -12］.在结核分枝杆菌中，牛分枝杆菌在历史上是主要的病原体，然而结核分枝杆菌很少与马隔离[9，13］.然而，许多国家有效的牛结核病控制项目进一步降低了发病率牛分枝杆菌在过去的20年里被马感染。最近，由于牛分枝杆菌由Keck等人报道[14在法国卡马尔格地区，一匹与受感染的牛有密切接触的马牛分枝杆菌斗牛的感染个案[15］.

马分枝杆菌感染的诊断因病变形态不典型、感染临床症状多样以及死前检测的选择有限而难以确定[9］.最常见的临床症状是嗜睡和慢性体重减轻。马肺结核的晚期症状是发烧、呼吸困难和咳嗽。在大多数国家，由于结核菌素皮试在本物种中准确性较差，不建议使用[4，16］.马结核病的明确诊断依赖于死后的检查和组织病理学评估，包括抗酸染色和PCR是6610(标识结核分枝杆菌复杂有机体)和培养分枝杆菌spp . .目前，还没有针对马的基于血液的结核病检测方法。

多个抗体检测平台采用重组蛋白结核分枝杆菌或牛分枝杆菌已被开发用于快速检测多宿主物种的结核病，包括自由放养和圈养野生动物以及家畜[17- - - - - -21］.由于这些分析显示了在广泛物种(如牛、鹿、骆驼、大象、獾、野猪等)中应用的潜力，它们也可能对马的死前结核病诊断有用。本报告描述了一例由结核分枝杆菌在一匹马中，随后对该农场的接触动物和动物饲养员进行调查，并对指示病例的血清学反应进行评估。

2.材料和方法

２.１.动物

首例病例是1993年从波兰输入瑞士的一匹20岁的罗马尼亚温血骟马(Orlov马)。另外14匹马与首例同住在一个马厩内。在马棚附近的牧场上生活着58只动物，包括14只羊驼、6头驴、29只山羊、5只绵羊和4匹马，由同一名工作人员负责照顾。四只狗可以自由进出马厩和牧场。此外，5匹来自美国已知无结核病地区的马被纳入研究，作为血清学评价的阴性对照组。

２.２.结核分枝杆菌的鉴定

如前所述，在福尔马林固定、石蜡包埋的肺和肺淋巴结组织样本上通过PCR鉴定分枝杆菌[22］.提取DNA，按所述进行spoligotyping [23］.数据用Microsoft Excel编制，使用MIRU-VNTR +在线分析工具(http://www.miru-vntrplus.org） ［24］.分化的结核分枝杆菌复合物成员采用基因型1 MTBC检测(Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany)。

2．3.结核菌素皮肤试验(TST)

山羊和绵羊采用单一宫颈结核菌素皮肤试验，该试验是通过皮内注射2000 IU牛纯化蛋白衍生物(Bovituber, Synbiotics Europe, Lyon, France)进行的。

２.４.血清学

用于快速检测不同宿主物种结核病的三种血清学检测方法包括VetTB STAT-PAK、多抗原打印免疫分析(MAPIA)和双路径平台(DPP) VetTB检测(Chembio Diagnostic Systems, Inc.， Medford, NY, USA)。免疫分析程序是按照先前所述的制造商说明使用动物血清样本进行的[19］.VetTB STAT-PAK试剂盒(又称快速检测试剂盒(RT))和DPP VetTB检测采用多种重组抗原结核分枝杆菌或牛分枝杆菌包括ESAT-6、CFP10和MPB83蛋白。此外，我们在DPP试验中应用了脂多糖甘露聚糖(LAM)进行抗体检测。MAPIA采用了一组14种分枝杆菌抗原[20.用过氧化物酶标记的链球菌蛋白G (Sigma, St. Louis, MO, USA)稀释1:1000检测血清IgG抗体，或用过氧化物酶标记的马IgM抗体(Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, MD USA)稀释1:1000检测血清IgM抗体。以及底物3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(Kirkegaard Perry Laboratories, Gaithersburg, MD USA)。如前所述，通过DPP阅读器以相对光单位(rlu)测量反射率，或使用密度法以任意单位测量MAPIA波段的强度来直观地读取测试结果[19］.

2．5．干扰素释放试验(IGRA)

T-SPOT。结核病一个ssay (Oxford Immunotec, Oxford, UK) was used in accordance with the manufacturer’s recommended procedure for screening of the farm personnel for latent TB infection (LTBI). The employees were additionally tested by chest X-ray to rule out active pulmonary TB. Two months after the euthanasia of the infected horse, a total of 20 persons including the owner and his companion, the veterinarian, 2 pathologists, 7 workers in the stable, and 8 employees of the farrier were evaluated. Five subjects originated from countries with moderate incidence of human TB (3 from Bosnia, 1 from Portugal, 1 from Turkey), whereas 15 subjects were from low-incidence countries (11 Swiss, 2 French, 2 Italian). Eighteen individuals were evaluated by chest X-ray (all employees, except for the 2 pathologists), and 17 persons had the T-SPOT.TB assay. The IGRA testing was not performed for the 3 oldest subjects (aged 65, 79, and 93) because of the low sensitivity demonstrated for this test in senior population [25]，并通常较有可能感染先前获得的传染病[26］.检测结果阳性的受试者就诊，包括病史访谈和临床检查。

3.结果与讨论

３．１．临床研究结果

指示病例是一只20岁的罗马尼亚温血公马，2010年7月出现心功能不全和腹侧水肿症状，怀疑有心包炎和氮血症迹象，被送往伯尔尼大学马诊所。在转诊之前，马已发烧(40.0°C)，并显示在胸和腹区水肿4天。兽医给这只公马注射了抗生素和非甾体抗炎药。在将马送到伯尔尼大学的马诊所时，这匹马的心率为每分钟60次，呼吸频率为每分钟40次，直肠温度为38.3°C。粘膜湿润，微红，毛细血管再充盈时间2s。全血细胞计数显示填充细胞体积为39%，明显的高蛋白血症为80 g/L，明显的白细胞增多(/μL)和嗜酸性粒细胞增多(/μ2 g/L时纤维蛋白原在正常范围内。尿素和肌酐均在18 mmol/L和233μ分别mol / L。胸部超声检查显示严重的双侧胸膜和心包积液。在引流胸腔积液中测定的乳酸与血清乳酸水平无差异。未行心包穿刺术。引流胸腔积液后的x线片显示致密的支气管间质。胃镜检查未见食管、胃异常。临床鉴别诊断包括胸内肿瘤和感染性肺炎伴胸膜炎。24小时后，病情迅速恶化，呼吸急促加重(呼吸频率40次/分钟)，胸腔积液迅速复发。在这一点上没有病原学诊断;然而，由于恶化的临床进展和谨慎的预后，业主选择对马实施安乐死。

３.２．尸体剖检结果

肺实质可见2 ~ 3mm的棕褐色实性结节。气管支气管和纵隔淋巴结中度肿大，表面不规则，多结节。切面淋巴结可见多个坏死中心的结节。严重急性纤维素性心包炎和急性至亚急性纤维素性胸膜炎，伴有大量胸膜渗出和多发胸膜横膈膜及胸膜心包粘连。其他的发现包括轻度弥漫性皮下水肿，心内膜纤维弹性增生和沿胃粘膜鳞状部分的马孔肌的急性溃疡。

组织学上，肺和肺淋巴结中可见典型的结核样肉芽肿，中央坏死，周围有上皮巨噬细胞和多核朗汉斯巨细胞，并伴有少量淋巴细胞(图)1）.部分肉芽肿位于细支气管壁内。多发肉芽肿纤维化明显，伴少量多核巨细胞。肺和淋巴结多发肉芽肿的Ziehl-Neelsen和Fite-Faraco染色未见抗酸杆菌。基于这些发现，一个推定诊断肺分支杆菌病引起的有机体结核分枝杆菌复杂的。

使用福尔马林固定和石蜡包埋的肺和淋巴结组织样本，结核分枝杆菌DNA提取液经PCR扩增鉴定。没有尝试培养分离，因为在尸检收集的标本都进行了组织学处理。Spoligotyping显示结核分枝杆菌显示孤儿八进制代码的复合物(575247437763771)。

因此，马的尸检结果显示有粟粒结核伴胸腔积液和坏死淋巴结，其中一些已经侵蚀到支气管。早期研究(载于[9，13)，表明大多数马的结核病病例是由于牛分枝杆菌最常见的感染部位是胃-肠道，表明摄入(口腔途径)是该宿主的主要传播途径。相反，我们发现疾病是由于结核分枝杆菌主要集中在胸部器官。这一特征，加上观察到受感染的马在死亡前至少咳嗽了两天，强调了与该病例相关的人畜共患病担忧。

３．３．抗体反应

采用RT、MAPIA、DPP等多种抗原检测患者安乐死时的血清。的结核分枝杆菌-感染马的RT或DPP VetTB检测无反应，提示血清中未检测到ESAT-6、CFP10和/或MPB83抗体。MAPIA检测到MPB70蛋白的IgM抗体和较强的IgG抗体反应牛分枝杆菌然而，在该农场18匹可能暴露但假定未感染的马的血清中，没有发现针对MPB70的IgM，只有与MBCF结合的边缘性IgG(图)2)或来自美国的5匹阴性对照马(数据未显示)。在MAPIA中使用的其他抗原在受感染的动物中没有引起可检测的抗体反应，也没有提供区分指示病例与其他马的能力。此外，使用的LAM结核分枝杆菌与对照组(5±12 RLU)相比，受感染马的血清IgG反应性强(DPP reader reflectance = 235 RLU)。)或潜在暴露但推定未受感染的马(8±14 RLU，）.这一观察结果与MBCF对MAPIA IgG的反应性一致，可能是因为这种原始抗原制剂含有LAM，众所周知，在被诊断为结核病的人和动物中，LAM可引起特别强大的抗体反应(我们未发表的观察结果)。

因此，受感染的马对某些结核分枝杆菌抗原，如LAM, MPB70或MBCF。抗体反应性包括IgM和IgG两类，也已在实验感染的牛中显示牛分枝杆菌［17］.马血清识别的抗原不包括之前针对其他宿主物种的研究中识别的关键特定靶点，如ESAT-6、CFP10或MPB83蛋白[18］.因此，使用后一种抗原和为这些物种设计的可用的动物侧试验未能在受感染马的血清中检测到特定抗体。这些结果表明，当开发针对不同宿主的新型结核病免疫诊断方法时，验证针对每个新物种分别选择的诊断重要抗原的选择是至关重要的。在目前的研究中发现了感染M. tuberculosis的马的抗体反应，鼓励了进一步努力，以确定合适的抗体反应性抗原，为该物种开发准确的结核病血清诊断方法。

3．4．测试接触动物

14匹马住在同一个马厩里结核分枝杆菌来华的马。其他的马()、山羊()、羊(),驴()，以及羊驼()住在靠近马厩的牧场上，由同样的工作人员照顾。四只狗可以自由进出马厩和牧场。这些动物被认为是暴露的，因为它们曾直接或间接地接触过结核分枝杆菌来华的马。所有山羊和绵羊的TST均为阴性。没有对马、驴、羊驼和狗进行TST，因为这些物种没有有效的协议。用RT、DPP VetTB和MAPIA对羊驼、驴和狗进行血清学检测无抗体反应。迄今为止，这些动物都没有出现与结核病相一致的临床症状。

3．5．测试农场人员

T-SPOT检测LTBI。结核病一个ssay, in accordance with the United States (Center for Disease Control and Prevention) and Swiss (Federal Bureau for Public Health) recommendations. The farm owner and the employees had to be tested for two objectives: (1) to search for a possible source of infection among the “care givers” of the infected horse (employees of the stable), since animal-to-animal transmission was highly unlikely, and (2) to search for subjects who could have been infected by the horse that had reportedly been coughing at least 2 days prior to death.

对18名员工进行胸片检查，未发现活动性肺结核的指征1）.一名瑞士患者发现了一个肺结节，医生对其进行了进一步的检查，然后推定为肿瘤性质。这17个人接受了T-SPOT测试。结核病一个ssay, 12 results were negative, 4 were positive, and one was indeterminate (twice). Among the 4 IGRA-positive subjects, two originated from countries with moderate incidence of TB (Bosnia and Turkey). According to the history interview records, all 4 had definite or probable previous exposures to TB, as well as variable periods of recent direct or indirect contact with the infected horse. Treatment for LTBI was proposed to all patients with a positive IGRA result (one person refused treatment). To date, none of the tested employees has developed any signs of active TB.

3.6。人畜共患的方面

相比牛分枝杆菌已知会影响很多自然宿主，易感性结核分枝杆菌在许多哺乳动物物种中仍然没有很好的定义[1，2，4包括马和其他可能接触到本研究指示病例的动物(羊驼、驴、山羊、绵羊和狗)。由于在该农场的6种剩余动物中没有发现任何感染迹象，马结核病病例似乎不太可能是由动物间的传播引起的结核分枝杆菌．此外，因为孤立是结核分枝杆菌,而不是牛分枝杆菌，人们可以推测马的感染来自于一个人的活动性结核病病例，但不一定来自于任何IGRA结果呈阳性的雇员。此外，也不能排除在后续调查中在某些人员身上发现的LTBI可能是由于接触了该物质结核分枝杆菌脱落的马。据报道，IGRA阳性的受试者过去曾暴露于结核病，但没有更早的常规检测(TST或IGRA)记录来确定他们先前的感染状况。因此，起源结核分枝杆菌本文描述的马的感染仍然未知。

4.结论

一种罕见的肺结核病例结核分枝杆菌是在一匹马身上发现的。根据临床评价结果，未怀疑该动物患有结核病。然而，尸检的病理和分子方法导致诊断肺部疾病引起的结核分枝杆菌．对马进行死前结核病检测仍然具有挑战性，因为TST等传统方法尚未对这一物种进行验证。抗体对结核分枝杆菌在受感染的马身上发现了抗原，但在没有患病迹象的暴露动物身上却没有。对负责照顾这些动物的人员进行的随访测试显示，这些受试者中有4例igra阳性结果表明LTBI。这些发现表明，有可能是种间传播结核分枝杆菌,虽然感染源尚不清楚。

承认

作者感谢Claudia Quinn在血清学检测方面的技术帮助。

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